Strona 1 z 4
Sprawozdanie 6.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/17
Biochemia 1 (BTC3009l)
Ćwiczenie B
Łukasz Czok
laboratorium
Ustalenie typu hamowania oraz
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Grupa: IV
wyznaczenie stałej hamowania
Wstęp
Kataliza enzymatyczna zajmuje się badaniem zależności szybkości reakcji chemicznej od specyficzności enzymu do substratu (właściwie do stanu przejściowego) oraz ich stężeniami. Do opisu kinetyki enzymatycznej używa się modelu składającego się z szeregu reakcji: enzym oddziałuje z substratem; powstaje kompleks enzym-substrat; substrat jest przekształcany w produkt; końcowym etapem jest odszczepienie produktu od enzymu.
Uwolniony enzym może katalizować kolejną reakcję chemiczną.
Przyjmując założenia: nieodwracalność procesu (z produktów nie powstają substraty); stężenie początkowe enzymu jest dużo mniejsze niż początkowe stężenie substratu; nie zmienia się w czasie stężenie kompleksu enzym-substrat (przybliżenie stanu stacjonarnego).
Wtedy spełnione jest:
Równanie Michaelisa-Menten
·
(1)
gdzie:
oznacza stężenie substratu,
oznacza szybkość reakcji,
oznacza szybkość takiej reakcji, w której cały enzym jest związany z substratem,
oznacza takie stężenie substratu przy, którym szybkość reakcji osiąga połowę swojej szybkości maksymalnej, stała Michaelisa.
Inhibitory to substancje zmniejszające szybkość reakcji. Gdy wiąże się on na stałe z enzymem inhibicję nazywamy nieodwracalną. Rozważmy sytuację odwracalną, wtedy inhibitor może zarówno przyłączyć się jaki i odłączyć się od enzymu. Hamowanie nazywamy konkurencyjnym gdy inhibitor wiąże się w tym samym miejscu to substrat. Szybkość maksymalna nie ulega zmianie, natomiast rośnie stała Michaelisa, zgodnie ze wzorem:
I
1
(2)
gdzie:
oznacza stałą Michaelisa dla reakcji bez inhibitora,
oznacza stałą Michaelisa dla reakcji z inhibitorem,
oznacza stężenie inhibitora,
oznacza stałą hamowania, czyli stałą równowagi dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor.
Odmiennym typem jest inhibicja niekonkurencyjna. Wówczas inhibitor wiąże się z enzymem w innym miejscu niż substrat. Może powstać zarówno kompleks enzym-inhibitor jak i kompleks enzym-substrat-inhibitor. Kolejnym typem jest inhibicja antykonkurencyjna.
Inhibitor może wiązać się wyłącznie z kompleksem enzym-substrat. Wiele inhibitorów wykazuję jednak naturę pośrednią, zwaną inhibicją mieszaną.
Celem doświadczenia jest ustalenie typu hamowania reakcji enzymatycznej hydrolizy p-nitrofenylofosforanu oraz wyznaczanie stałej hamowania.
Strona 2 z 4
Sprawozdanie 6.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/17
Biochemia 1 (BTC3009l)
Ćwiczenie B
Łukasz Czok
laboratorium
Ustalenie typu hamowania oraz
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Grupa: IV
wyznaczenie stałej hamowania
Materiały
a) Odczynniki:
roztwór p-nitrofenylofosforanu – substrat,
roztwór fosfatazy w buforze – enzym,
roztwór inhibitora,
0,5 M wodorotlenek sodowy,
0,25 M bufor octanowy o pH 5,0.
b) Szkło laboratoryjne:
pipety: 0,2 ml (5 szt.), 1 ml (5 szt.), 2 ml (5 szt.), 5 ml (2 szt.),
pipety pełne 2 ml (3 szt.),
zlewki 100 ml i 400 ml,
probówki chemiczne (30 szt.).
c) Aparatura:
fotokolorymetr „Specol”; kuwety szklane do „Specola” (2 szt.),
statywy do probówek (2 szt.),
łaźnia wodna o temperaturze 37°C,
bibuła, lignina, tryskawka.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zgodnie z treścią instrukcji „B”.
1. Przygotowano 7 probówek dodając odpowiednie ilości buforu i substratu zgodnie z tabelą 1.
2. Inkubowano wstępnie probówki przez 5 minut w temperaturze 37°C.
3. Do probówek od 12 do 18 dodano 0,1 ml roztworu fosfatazy.
4. Inkubowano probówki przez 25 minut w temperaturze 37°C.
5. Dodano po 2 ml roztworu NaOH do każdej probówki.
6. Zmierzono absorpcję próbek dla fali długości 410 nm.
7. Przygotowano 11 probówek dodając odpowiednie ilości buforu, substratu i inhibitora zgodnie z tabelą 2.
8. Inkubowano wstępnie probówki przez 5 minut w temperaturze 37°C.
9. Do probówek od 1 do 11 dodano 0,1 ml roztworu fosfatazy.
10. Inkubowano probówki przez 25 minut w temperaturze 37°C.
11. Dodano po 2 ml roztworu NaOH do każdej probówki.
12. Zmierzono absorpcję próbek dla fali długości 410 nm.
Wyniki
Tabela 1. – Zawartość próbek bez inhibitora probówka
bufor
substrat enzym NaOH
A410
ΔA410
/nr/
/ml/
/ml/
/ml/
/ml/
/kor/
12
1,70
0,10
0,10
2,00
0,105
0,105
13
1,60
0,20
0,10
2,00
0,175
0,165
14
1,35
0,45
0,10
2,00
0,310
0,295
15
1,05
0,75
0,10
2,00
0,345
0,340
16
0,80
1,00
0,10
2,00
0,390
0,380
17
0,50
1,30
0,10
2,00
0,430
0,415
18
1,80
-
0,10
2,00
0,000
0,000
Czas reakcji wynosił 25 minut.
Strona 3 z 4
Sprawozdanie 6.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/17
Biochemia 1 (BTC3009l)
Ćwiczenie B
Łukasz Czok
laboratorium
Ustalenie typu hamowania oraz
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Grupa: IV
wyznaczenie stałej hamowania
Tabela 2. – Zawartość próbek z inhibitorem
probówka
bufor
substrat inhibitor
enzym
NaOH
A410
ΔA410
/nr/
/ml/
/ml/
/ml/
/ml/
/ml/
/kor/
1
1,65
0,05
0,10
0,10
2,00
0,055
0,055
2
1,60
0,10
0,10
0,10
2,00
0,090
0,090
3
1,55
0,15
0,10
0,10
2,00
0,125
0,115
4
1,50
0,20
0,10
0,10
2,00
0,185
0,175
5
1,40
0,30
0,10
0,10
2,00
0,220
0,210
6
1,25
0,45
0,10
0,10
2,00
0,275
0,260
7
1,10
0,60
0,10
0,10
2,00
0,325
0,325
8
0,95
0,75
0,10
0,10
2,00
0,385
0,380
9
0,70
1,00
0,10
0,10
2,00
0,440
0,430
10
0,40
1,30
0,10
0,10
2,00
0,490
0,475
11
1,70
-
0,10
0,10
2,00
0,000
0,000
Czas reakcji wynosił 25 minut.
Tabela 3. – Obliczenia dla mieszanin reakcyjnych w probówkach Objętość jednej próbki:
1,90 ml
Stężenie p-nitrofenylofosforanu: 5 mM
Stężenie podstawowe fosfatazy: 0,08 mg ml
Stężenie fosfatazy (enzymu) w mieszaninie reakcyjnej:
0,08 mg
·
ml · 0,10 ml
1,90 ml
4,21 · 10#$ mg
ml
Stężenie podstawowe inhibitora: 5 mM
Stężenie inhibitora w mieszaninie reakcyjnej:
5 mM · 0,10 ml
·
1,90 ml
0,26316 mM 263,16 µM
probówka ΔA410
S
1/S
I
v
vc
vsp
1/vsp
/nr/
/kor/
µM
1
µmol
µmol
µmol
mg · min
(
µM
µM)
(25 min) (1 min) (mg · min) ( µmol )
1
0,055
131,58 0,00760
263,16
0,0193
0,00077
0,0965
10,364
2
0,090
263,16 0,00380
263,16
0,0316
0,00126
0,1579
6,333
3
0,115
394,74 0,00253
263,16
0,0404
0,00161
0,2018
4,957
4
0,175
526,32 0,00190
263,16
0,0614
0,00246
0,3070
3,257
5
0,210
789,47 0,00127
263,16
0,0737
0,00295
0,3684
2,714
6
0,260
1184,21 0,00084
263,16
0,0912
0,00365
0,4561
2,192
7
0,325
1578,95 0,00063
263,16
0,1140
0,00456
0,5702
1,754
8
0,380
1973,68 0,00051
263,16
0,1333
0,00533
0,6667
1,500
9
0,430
2631,58 0,00038
263,16
0,1509
0,00604
0,7544
1,326
10
0,475
3421,05 0,00029
263,16
0,1667
0,00667
0,8333
1,200
12
0,105
263,16 0,00380
-
0,0368
0,00147
0,1842
5,429
13
0,165
526,32 0,00190
-
0,0579
0,00232
0,2895
3,455
14
0,295
1184,21 0,00084
-
0,1035
0,00414
0,5175
1,932
15
0,340
1973,68 0,00051
-
0,1193
0,00477
0,5965
1,676
16
0,380
2631,58 0,00038
-
0,1333
0,00533
0,6667
1,500
17
0,415
3421,05 0,00029
-
0,1456
0,00582
0,7281
1,373
Strona 4 z 4
Sprawozdanie 6.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/04/17
Biochemia 1 (BTC3009l)
Ćwiczenie B
Łukasz Czok
laboratorium
Ustalenie typu hamowania oraz
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Grupa: IV
wyznaczenie stałej hamowania
Wykres 1. – wykres Lineweavera-Burka dla reakcji z i bez inhibitora 12,00
(1/v ) = 1277,2 (1/[S]) + 1,0363
sp
10,00
8,00
(1/v ) = 1167,4 (1/[S]) + 1,0581
6,00
sp
1/vsp
4,00
2,00
0,00
-2,00
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
1/S
Przekształcając wzór (1):
1
1
1
·
- · - ·
Otrzymujemy:
Dla reakcji bez inhibitora (z wykresu 1.):
1
µmol
1,0581 0,945 (mg · min)
1167,4
1,0581 1103,3 µM
Dla reakcji z inhibitorem (z wykresu 1.):
1
µmol
1,0363 0,965 (mg · min)
1277,2
1,0363 1232,5 µM
Wnioski
Hamowanie jest typu konkurencyjnego. Praktycznie nie zmieniła się prędkość maksymalna
, natomiast znacznie zmieniła się stała Michaelisa.
Przekształcając wzór (2):
I
I
I
1 -
/ 1 - 01
2
0 / 1
2
Otrzymujemy stałą hamowania:
I
263,16 µM
01
2247,2 µM
2
34$4,5
0 / 1
2
336$,$ / 1