Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/04/24
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie H
Hydroliza enzymatyczna białka
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wstęp
Białka i peptydy są polimerami aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi.
Pod wpływem enzymów proteolitycznych ulegają hydrolizie do mniejszych peptydów
i aminokwasów. Egzopeptydazy (zwane peptydazami) to enzymy zdolne do odszczepiania
skrajnych aminokwasów łańcucha peptydowego, zazwyczaj z krótkich łańcuchów.
Endopeptydazy (zwane proteinazami) to enzymy zdolne do zerwania wiązania peptydowego
wewnątrz łańcucha.
Naturalnym źródłem enzymów proteolitycznych jest sok trzustkowy. Zawarta w nim
pankreatyna jest mieszaniną enzymów, m.in.: trypsyny, chymotrypsyny, elastazy,
karboksypeptydazy oraz ich proenzymów.
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie reakcji hydrolizy enzymatycznej białka przy obecności
inhibitora oraz bez inhibitora. Substratem jest kazeina. Mieszaniną enzymów jest
pankreatyna. Inhibitorem jest inhibitor sojowy, który działa odwracalnie. Hamuje aktywność
proteaz w sposób kompetencyjny, tzn. na zasadzie konkurencji z substratem o miejsce
aktywne enzymu.
Próbki inkubuje się w różnych czasach. Kwas trój chlorooctowy jest substancją przerywającą
reakcję
enzymatyczną.
Dodany
w
nadmiarze
powoduje także wytrącenie
się
niezhydrolizowanego nadmiaru kazeiny. Próbki trzeba odwirować aby oddzielić z nich osad.
Supernatant (klarowany roztwór znad osadu) posłuży do oznaczania stężenia produktu, który
jest miarą postępu reakcji. Osad wpłynąłby niekorzystnie na oznaczanie.
Drobnocząsteczkowe peptydy i aminokwasy oznacza się metodą Lowry’ego. Metoda jest
kombinacją
reakcji
biuretowej
i
reakcji
redukcji
odczynnika
fosfomolibdeno-
fosfowolframowego (odczynnika Folina-Ciocalteu). Zaletą reakcji jest jej duża czułość,
wykrywa nawet minimalne stężenie aminokwasów. Reakcja jest barwna. Metoda Lowry’ego
daje różne zabarwienia dla różnych analizowanych mieszanin białek, trzeba stosować wzorce.
Natężenie barwy rośnie ze wzrostem czasu inkubacji. Trzeba więc mierzyć absorbancje
próbek po dokładnie takim samym czasie inkubacji z odczynnikiem.
Materiały
a)
Odczynniki:
0,5% kazeina w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,8 – substrat,
0,1% pankreatyna – mieszanina enzymów proteolitycznych,
0,1% inhibitor sojowy,
5% kwas trójchlorooctowy (TCA),
0,1M bufor fosforanowy o pH 7,8;
odczynnik miedziowy A (2% Na
2
CO
3
w 0,1M NaOH),
odczynnik miedziowy B (0,5% CuSO
4
∙ 5H
2
O w 1% cytrynianie sodowym),
odczynnik Folina-Ciocalteu (10% NaWO
4
∙ 2H
2
O, 2,5% Na
2
Mo
4
∙ 2H
2
O, 4,25% H
3
PO
4
,
3,54% HCl , 15% Li
2
SO
4
, kropla bromu).
Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/04/24
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie H
Hydroliza enzymatyczna białka
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
b)
Szkło laboratoryjne:
probówki zwykłe (40 szt.),
probówki wirówkowe (20 szt.),
pipety miarowe: 1 ml; 2 ml; 5 ml,
cylinder miarowy 100 ml (1 szt.).
c)
Aparatura:
fotokolorymetr „Specol” (1 szt.),
kuwety szklane (2 szt.),
łaźnia wodna o temperaturze 37°C,
statyw na probówki (2 szt.),
stoper (1 szt.),
bibuła, tryskawka.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji „H”.
1.
Przygotowano 18 probówek: „E”, „E+I”, „P+W”, „P+I”, pozostałe ponumerowano od 1 do 14.
2.
Przygotowano 14 probówek wirówkowych, ponumerowano od 1 do 14.
3.
Do probówek wirówkowych dodano po 3 ml 5% TCA.
4.
Do probówek chemicznych E i E+I dodano po 7 ml 0,5% kazeiny oraz po 7 ml 0,1 buforu
fosforanowego o pH 7,8.
5.
Do probówki P+W dodano 2 ml 0,1% roztworu pankreatyny i 2 ml wody destylowanej.
6.
Do probówki P+I dodano 2 ml 0,1% roztworu pankreatyny i 2 ml 0,1% roztworu
inhibitora sojowego.
7.
Mieszaniny w probówkach: E, E+I, P+W i P+I inkubowano w łaźni wodnej w 37°C przez 5 minut.
8.
Przygotowano dwie pipety, podpisano: E i E+I. Przygotowano stoper.
9.
Zawartość probówki P+W przelano do probówki E, a zawartość probówki P+I do probówki
E+I. Włączono stoper.
10.
Wyjęto probówkę E, wymieszano zawartość, pobrano odpowiednią pipetą 2 ml mieszaniny
reakcyjnej, umieszczono ją w probówce wirówkowej nr 1, włożono probówkę E do łaźni.
11.
Wyjęto probówkę E+I, wymieszano zawartość, pobrano odpowiednią pipetą 2 ml mieszaniny
reakcyjnej, umieszczono ją w probówce wirówkowej nr 8, włożono probówkę E+I do łaźni.
12.
Powtórzono pkt. 10 i pkt. 11 z interwałem wynoszącym 7 minut przenosząc kolejne objętości
mieszanin reakcyjnych do następnych probówek wirówkowych.
13.
Inkubowano dodatkowo 7 minut w temperaturze pokojowej probówki wirówkowe.
Wyłączono stoper.
14.
Włożono probówki wirówkowe (od 1 do 14) oraz dodatkowe probówki przeciwwagowe
(wypełnione wodą) do wirówki. Wirowano przez 10 minut przy 5000 obr./min.
Czas mierzono stoperem.
15.
Zmieszano 100 ml odczynnika miedziowego A z 2 ml odczynnika miedziowego B. Wymieszano.
16.
Wyjęto probówki wirówkowe z wirówki.
17.
Przeniesiono po 2 ml supernatantu z probówek wirówkowych (od 1 do 14) do kolejnych
probówek chemicznych (od 1 do 14).
18.
Dodano po 5 ml roztworu z pkt. 15 do probówek chemicznych (od 1 do 14). Wymieszano.
19.
Inkubowano probówki chemiczne (od 1 do 14) w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
20.
Dodano po 0,5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu do probówek chemicznych (od 1 do 14).
Dokładnie wymieszano.
21.
Inkubowano probówki chemiczne (od 1 do 14) w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
22.
Zmierzono wartości absorbancji próbek przy fali długości 750 nm. Próbki od 2 do 7 wobec 1,
a próbki od 9 do 14 wobec 8. Odczytane wartości absorbancji umieszczono w tabeli 1.
Sprawozdanie 7.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/04/24
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie H
Hydroliza enzymatyczna białka
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wyniki
Tabela 1. – Wartości absorbancji próbek
Nr próby
Czas trwania
reakcji /min/
A
750
E
E+I
E
E+I
1
8
0
0,000
0,000
2
9
7
0,190
0,040
3
10
14
0,350
0,060
4
11
21
0,440
0,070
5
12
28
0,490
0,100
6
13
35
0,510
0,110
7
14
42
0,550
0,140
Wykres 1. – Zależność absorbancji od czasu reakcji
Legenda: ▲ E (próbka z enzymem bez inhibitora) E+I (próbka z enzymem i inhibitorem)
Wnioski
Zgodnie z wykresem 1. wartości absorbancji próbek rośną ze wzrostem czasu inkubacji.
Im większa absorbancji tym większe stężenie produktu w próbce. Po takim samym czasie
inkubacji próbki z inhibitorem mają znacznie mniejsze wartości absorbancji niż próbka bez
inhibitora. Inhibitor sojowy zmniejsza szybkości reakcji hydrolizy enzymatycznej.
Głównym powodem niecałkowitego zatrzymania reakcji enzymatycznej jest użycie
mieszaniny enzymów. Inhibitor sojowy wiąże się z trypsyną i chymotrypsyną hamując ich
działanie. Nie jest natomiast hamowanie działanie elastyny i karboksypeptydazy. Hydroliza
enzymatyczna zachodzi więc znacznie wolniej. Dodatkowym czynnikiem spowalniającym
całość reakcji jest obecność proenzymów w pankreatynie, które aktywuje właśnie trypsyna.
Trypsyna związana z inhibitorem sojowym jest nieaktywna, więc nie może aktywować
pozostałych enzymów.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
A
750
t/min.