1. Cel ćwiczenia

Rozdział białek na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-75.

Wyznaczenie dostępnych współczynników podziału K_av dla badanych białek.

Wykreślenie profilu elucji dla przeprowadzonego procesu chromatografii żelowej.

Przygotowanie próbek do elektroforezy żelowej.

1. Wstęp teoretyczny

Chromatografia żelowa jest jedną z form cieczowej chromatografii, w której substancje są rozdzielane w zależności od wielkości ich cząsteczek. Żel zbudowany jest z porowatych granulek. Do wnętrza każdej granulki może swobodnie wchodzić rozpuszczalnik. Podczas przechodzenia cząsteczek substancji rozpuszczonych przez kolumnę mniejsze cząsteczki dyfundują do wnętrza porowatych granulek żelu, a duże cząsteczki w ogóle nie wnikają do wnętrza granulek i spływają z frontem rozpuszczalnika w dół kolumny. W efekcie małe cząstki będą zatrzymywane na kolumnie w stopniu zależnym od ich zdolności dyfuzji do wnętrza żelu. Zbierane frakcje badane są w celu stwierdzenia kolejności wymywania poszczególnych składników z kolumny.

Wielkością charakteryzującą cząsteczkę w chromatografii żelowej jest objętość elucji. Jest to objętość rozpuszczalnika niezbędna do przeniesienia danej substancji przez kolumnę wypełnioną żelem aż do pojawienia się jej maksymalnego stężenia w eluacie opuszczającym kolumnę.

1. Materiały

• Odczynniki

• bufor (20 mM TRIS-HCl, 0.1 M NaCl) o pH 7.5 – eluent

• próbka – roztwór Blue Dextranu (stężenie końcowe w próbce – 2 mg/ml), roztwór mieszaniny białek owoalbuminy i lizozymu (5 mg/ml)

• złoże Sephadex G-75 zawieszone w buforze ( 20 mM TRIS-HCl, 0.1 M NaCl) o pH 7.5

• 2x stężony bufor do nanoszenia próbek na PAGE (124 mM Tris-HCl, 4% SDS (w/v), 10% (v/v) β-merkaptoetanol, 20% (v/v) glicerol, 0.005 (w/v) błękit bromofenolowy, pH 6.8)

• Szkło i aparatura

• kolumna chromatograficzna

• probówki pomiarowe do spektrofotometru Specol

• 2 cylindry miarowe o pojemności 5 ml

• Cylinder miarowy o pojemności 10 ml

• Zlewki i kolby o pojemności 250 i 500 ml

• Bagietka

• Tryskawka

• Pipety automatyczne oraz końcówki

• Specol

• Spektrofotometr UV

1. Przebieg ćwiczenia

1. Wyznaczanie objętości zerowej kolumny

• Przygotowaliśmy próbówki szklane, do których zbieraliśmy frakcje z kolumny.

• Ustawiliśmy przepływ kolumny na ok. 1 ml/min za pomocą zaworu znajdującego się u dołu kolumny. Jednocześnie przepłukaliśmy upakowane złoże eluentem i sprawdziliśmy szczelność układu.

• Zamknęliśmy wypływ kolumny za pomocą nasadki na końcówkę wężyka, odłączyliśmy kolumnę od naczynia z eluentem i zebraliśmy pipetą warstwę eluentu znad krążka ułożonego na upakowanym złożu

• Z otrzymanej próbki Blue Dextranu pobraliśmy 0.5 ml roztworu i nanieśliśmy na krążek za pomocą pipety. Otworzyliśmy wypływ kolumny na czas wniknięcia próbki do wierzchniej warstwy żelu i ponownie zamknęliśmy wypływ kolumny

• Na złoże nanieśliśmy za pomocą pipety 2 cm warstwę eluentu.

• Podłączyliśmy naczynie z eluentem do kolumny, a wężyk wypływu kolumny umieściliśmy w cylindrze miarowym o pojemności 10 ml.

• Otworzyliśmy wypływ kolumny i zbieraliśmy eluent do cylindra do momentu przeniknięcia barwnego składnika próbki do dna cylindra.

• Objętość frakcji bezbarwnej wyniosła 9.4 ml

• Zebraną frakcję bezbarwną przenieśliśmy do probówki 1

• Przełożyliśmy wężyk do cylinderka o objętości 5 ml i rozpoczęliśmy zbieranie barwnych frakcji o pojemności 1 ml

• Zbieranie przesączu z kolumny kontynuowaliśmy do pobrania ostatniej barwnej frakcji.

• Zebraliśmy łącznie 7 barwnych frakcji, każda o pojemności 1 ml.

• Po pobraniu ostatniej frakcji barwnej przełożyliśmy wężyk do zlewki w celu wypłukania ze złoża ewentualnych resztek próbki (15 min)

• Zmierzyliśmy absorbancję wszystkich zebranych frakcji przy długości 620 nm względem czystego eluentu jako odnośnika.

1. Frakcjonowanie mieszaniny białek

• Zamknęliśmy wypływ kolumny za pomocą nasadki na końcówkę wężyka, odłączyliśmy kolumnę od naczynia z eluentem, wężyk wypływu kolumny umieściliśmy w cylindrze miarowym o pojemności 10 ml

• Zebraliśmy pipetą warstwę eluentu znad krążka ułożonego na upakowanym złożu

• Z otrzymanej próbki mieszaniny białek, pobraliśmy 0.5 ml roztworu i nanieśliśmy na krążek za pomocą pipety

• Otworzyliśmy wypływ kolumny na czas wniknięcia próbki do wierzchniej warstwy żelu i ponownie zamknęliśmy wypływ kolumny

• Na złoże nanieśliśmy 2 cm warstwę eluentu. Podłączyliśmy naczynie z eluentem do kolumny.

• Otworzyliśmy wypływ kolumny i zbieraliśmy eluent do cylindra do uzyskania objętości 6 ml.

• Zebraną frakcję przenieśliśmy do probówki 1

• Przełożyliśmy wężyk do cylinderka o pojemności 5 ml i rozpoczęliśmy zbieranie frakcji białek o objętości 1 ml

• Frakcjonowanie kontynuowaliśmy do momentu uzyskania objętości elucji równej Vt kolumny.

• Po pobraniu ostatniej frakcji przełożyliśmy wężyk do zlewki w celu wypłukania ze złoża ewentualnych resztek próbki (15 min)

• Zmierzyliśmy absorbancję otrzymanych frakcji przy długości fali 280 nm względem czystego eluentu jako odnośnika

1. Przygotowanie próbek do analizy elektroforetycznej

• Wykonaliśmy wykres absorbancji w funkcji objętości elucji. Z wykonanego wykresu wytypowaliśmy 7 frakcji celem analizy za pomocą techniki elektroforezy żelowej w warunkach denaturujących

• Z wytypowanych frakcji pobraliśmy po 20μl próbki i przenieśliśmy do probówki typu ependorf czytelnie podpisanej

• Do każdej próbki dodaliśmy po 20μl buforu do nanoszenia próbek 2XSB

• Przygotowane próbki zamroziliśmy do czasu wykonywania ćwiczenia „O”

1. Wyniki i obliczenia

Objętość zerowa kolumny V₀ = 9.4 ml + 1.0ml + 1.0 ml = 11.4 ml

Objętość elucji Blue Dextranu = 11.4 ml

Wymiary kolumny:

Długość kolumny – 24,5 cm

r = 0.8 cm

V_t = π * 0.8² * 24.5 = 49.26 cm³

Nr. frakcji	VB.D. [ml]	VM.B. [ml]	A620	A280
1	9.4	-	0.000	-
2	10.4	-	0.001	-
3	11.4	-	0.420	-
4	12.4	-	0.397	-
5	13.4	-	0.089	-
6	14.4	-	0.047	-
7	15.4	-	0.014	-
8	16.4	-	0.005	-
9	-	6.4	-	0.000
10	-	7.4	-	0.017
11	-	8.4	-	0.018
12	-	9.4	-	0.012
13	-	10.4	-	0.010
14	-	11.4	-	0.076
15	-	12.4	-	0.329
16	-	13.4	-	0.253
17	-	14.4	-	0.252
18	-	15.5	-	0.179
19	-	16.4	-	0.105
20	-	17.4	-	0.068
21	-	18.4	-	0.051
22	-	19.4	-	0.031
23	-	20.4	-	0.025
24	-	21.4	-	0.025
25	-	22.4	-	0.042
26	-	23.4	-	0.103
27	-	24.4	-	0.233
28	-	25.4	-	0.432
29	-	26.4	-	0.584
30	-	27.4	-	0.685
31	-	28.4	-	0.759
32	-	29.4	-	0.714
33	-	30.4	-	0.611
34	-	31.4	-	0.477
35	-	32.4	-	0.348
36	-	33.4	-	0.241
37	-	34.4	-	0.160
38	-	35.4	-	0.112
39	-	36.4	-	0.072
40	-	37.4	-	0.060
41	-	38.4	-	0.047
42	-	39.4	-	0.038
43	-	40.4	-	0.033
44	-	41.4	-	0.031
45	-	42.4	-	0.026
46	-	43.4	-	0.026
47	-	44.4	-	0.025
48	-	45.4	-	0.021
49	-	46.4	-	0.020

Tabela 1.

V_B.D. – Objętość Blue Dextranu

V_M.B – Objętość mieszaniny białek

Objętość elucji I – V_e1 = 12.4 ml

Objętość elucji II – V_e2 = 28.4 ml

$K_{\text{av\ I}} = \frac{V_{\text{e\ I}} - V_{0}}{V_{t} - V_{0}}$ = $\frac{12.4\ ml - 11.4\ ml}{49.26\ ml - 11.4\ ml}$ = 0.0264

$K_{\text{av\ II}} = \frac{V_{\text{e\ II}} - V_{0}}{V_{t} - V_{0}}$= $\frac{28.4\ ml - 11.4\ ml}{49.26\ ml - 11.4\ ml\ }$= 0.449

Wykres 1.

1. Wnioski

W wyniku przeprowadzonego doświadczenia otrzymaliśmy następujący rozkład mieszaniny białek: jako pierwszy wypłynął cięższy związek - BSA (K_av = 0.0264). Jego masa cząsteczkowa wynosi 66.63 kDa, wobec czego jest najcięższym białkiem w mieszaninie. Następnie wypłynął lizozym (K_av = 0.449), którego masa cząsteczkowa jest mniejsza od masy BSA, gdyż wynosi 14.4 kDa. Porównując dane, które uzyskaliśmy z danymi literaturowymi możemy stwierdzić, że współczynnik podziału dla BSA wyszedł poprawnie, natomiast współczynniki podziałów dla lizozymu różnią się znacznie, co może świadczyć o błędzie przy pobieraniu frakcji, lub błędzie związanym z mierzoną absorbancją. Podczas pobierania kolejnych frakcji Blue Dextranu zaobserwowaliśmy zmianę zabarwienia z początkowego niebieskiego, poprzez błękitny, aż do uzyskania barwy buforu. Dla Blue Dextranu nie oblicza się dostępnego współczynnika podziału, ponieważ cząsteczki barwnika w ogóle nie wnikają w pory żelu, wobec czego przyjmujemy, że objętość elucji jest równa objętości zerowej kolumny.

1. Literatura

1. M. A. Torres; M. M. Beppu*; C. C. Santana; Braz. J. Chem. Eng. vol.24 no.3 São Paulo July/Sept. 2007 ; “Characterization of chemically modified chitosan microspheres as adsorbents using standard Proteins (bovine serum albumin and lysozyme)” ; Tabela 3.