Brudniak Aleksandra
25.11.2015
Ochrona Środowiska, rok III
ENZYMOLOGIA
Ćwiczenie 1.
WYZNACZANIE PARAMETRÓW KINETYCZNYCH PEROKSYDAZY.
Opis ćwiczenia: Roztwory wyjściowe: bufor ( fosforanowy 100mM o Ph=6), roztwór H202 3% ,
roztwór pirogallolu w buforze 0,5%,roztwór POX w buforze 0,1 mg/ml.
Wykonanie: Początkowo przygotowano dwa roztwory robocze.
-roztwór H2O2 - przygotowano rozcieńczenia w buforze: 500 ppm,250ppm, 125ppm 62,5ppm.
- rozcieńczono pięciokrotnie roztwór POX w buforze fosforanowym.
Doświadczenie polegało na wyznaczeniu parametrów kinetycznych peroksydazy. Pierwszym krokiem było umieszczenie w kuwecie spektrofotometrycznej kolejno 100 µl buforu, 100 µl roztworu pirogallolu, 5 µl POX i 700 µl wody destylowanej. Potem kuwetę umiesczono w spektrofotometrze, wcześniej ustawiając długość fali na 420 nm. Do kuwety szybko dodano roztwór wody destylowanej i w tym samym czasie rozpoczęto pomiar czasu. Zanotowano wyniki.
ZESTAWIENIE OTRZYMANYCH WYNIKÓW
Dla stężenia 500 ppm
ABSORBANCJA |
||||
CZAS |
POMIAR 1 |
POMIAR 2 |
POMIAR 3 |
ŚREDNIA |
10 |
0,098 |
0,053 |
0,060 |
0,070 |
20 |
0,191 |
0,122 |
0,133 |
0,149 |
30 |
0,301 |
0,214 |
0,243 |
0,253 |
40 |
0,401 |
0,316 |
0,360 |
0,359 |
50 |
0,505 |
0,428 |
0,493 |
0,475 |
60 |
0,598 |
0,523 |
0,604 |
0,575 |
70 |
0,677 |
0,610 |
0,700 |
0,662 |
80 |
0,751 |
0,689 |
0,792 |
0,744 |
90 |
0,815 |
0,758 |
0,871 |
0,815 |
100 |
0,856 |
0,818 |
0,939 |
0,871 |
110 |
0,909 |
0,874 |
1,001 |
0,928 |
120 |
0,948 |
0,921 |
1,052 |
0,974 |
|
|
|
|
0,573 |
Tabela 1. Wyniki doświadczenia dla roztworu o stężeniu 500 ppm.
Dla stężenia 250 ppm
ABSORBANCJA |
||||
CZAS |
POMIAR 1 |
POMIAR 2 |
POMIAR 3 |
ŚREDNIA |
10 |
0,100 |
0,053 |
0,063 |
0,072 |
20 |
0,171 |
0,109 |
0,124 |
0,135 |
30 |
0,246 |
0,183 |
0,200 |
0,210 |
40 |
0,317 |
0,258 |
0,278 |
0,284 |
50 |
0,378 |
0,327 |
0,348 |
0,351 |
60 |
0,439 |
0,389 |
0,413 |
0,414 |
70 |
0,484 |
0,446 |
0,472 |
0,467 |
80 |
0,523 |
0,491 |
0,525 |
0,513 |
90 |
0,567 |
0,536 |
0,571 |
0,558 |
100 |
0,588 |
0,571 |
0,608 |
0,589 |
110 |
0,620 |
0,603 |
0,654 |
0,626 |
120 |
0,639 |
0,631 |
0,681 |
0,650 |
|
|
|
|
0,406 |
Tabela2. Wyniki doświadczenia dla roztworu o stężeniu 250 ppm.
Dla stężenia 125 ppm
ABSORBANCJA
|
||||
CZAS |
POMIAR 1 |
POMIAR 2 |
POMIAR 3 |
ŚREDNIA |
10 |
0,047 |
0,072 |
0,057 |
0,059 |
20 |
0,091 |
0,121 |
0,099 |
0,104 |
30 |
0,142 |
0,168 |
0,152 |
0,154 |
40 |
0,195 |
0,211 |
0,201 |
0,202 |
50 |
0,243 |
0,250 |
0,248 |
0,247 |
60 |
0,285 |
0,282 |
0,288 |
0,285 |
70 |
0,318 |
0,310 |
0,325 |
0,318 |
80 |
0,353 |
0,335 |
0,356 |
0,348 |
90 |
0,379 |
0,356 |
0,384 |
0,373 |
100 |
0,403 |
0,373 |
0,406 |
0,394 |
110 |
0,425 |
0,392 |
0,426 |
0,414 |
120 |
0,444 |
0,401 |
0,446 |
0,430 |
|
|
|
|
0,277 |
Tabela 3. Wyniki doświadczenia dla roztworu o stężeniu 125 ppm.
Dla stężenia 62,5 ppm
ABSORBANCJA
|
||||
CZAS |
POMIAR 1 |
POMIAR 2 |
POMIAR 3 |
ŚREDNIA |
10 |
0,058 |
0,059 |
0,049 |
0,055 |
20 |
0,093 |
0,090 |
0,078 |
0,087 |
30 |
0,125 |
0,119 |
0,114 |
0,119 |
40 |
0,153 |
0,146 |
0,141 |
0,147 |
50 |
0,176 |
0,168 |
0,166 |
0,170 |
60 |
0,197 |
0,188 |
0,187 |
0,191 |
70 |
0,212 |
0,204 |
0,205 |
0,207 |
80 |
0,228 |
0,222 |
0,220 |
0,223 |
90 |
0,237 |
0,231 |
0,233 |
0,234 |
100 |
0,246 |
0,243 |
0,244 |
0,244 |
110 |
0,255 |
0,252 |
0,253 |
0,253 |
120 |
0,262 |
0,257 |
0,260 |
0,260 |
|
|
|
|
0,183 |
Tabela 4. Wyniki doświadczenia dla roztworu o stężeniu 62,5ppm.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Poniżej podano średnie ze średnich absorbancji :
Dla stężenia 500 ppm średnia jest równa 0,573
Dla stężenia 250 ppm średnia jest równai 0,406
Dla stężenia 125 ppm średnia jest równa 0,277
Dla stężenia 62,5 ppm średnia jest równa 0,183
Obliczono również średnią arytmetyczną ze średnich arytmetycznych absorbancji która wynosi 0,35975
Z otrzymanych danych sporządzono wykres, który przedstawia zależność średnich Absrobancji dla danego stężenia.
Aby wznaczyć stężenie produktu należało skorzystać z prawa Lamberta-Beera, które opisuje poniższy wzór. Prawo to mówi, że absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia c i grubości warstwy roztworu,przez który przechdzi promieniowanie.
A = ε · c · l
Przy czym: ε - współczynnik absorbancji milimolowej TG (ε = 26,6 mM-1 · cm-1),
A - absorbancja próby (posłużono się uśrednionymi absorbancjami z trzech prób)
c - stężenie próby (mM),
l - grubość kuwety (l = 1 cm)
Wyniki zebrano w tabeli poniżej:
62,5 |
125 |
250 |
500 |
|
||||
Asr |
C |
Asr |
C |
Asr |
C |
Asr |
C |
|
0,055 |
0,00208 |
0,059 |
0,00223 |
0,072 |
0,00273 |
0,07 |
0,00265 |
|
0,087 |
0,00330 |
0,104 |
0,00394 |
0,135 |
0,00511 |
0,149 |
0,00564 |
|
0,119 |
0,00451 |
0,154 |
0,00583 |
0,21 |
0,00795 |
0,253 |
0,00958 |
|
0,147 |
0,00557 |
0,202 |
0,00765 |
0,284 |
0,01076 |
0,359 |
0,01360 |
|
0,17 |
0,00644 |
0,247 |
0,00936 |
0,351 |
0,01330 |
0,475 |
0,01799 |
|
0,191 |
0,00723 |
0,285 |
0,01080 |
0,414 |
0,01568 |
0,575 |
0,02178 |
|
0,207 |
0,00784 |
0,318 |
0,01205 |
0,467 |
0,01769 |
0,662 |
0,02508 |
|
0,223 |
0,00845 |
0,348 |
0,01318 |
0,513 |
0,01943 |
0,744 |
0,02818 |
|
0,234 |
0,00886 |
0,373 |
0,01413 |
0,558 |
0,02114 |
0,815 |
0,03087 |
|
0,244 |
0,00924 |
0,394 |
0,01492 |
0,589 |
0,02231 |
0,871 |
0,03299 |
|
0,253 |
0,00958 |
0,414 |
0,01568 |
0,626 |
0,02371 |
0,928 |
0,03515 |
|
0,26 |
0,00985 |
0,43 |
0,01629 |
0,65 |
0,02462 |
0,974 |
0,03689 |
|
Wykres 1.
Wykres 2.
Wykres 3.
Wykres 4.
Następnym kroekim było wyznaczenie prędkości V0. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli.
Stężenie ppm |
Vo |
500 |
0,000300 |
250 |
0,000200 |
125 |
0,000100 |
62,5 |
0,0000005 |
Na podstawie otrzymanych danych sporządzono wykres zależności odwrotności stężenia H2O2 od odwrotności prędkości reakcji enzymatycznej dzięki któremu można wyznaczyć parametr Vmax
oraz Km.
Oznaczono parametry Vmax , Km:
y = 787785x+2246,4
0=787785x+2246,4
x =-0,00285
x =-1/Km
Km= 350,88
y =1/Vmax
Vmax= 0,000445 [mol/s]
Ćwiczenie 2.
Badanie specyficzności substratowej enzymów inwertazy i amylazy.
Wykonanie
Przygotowano 4 probówki. W dwóch znajdowało się 1 ml 1% roztworu skrobii a w dwóch kolejnych 1 ml 1% roztworu sacharozy. Do pierwszych dwóch ( jedna z roztworem sacharozy, druga z roztworem skrobi) dodano po 100 ul roztworu amylazy a do dwóch kolejnych po tyle samo inwertazy. Wszystkie probówki odłożono do suszarki gdzie inkubowano je przez godzinę w temp. 37 ⁰C. Po wyciągnięciu z suszarki przeprowadzono reakcje Fehlinga. Najpierw zmieszano roztwory Fehling I i Fehling II, stosunek 1:1, następnie dodano tego odczynnika do każdej z probówek. Ostatnim krokiem było ogrzanie w łaźni wodnej.
Wyniki:
Wszystkie probówki zmieniły barwę na brunatno-czerwoną.
Wnioski:
Niestety podczas wykonywania tego doświadczenia doszło do błędu. Mogło być to spowodowane pomyłką w trakcie dodawania odczynników. Inwertaza powoduje rozkład sacharozy, a amylaza wykonuje działanie elektrolityczne w stosunku do skrobi. Roztwór skrobi zawierający inwertazę oraz roztwór sacharozy zawierający amylazę powinien zabarwić się na niebiesko. Probówka która zawierała skrobię wraz z amylazą powinna dać barwę pomarańczową, natomiast roztwór sacharozy zawierający inwertazę prawidłowo zabarwił się na brunatno- pomarańczowo.
Wyszukiwarka