Laboratorium biochemii

Kinetyka enzymatyczna I (ćw. A)

1. Cel ćwiczenia

• Wyznaczenie podstawowych parametrów kinetycznych dla kwaśnej fosfatazy poprzez pomiar ilości powstałego produktu,

• Ustalenie czy kwaśna fosfataza stosuje się do kinetyki Michaelis’a-Menten,

• Obliczenie stałej Michaelis’a, szybkości maksymalnej oraz stałej szybkości reakcji.

1. Odczynniki

• 0.25 M bufor octanowy o pH. 5.0

• 0.5 M wodorotlenek sodu

• 5 mM roztwór standardowy p-nitrofenolu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

• 5 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

• Roztwór fosfatazy kwaśnej z ziemniaka w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0,

C_e° = 0.08 mg/ml

1. Szkło i aparatura

• probówki chemiczne

• kolba ad 10 ml

• pipety automatyczne oraz tipsy

• kuwety

• Specol

• termostat nastawiony na 37°C

1. Wykonanie ćwiczenia

1. Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu:

1. Do 21 probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 1:

• 0.25 M buforu octanowego o pH 5.0

• 5.0 mM p-nitrofenylofosforan,

1. Roztwory inkubowano przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37°C,

2. Po czasie inkubacji do nieprimowanych probówek dodano roztwór fosfatazy,

3. Próby 1-11 inkubowano w 37°C przez 25 min.,

4. Po upływie czasu do wszystkich próbek dodano po 2 ml 0.5M roztworu NaOH,

5. Zmierzono absorbancję roztworów przy λ=410 nm względem próby 11.

1. Krzywa standardowa

1. Otrzymany roztwór p-nitrofenolu rozcieńczono 50-krotnie w kolbie miarowej o pojemności 10 ml. Otrzymany roztwór dokładnie wymieszano i przelano do

probówki „P”,

1. Do 8 suchych probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 2. :

• 0.25 M bufor octanowy o pH 5.0,

• 0.1mM p-nitrofenol,

• 0.5 M NaOH

1. Zmierzono absorbancję przy λ=410 nm dla sporządzonych roztworów wobec odnośnika – próbki 8.

1. Obliczenia i wyniki

Nr próbki	V buforu [ml]	V substratu [ml]	V enzymu [ml]	V NaOH [ml]	A410	Δ A410 /kor/
1	1,75	0,05	0,10	2,00	0,020	0,018
1'	1,85	0,05	0,00	2,00	0,002
2	1,70	0,10	0,10	2,00	0,033	0,028
2'	1,80	0,10	0,00	2,00	0,005
3	1,65	0,15	0,10	2,00	0,042	0,037
3'	1,75	0,15	0,00	2,00	0,005
4	1,60	0,20	0,10	2,00	0,054	0,048
4'	1,70	0,20	0,00	2,00	0,006
5	1,50	0,30	0,10	2,00	0,070	0,059
5'	1,60	0,30	0,00	2,00	0,011
6	1,35	0,45	0,10	2,00	0,084	0,069
6'	1,45	0,45	0,00	2,00	0,015
7	1,20	0,60	0,10	2,00	0,115	0,101
7'	1,30	0,60	0,00	2,00	0,014
8	1,05	0,75	0,10	2,00	0,127	0,110
8'	1,15	0,75	0,00	2,00	0,017
9	0,80	1,00	0,10	2,00	0,193	0,169
9'	0,90	1,00	0,00	2,00	0,024
10	0,50	1,30	0,10	2,00	0,167	0,137
10'	0,60	1,30	0,00	2,00	0,030
11	1,80	0,00	0,10	2,00	odnośnik	---

Tabela 1.

Nr próbki	V buforu [ml]	V p-nitrofenolu [ml]	n p-nitrofenolu [μmol]	V NaOH [ml]	A410
1	1,70	0,20	0,02	2,00	0,107
2	1,50	0,40	0,04	2,00	0,221
3	1,30	0,60	0,06	2,00	0,325
4	1,10	0,80	0,08	2,00	0,423
5	0,90	1,00	0,10	2,00	0,541
6	0,70	1,20	0,12	2,00	0,627
7	0,50	1,40	0,14	2,00	0,737
8	1,90	0,00	0,00	2,00	odnośnik

Tabela 2.

• Obliczanie liczności p-nitrofenolu w roztworze początkowym:

n =  C_p⁰ • V_p⁰ = 0, 005 • 0, 002 = 1∙10^-6 [mola]

• Obliczanie stężenia p-nitrofenolu po rozcieńczeniu (C_p^k [M]):

$$C_{p}^{k} = \frac{n}{V_{p}^{k}} = \ \frac{1 \bullet 10^{- 6}}{0,0001} = 0,001\ \left\lbrack M \right\rbrack$$

• Obliczenie liczności p-nitrofenolu w próbkach (obliczenia dla próbki 1., pozostałe analogicznie):

n_{p − nitrofenolu} =  C_p^k • V_{p − nitrofenolu} = 0, 001 • 0, 2 = 0, 02 [μmoli]

Wykres 1.

Krzywa standardowa

• Obliczanie masy fosfatazy w mieszaninie reakcyjnej:

$m_{e} = \frac{C_{E}^{0} \bullet V_{e}}{V_{r}}$ , gdzie: V_r – objętość mieszaniny reakcyjnej =1.9 ml

C_E⁰ − stezenie wyjsiowe fosfatazy = 0.08 $\frac{\text{mg}}{\text{ml}}$

V_e −  objetosc dodanego enzymu = 0.1 ml

$m_{e} = \frac{C_{E}^{0} \bullet V_{e}}{V_{r}}$ = $\frac{0,08 \bullet 0,1}{1,9} = 0,00421\ \lbrack mg\rbrack$

Nr próbki	Δ A410 /kor/	[S] μM	1/[S] [dm^3/μmol]	np^t [μmol]	Vc [μmol/min ml]	1/Vc [min ml/μmol]
1	0,018	131,6	0,00760	0,0034	0,0323	30,994
2	0,028	263,2	0,00380	0,0053	0,0502	19,925
3	0,037	394,7	0,00253	0,0070	0,0663	15,078
4	0,048	526,3	0,00190	0,0091	0,0860	11,623
5	0,059	789,5	0,00127	0,0111	0,1058	9,456
6	0,069	1184,2	0,00084	0,0130	0,1237	8,085
7	0,101	1578,9	0,00063	0,0191	0,1810	5,524
8	0,110	1973,7	0,00051	0,0208	0,1972	5,072
9	0,169	2631,6	0,00038	0,0319	0,3029	3,301
10	0,137	3421,1	0,00029	0,0258	0,2456	4,072

• Tabela 3.

• Obliczanie stężenia substratu (p-nitrofenolu) w mieszaninie reakcyjnej (obliczenia dla próbki 1., pozostałe próbki analogicznie):

$$\left\lbrack S \right\rbrack = \ \frac{C_{p}^{0} \bullet \ V_{\text{substratu}}}{V_{r}} = \ \frac{0,005 \bullet 0,00005}{0,0019} = 131,6\ \lbrack\mu M\rbrack$$

• Obliczanie odwrotności stężenia substratu (obliczenia dla próbki 1., pozostałe próbki analogicznie):

$$\frac{1}{\lbrack S\rbrack} = \frac{1}{131,6} = 0,0076\ \lbrack\frac{\text{dm}^{3}}{\text{μmol}}\rbrack$$

• Obliczanie wartości absorbancji (obliczenia dla próbki 1., pozostałe próbki analogicznie):

A_410 /kor/ = A₄₁₀ – A₄₁₀’ = 0,020-0,002=0,018

• Obliczanie liczności p-nitrofenolu powstałego w reakcji enzymatycznej (n_p^t) w oparciu o krzywą standardową (obliczenia dla próbki 1., pozostałe próbki analogicznie):

Równanie krzywej standardowej: ΔA_{410 /kor/} = 5,3 ∙ n_p^t ↔ $n_{p}^{t} = \frac{0,018}{5,3} = 0,0034\ \lbrack\mu mola\rbrack$

• Wykres 2. - Wykres zależności V_c = f([S])

Z powyższego wykresu odrzucamy wyniki odbiegające od trendu - próbki 6 i 9. Po odrzuceniu otrzymujemy Wykres 3. z R = 0,935.

Wykres 3. - Wykres zależności V_c = f([S]), uwzględniający odrzucone punkty.

• Wykres 4. – Lineweavera – Burka $\frac{1}{V_{c}} = f(\frac{1}{\left\lbrack S \right\rbrack})$

Ponownie odrzucamy błędne pomiary jakimi są próbki 6 i 9. Po odrzuceniu otrzymujemy Wykres 5. z R = 0,981.

• Wykres 5. - Lineweavera – Burka $\frac{1}{V_{c}} = f(\frac{1}{\left\lbrack S \right\rbrack})$, uwzględniający odrzucone punkty.

Równanie wykresu : $\frac{1}{V_{c}} = 3724 \bullet \frac{1}{\lbrack S\rbrack} + 4,090$

• Obliczanie stałej Michaelisa (K_m), szybkości maksymalnej (V_max):

V = $\frac{Vmax*\lbrack S\rbrack}{Km + \lbrack S\rbrack}$ stąd: 1/V = $\frac{Km + \lbrack S\rbrack}{Vmax*\lbrack S\rbrack}$ ↔ 1/V = $\frac{\text{Km}}{Vmax*\lbrack S\rbrack}$+ $\frac{1}{\text{Vmax}}$

$$\frac{1}{V_{c}} = 3724 \bullet \frac{1}{\lbrack S\rbrack} + 4,090$$

$$V_{\max} = \ \frac{1}{4,090} = 0,244\ \lbrack\frac{\text{μmol}}{min \bullet ml}\rbrack$$

$$K_{m} = \ \frac{3724}{0,244} = 15262,3\ \lbrack\mu M\rbrack$$

1. Analiza wyników i wnioski

• Przeprowadzone doświadczenie pozwoliło na wyznaczenie V_max oraz K_m w reakcji hydrolizy p-nitrofenylofosforanu katalizowanej przez kwaśną fosfatazę,

• Kwaśna fosfataza jest enzymem spełniającym założenia kinetyki Michaelisa-Menten, ponieważ szybkość reakcji osiąga maksimum po całkowitym wysyceniu substratem, co pokazane jest na wykresach 3 i 5,

• Wykres 3 pokazuje, że szybkość katalizowanej reakcji zależy nieliniowo od stężenia substratu,

• Wszystkie cele doświadczenia zostały zrealizowane.