Biochemia I Laboratorium

Ćwiczenie O

ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ BIAŁEK

Prowadzący:

Mgr inż. Agnieszka Szamborska

Data wykonania ćwiczenia: 17 maja 2008

Data wykonania sprawozdania: 24 maja 2008

Piątek 12:15

Justyna Budzicz 152049

Olga Mielczarek 153881

1. CEL ĆWIECZENIA

Przeprowadzenie elektroforetycznego rozdziały białek w żelu poliakrylamidowym.

2. PRZEBIEG ĆWICZENIA

1. Zmontowano aparat do elektroforezy.

2. Wlano bufor do elektroforezy do aparatu.

3. Tuż nad powierzchnię żelu poliakrylamidowego nałożono próbki:

1. 100μl buforu + 100μl fosfatazy kwaśniej

2. 100μl buforu + 100μl albuminy z jaj kurzych

4. Zamknięto pokrywę i włączono aparat. Ustawiono natężenie prądu ~ 3 mA, aby próbki wniknęły do żelu zagęszczającego.

5. Po ok. 20min., gdyy prążki próbek doszły do granicy żel zagęszczający - żel rozdzielający, zwiększono natężenie do ~ 5 mA.

6. Sprawdzono napięcie prądu (200-220 V).

7. Prowadzono elektroforezę aż czoło elektroforezy (barwnik dodany do próbki) osiągnie koniec żelu, ale z niego nie wyjdzie.

8. po 150 minutach zakończono elektroforezę.

9. Wykręcono rurki zawierające żel z rozdzielonymi białkami. Wypchnięto żel bagietką na szkiełko podstawowe.

10. Włożono żele do probówek żelem rozdzielającym do dołu i zalano barwnikiem Coomassie Blue. Następnie inkubowano w łaźni wodnej 55°C przez 15 minut w celu związania barwnika z białkami w żelu. Barwnik zlano z powrotem do butelki.

11. Zalano żele roztworem do odbarwiania (CH₃COOH + CH₃OH) i inkubowano w łaźni wodnej 55°C przez 15min. Barwienie i odbarwiania powtórzono.

12. Dwa razy w ciągu tygodnia (19 i 21 maja) wymieniono roztwór odbarwiający w probówkach z żelami.

13. Zrobiono zdjęcie żelu.

14. Odbarwione żele przeanalizowano pod kątem ilości, grubości i miejsc występowania prążków (pasm białkowych).

15. Zmierzono odległości:

1. Od początku żelu rozdzielającego (początek drogi elektroforetycznej) do środka każdego prążka (droga przebyta przed dane białko).

2. Od początku żelu rozdzielającego do czoła elektroforezy - droga przebyta przez barwnik (cała droga elektroforetyczna).

3. DANE LITERATUROWE

Dane dot. fosfatazy kwaśnej Masa cząsteczkowa: 38470 Da pI: 6.7 Charakter kwasowo zasadowy: lekko kwaśny (prawie obojętny)

Dane dot. albuminy z jaj kurzych Masa cząsteczkowa: 42792 Da pI: 4.6 Charakter kwasowo zasadowy: kwaśny

Rys. 1. Rys. 2.

Struktura fosfatazy kwaśnej Struktura albuminy z jaj kurzych

[źródło: www.pdb.org] [źródło: www.cbms.mq.edu.au]

Przewidywany wynik elektroforezy:

Zgodnie z danymi literaturowymi oczekiwano, że albumina z jaj kurzych, jako białko o większej masie cząsteczkowej i niższym pI, zawędruje w żelu bliżej niż fosfataza kwaśna, która ma większą masę i wyższe pI.

4. OBLICZENIA

ALBUMINA Z JAJ KURZYCH

CZOŁO

2,0 cm (albumina)

START

FOSFATAZA KWAŚNA

CZOŁO

4,4 cm (od startu do czoła) 3,3 cm (degradanty)

• Wartości Rf (retention factor) - ruchliwość elektroforetyczna

Rf = droga przebyta przez białko

droga przebyta przez wskaźnik

ALBUMINA Z JAJ KURZYCH

jest to albumina

jest to degradant lub zanieczyszczenie

FOSFATAZA KWAŚNA

jest to fosfataza oraz jej degradanty lub zanieczyszczenia

5. WYNIKI

Rf albuminy = 0,44

Rf fosfatazy = 0,625

6. WNIOSKI

• Cel został zrealizowany.

• W przypadku albuminy z jaj kurzych ładnie widać pojedynczy dość zbity ciemny prążek (miejsce gdzie się znajduje z żelu poliakrylamidowym po elektroforezie). Widać też lekko ciemny prążek dodatkowy, który może być degradantem

• W przypadku fosfatazy widać duży ciągły ciemny obszar mający 3,3 cm (od pojawienia się do czoła elektroforezy). Środek tego pasma przypada na 2,75 cm od startu, lecz jest to bardzo orientacyjne położenie fosfatazy, gdyż cały ten obszar zawiera najprawdopodobniej wiele degradantów fosfatazy lub zanieczyszczenia.

• Elektroforeza prowadzona była w warunkach natywnych (brak czynnika denaturującego SDS). Efektem tego jest, że przemieszczające się białka nie były denaturowane lecz w swojej naturalnej postaci. Miało to na celu uniknięcie otrzymania degradantów, które mogłyby zaburzać obraz elektroforezy.

• Oczekiwanym wynikiem był po jednym prążku dla albuminy i fosfatazy. Otrzymane wyniki potwierdzają oczekiwania jedynie w przypadku albuminy. Stwierdza się więc iż cel ćwiczenia został zrealizowany w połowie.

• Zgodnie z przewidywaniem albumina zawędrowała w żelu bliżej niż fosfataza.

9

5

2,9 cm (degradant)

START

2,75 cm (degradanty)

4,5 cm (od startu do czoła)

---