24.10.2012
Ogrodnictwo, sem.III, gr.3
SPRAWOZDANIE nr 2
Fotometryczne oznaczanie zawartości białka
Cel: Celem ćwiczenia było zapoznanie się z zasadami, na których oparte są metody oznaczania białka związane z charakterystycznymi cechami jego budowy jak: obecność reszt aminokwasów aromatycznych, zasadowych oraz występowanie wiązań peptydowych. Cele było także sporządzenie krzywej wzorcowej.
Metoda Lowry’ego i współpracowników jest kolorymetryczną metodą oznaczania zawartości białka, w której wykorzystuje się obecność wiązań peptydowych i aminokwasów aromatycznych. Metoda składa się z dwóch etapów: w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa, w drugim etapie jony miedzi katalizują reakcję utlenienia, redukując odczynnik Folina – Ciocalteu. Stężenie białka odczytuje się z krzywej wzorcowej.
Do probówek odmierzyliśmy 0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml białka o stężeniu 200µg/ml. Do próby materiałowej odmierzyliśmy 0,5 ml wody. Próby wykonaliśmy w dwóch powtórzeniach. Następnie roztwory uzupełniliśmy wodą destylowaną do objętości 0,5 ml i dodaliśmy 2,5 ml odczynnika miedziowego i wymieszaliśmy. Po 10 minutach dodaliśmy 0,25 ml odczynnika Folina – Ciocalteu i wymieszaliśmy. Po 30 minutach zmierzyliśmy intensywność zabarwienia przy 750nm.
| L.p | Białko [ml] | Białko [µg] | Absorbancja próba I |
Absorbancja próba II |
Średnia absorbancji |
|---|---|---|---|---|---|
| 0. | 0,5 ml wody | Próba zerowa | 0 | 0 | 0 |
| 1. | 0,1 | 20 | 0,088 | 0,125 | 0,1065 |
| 2. | 0,2 | 40 | 0,174 | 0,185 | 0,1795 |
| 3. | 0,3 | 60 | 0,264 | 0,278 | 0,271 |
| 4. | 0,4 | 80 | 0,363 | 0,363 | 0,363 |
Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji wykreśliliśmy krzywą wzorcową.
Następnie do roztworu białka otrzymanego w kolbce miarowej dodaliśmy wody destylowanej i wymieszaliśmy. Do trzech probówek odmierzyliśmy po 0,5 ml roztworu białka, a do czwartej 0,5 ml wody destylowanej.
| Absorbancja 1 | Absorbancja 2 | Absorbancja 2 | Średnia absorbancji | Ilość białka w µg odczytana z krzywej wzorcowej dla średniej absorbancji |
|---|---|---|---|---|
| 0,161 | 0,165 | 0,158 | 0,161 | 35 |
Ilość białka w 0,5 ml roztworu białka – 35 µg
0,5 ml – 35 µg
10 ml – x [µg]
x=700 µg
700 µg – 1,5 ml
x – 1000 ml
x = 466666,67 µg = 466,67 mg
550 mg – 100%
466,67 mg – x
x = 93,3%
Preparat albumin zawiera 93,9% czystego składnika.
Krzywa wzorcowa opisująca zależność absorbancji od ilości białka