Sprawozdanie 10.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wstęp
Doświadczenie 1.
Krzywe miareczkowania aminokwasów
Aminokwasy mają charakter amfoterycznych. Posiadają grupy aminowe zdolne do włączania
protonu oraz grupy karboksylowe zdolne do oddysocjowania protonu. Dodatkowe łańcuchy
boczne mogą ulegaj różniej jonizacji. W roztworze cały czas panuje równowaga pomiędzy
wszystkimi formami jonowymi. W zależności od pH jednych form jonowych jest więcej, nich mniej.
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie krzywych miareczkowania dla dwóch aminokwasów. Jest
to zależność zmiany pH od ilości dodawanego kwasu lub zasady. Wartość pH nie zmienia się
jednostajnie. Dla wartości pH zbliżonych do pK zmiany pH są małe. Mechanizm ten zwany
buforowaniem polega na przesuwaniu równowagi przeciwnie do zmian pH. Gdy dodawany
jest kwas równowaga jest przesuwana w stronę formy niezdysocjowanej tak, aby związać
nadmiar jonów wodorowych. Dla wartości pH zbliżonych do pI zmiany pH są duże.
Glicyna (Gly) jest najprostszym aminokwasem (rysunek 1.).
NH
2
O
O
H
(rysunek 1.)
Kwas asparaginowy (Asp) jest aminokwasem o odczynie kwaśnym (rysunek 2.).
NH
2
O
O
OH
O
H
(rysunek 2.)
Doświadczenie 2.
Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
Punkt izoelektrycznych (pI) to pH dla którego aminokwas/białko posiada sumaryczny ładunek
elektryczny równy zero. Wówczas cząsteczka taka cząsteczka nie porusza się w polu
elektrycznym. Precyzyjną metodą wyznaczenia pI jest izoelektroogniskowanie. Polega
na przyłożeniu napięcia do płytki żelowej z naniesionym białkiem. Żel został tak
przygotowany, że posiada liniowy gradient pH. Białko zatrzyma się, gdy będzie
nienaładowane, czyli dokładnie w pI. Inna metodą jest wytrącanie osadów. Białko w pI
posiada najmniejszą rozpuszczalność. Sporządza się serię roztworów o różnych pH i rozpuszcza
się w nich białko. Punkt izoelektrycznych białka jest równy pH roztworu, gdzie wytrącił się
największy osad. Jest to metoda szybsza i łatwiejsza do wykonania, jednak mniej dokłada.
Celem doświadczenia jest wyznaczenie pI kazeiny przez wytrącenie osadu. Kazeina jest
kwaśnym białkiem wyizolowanym z mleka ssaków. Pełnia ona funkcje stabilizujące w mleku,
czyli roztworze koloidowym tłuszczu w wodzie. Punkt izoelektryczny kazeiny wynosi od 4,5
[1]
do 4,7
[2]
w zależności od użytej metody jej izolacji.
[1] Van Slyke, L. L., and Baker, J. C., J. Biol. Chem., 1918, xxxv, 127.
[2] Loeb, J., J. Gen. Physiol., 1918-19, i, 237.
Sprawozdanie 10.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Materiały
a)
Odczynniki:
1 N HCl – roztwór mianowany,
1 N NaOH – roztwór mianowany,
0,1 M glicyna,
0,05 M kwas asparaginowy,
1 M CH
3
COOH,
0,5% roztwór kazeiny w wodzie,
b)
Szkło laboratoryjne:
Zlewki wysokie 50 ml (4 szt.) i 250 ml (1 szt.),
Probówki (10 szt.).
c)
Aparatura:
Pehametr cyfrowy z elektrodą szklaną, wzorce pH: 4, 7, 9.
Mieszadło magnetyczne,
Pipety automatyczne (3 szt.),
Stawy na probówki.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zgodnie z treścią instrukcji „I”.
Doświadczenie 1.
Krzywe miareczkowania aminokwasów
1.
Wykalibrowano pehametr za pomocą wzorców pH: 4, 7 i 9.
2.
Miareczkowano 40 ml wody destylowanej za pomocą 1 N HCl do pH 1,6. Wyniki umieszono w tabeli 1.
3.
Miareczkowano 40 ml wody destylowanej za pomocą 1 N NaCl do pH 12. Wyniki umieszono w tabeli 1.
4.
Miareczkowano 40 ml 0,1 M glicyny za pomocą 1 N HCl do pH 1,6. Wyniki umieszono w tabeli 2.
5.
Miareczkowano 40 ml 0,1 M glicyny za pomocą 1 N NaCl do pH 12. Wyniki umieszono w tabeli 2.
6.
Miareczkowano 40 ml 0,05 M kwas asparaginowy za pomocą 1 N HCl do pH 1,6. Wyniki
umieszono w tabeli 3.
7.
Miareczkowano 40 ml 0,05 M kwas asparaginowy za pomocą 1 N NaCl do pH 12. Wyniki
umieszono w tabeli 3.
Doświadczenie 2.
Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
1.
Wykalibrowano pehametr za pomocą wzorców pH: 4 i 7.
2.
Przygotowano 9 probówek.
3.
Do pierwszej dodano 13,6 ml wody destylowanej oraz 6,4 ml 1M CH
3
COOH. Wymieszano.
4.
Do następnej probówki dodano 5,0 ml wody destylowanej oraz 5,0 ml roztworu z poprzedniej
probówki. Wymieszano.
5.
Pkt. 4. powtórzono dla probówek od 3 do 9.
6.
Skorygowano objętości probówki 1 i 9 do 5 ml.
7.
Zmierzono pH w probówkach od 1 do 9. Wyniki umieszono w tabeli 4.
8.
Do probówek od 1 do 9 dodano po 1 ml 0,5% roztworu kazeiny. Wymieszano.
9.
Odczekano 30 minut.
10.
Zanotowano wielkość zmętnienia i osadu w tabeli 4.
Sprawozdanie 10.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wyniki
Tabela 1. – Miareczkowanie wody destylowanej wobec kwasu i zasady
HCl
/ml/
Σ
HCl
/ml/
pH
0,0000
0,0000
7,16
0,0125
0,0125
3,71
0,0125
0,0250
3,15
0,0125
0,0375
2,93
0,0125
0,0500
2,78
0,0125
0,0625
2,66
0,0125
0,0750
2,56
0,0125
0,0875
2,49
0,0125
0,1000
2,42
0,0125
0,1125
2,37
0,0125
0,1250
2,34
0,0125
0,1375
2,30
0,0125
0,1500
2,25
0,0125
0,1625
2,22
HCl
/ml/
Σ
HCl
/ml/
pH
0,0375
0,2000
2,10
0,0375
0,2375
1,96
0,0500
0,2875
1,89
0,0500
0,3375
1,83
0,0500
0,3875
1,78
0,0500
0,4375
1,74
0,0500
0,4875
1,69
0,0500
0,5375
1,65
0,0500
0,5875
1,62
0,0500
0,6375
1,58
0,0500
0,6875
1,55
0,0500
0,7375
1,53
NaOH
/ml/
Σ
NaOH
/ml/
pH
0,0000
0,0000
7,17
0,0125
0,0125
10,44
0,0125
0,0250
10,84
0,0125
0,0375
11,04
0,0125
0,0500
11,25
0,0125
0,0625
11,38
0,0500
0,1125
11,60
0,0500
0,1625
11,73
0,0500
0,2125
11,83
0,0500
0,2625
11,91
0,0500
0,3125
11,98
0,0500
0,3625
12,03
Wykres 1. – Miareczkowanie wody destylowanej
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0,20
0,40
1,00
3,00
5,00
7,00
9,00
11,00
13,00
m
l
H
C
l
m
l
N
a
O
H
pH
Sprawozdanie 10.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 4 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Tabela 2a. – Miareczkowanie glicyny wobec kwasu
pH
HCl
/ml/
H
O
/ml/
mol HCl
1 mol aa
7,23
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
6,79
0,0125
0,0125
0,0000
0,0000
6,03
0,0250
0,0125
0,0125
0,0031
5,17
0,0375
0,0125
0,0250
0,0063
4,73
0,0500
0,0125
0,0375
0,0094
4,50
0,0625
0,0125
0,0500
0,0125
4,32
0,0750
0,0125
0,0625
0,0156
4,15
0,0875
0,0125
0,0750
0,0188
4,06
0,1000
0,0125
0,0875
0,0219
3,72
0,2000
0,0125
0,1875
0,0469
3,49
0,3000
0,0250
0,2750
0,0688
3,34
0,4000
0,0250
0,3750
0,0938
3,22
0,5000
0,0250
0,4750
0,1188
3,13
0,6000
0,0375
0,5625
0,1406
2,97
0,8000
0,0375
0,7625
0,1906
2,82
1,0000
0,0500
0,9500
0,2375
pH
HCl
/ml/
H
O
/ml/
mol HCl
1 mol aa
2,71
1,2000
0,0625
1,1375
0,2844
2,61
1,4000
0,0750
1,3250
0,3313
2,52
1,6000
0,0875
1,5125
0,3781
2,43
1,8000
0,1000
1,7000
0,4250
2,36
2,0000
0,1250
1,8750
0,4688
2,28
2,2000
0,1500
2,0500
0,5125
2,20
2,4000
0,2000
2,2000
0,5500
2,14
2,6000
0,2000
2,4000
0,6000
2,06
2,8000
0,2375
2,5625
0,6406
1,99
3,0000
0,2375
2,7625
0,6906
1,93
3,2000
0,2875
2,9125
0,7281
1,86
3,4000
0,3375
3,0625
0,7656
1,79
3,6000
0,3875
3,2125
0,8031
1,73
3,8000
0,4875
3,3125
0,8281
1,67
4,0000
0,5375
3,4625
0,8656
1,61
4,2000
0,6375
3,5625
0,8906
Tabela 2b. – Miareczkowanie glicyny wobec zasady
pH
NaOH
/ml/
H
O
/ml/
mol NaOH
1 mol aa
7,20
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
7,70
0,0125
0,0000
0,0125
0,0031
7,91
0,0250
0,0000
0,0250
0,0063
8,00
0,0375
0,0000
0,0375
0,0094
8,15
0,0500
0,0000
0,0500
0,0125
8,30
0,0625
0,0000
0,0625
0,0156
8,33
0,0750
0,0000
0,0750
0,0188
8,42
0,0875
0,0000
0,0875
0,0219
8,66
0,1875
0,0000
0,1875
0,0469
8,79
0,2875
0,0000
0,2875
0,0719
8,89
0,3875
0,0000
0,3875
0,0969
8,98
0,4875
0,0000
0,4875
0,1219
9,07
0,5875
0,0000
0,5875
0,1469
9,15
0,6875
0,0000
0,6875
0,1719
9,27
0,8875
0,0000
0,8875
0,2219
9,38
1,0875
0,0000
1,0875
0,2719
9,48
1,2875
0,0000
1,2875
0,3219
9,58
1,4875
0,0000
1,4875
0,3719
pH
NaOH
/ml/
H
O
/ml/
mol NaOH
1 mol aa
9,67
1,6875
0,0000
1,6875
0,4219
9,75
1,8875
0,0000
1,8875
0,4719
9,84
2,0875
0,0000
2,0875
0,5219
9,92
2,2875
0,0000
2,2875
0,5719
10,01
2,4875
0,0000
2,4875
0,6219
10,09
2,6875
0,0000
2,6875
0,6719
10,15
2,8875
0,0000
2,8875
0,7219
10,24
3,0875
0,0000
3,0875
0,7719
10,37
3,2875
0,0000
3,2875
0,8219
10,48
3,4875
0,0125
3,4750
0,8688
10,59
3,6875
0,0125
3,6750
0,9188
10,79
3,8875
0,0125
3,8750
0,9688
11,02
4,0875
0,0250
4,0625
1,0156
11,35
4,2875
0,0500
4,2375
1,0594
11,69
4,4875
0,1125
4,3750
1,0938
11,94
4,6875
0,2625
4,4250
1,1063
12,05
4,8875
0,3625
4,5250
1,1313
Sprawozdanie 10.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 5 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wykres 2. – Miareczkowanie glicyny
Z wykresu 2. odczytano:
pK
2,40
pI 6,20
pK
10,00
Tabela 3a. – Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec kwasu
pH
HCl
/ml/
H
O
/ml/
mol HCl
1 mol aa
2,82
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
2,81
0,0125
0,0000
0,0125
0,0063
2,79
0,0250
0,0000
0,0250
0,0125
2,78
0,0375
0,0000
0,0375
0,0188
2,70
0,0875
0,0125
0,0750
0,0375
2,68
0,1375
0,0125
0,1250
0,0625
2,64
0,1875
0,0250
0,1625
0,0813
2,58
0,2375
0,0250
0,2125
0,1063
2,53
0,2875
0,0375
0,2500
0,1250
2,49
0,3375
0,0375
0,3000
0,1500
2,40
0,4375
0,0625
0,3750
0,1875
2,32
0,5375
0,0875
0,4500
0,2250
2,25
0,6375
0,1000
0,5375
0,2688
pH
HCl
/ml/
H
O
/ml/
mol HCl
1 mol aa
2,18
0,7375
0,1500
0,5875
0,2938
2,12
0,8375
0,1500
0,6875
0,3438
2,06
0,9375
0,1875
0,7500
0,3750
2,01
1,0375
0,1875
0,8500
0,4250
1,96
1,1375
0,1875
0,9500
0,4750
1,90
1,2375
0,2375
1,0000
0,5000
1,84
1,3375
0,2875
1,0500
0,5250
1,80
1,4375
0,3375
1,1000
0,5500
1,75
1,5375
0,3875
1,1500
0,5750
1,71
1,6375
0,4375
1,2000
0,6000
1,67
1,7375
0,4875
1,2500
0,6250
1,63
1,8375
0,5375
1,3000
0,6500
1,59
1,9375
0,5875
1,3500
0,6750
1,25
0,75
0,25
0,25
0,75
1,25
1,00
3,00
5,00
7,00
9,00
11,00
13,00
m
o
l
H
C
l/
1
m
o
l
a
a
m
o
l
N
a
O
H
/1
m
o
l
a
a
pH
Sprawozdanie 10.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Amfoteryczny charakter aminokwasów
Tabela 3b. – Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec zasady
2,85
0,0250
0,0000
0,0250
2,87
0,0375
0,0000
0,0375
2,89
0,0500
0,0000
0,0500
2,91
0,0625
0,0000
0,0625
2,92
0,0750
0,0000
0,0750
2,94
0,0875
0,0000
0,0875
2,96
0,1000
0,0000
0,1000
2,97
0,1125
0,0000
0,1125
2,98
0,1250
0,0000
0,1250
2,99
0,1375
0,0000
0,1375
3,01
0,1500
0,0000
0,1500
3,04
0,1625
0,0000
0,1625
3,14
0,2625
0,0000
0,2625
3,25
0,3625
0,0000
0,3625
3,33
0,4625
0,0000
0,4625
3,39
0,5625
0,0000
0,5625
3,51
0,6625
0,0000
0,6625
3,58
0,7625
0,0000
0,7625
3,68
0,8625
0,0000
0,8625
Wykres
Z wykresu 3. odczytano:
1,00
0,50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
1,00
3,00
m
o
l
H
C
l/
1
m
o
l
a
a
m
o
l
N
a
O
H
/1
m
o
l
a
a
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona
Data zajęć: 2008/05/29
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec zasady
0,0250
0,0125
0,0375
0,0188
0,0500
0,0250
0,0625
0,0313
0,0750
0,0375
0,0875
0,0438
0,1000
0,0500
0,1125
0,0563
0,1250
0,0625
0,1375
0,0688
0,1500
0,0750
0,1625
0,0813
0,2625
0,1313
0,3625
0,1813
0,4625
0,2313
0,5625
0,2813
0,6625
0,3313
0,7625
0,3813
0,8625
0,4313
3,73
0,9625
0,0000
3,85
1,0625
0,0000
3,95
1,1625
0,0000
4,19
1,3625
0,0000
4,51
1,5625
0,0000
5,18
1,7625
0,0000
8,76
1,9625
0,0000
9,25
2,1625
0,0000
9,52
2,3625
0,0000
9,73
2,5625
0,0000
9,93
2,7625
0,0000
10,11
2,9625
0,0000
10,32
3,1625
0,0000
10,57
3,3625
0,0125
10,93
3,5625
0,0250
11,45
3,7625
0,0625
11,80
3,9625
0,1625
12,03
4,1625
0,3625
Wykres 3. – Miareczkowanie kwasu asparaginowego
3,00
5,00
7,00
9,00
11,00
pH
Strona 6 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Miareczkowanie kwasu asparaginowego wobec zasady
0,0000
0,9625
0,4813
0,0000
1,0625
0,5313
0,0000
1,1625
0,5813
0,0000
1,3625
0,6813
0,0000
1,5625
0,7813
0,0000
1,7625
0,8813
0,0000
1,9625
0,9813
0,0000
2,1625
1,0813
0,0000
2,3625
1,1813
0,0000
2,5625
1,2813
0,0000
2,7625
1,3813
0,0000
2,9625
1,4813
0,0000
3,1625
1,5813
0,0125
3,3500
1,6750
0,0250
3,5375
1,7688
0,0625
3,7000
1,8500
0,1625
3,8000
1,9000
0,3625
3,8000
1,9000
13,00
Sprawozdanie 10.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 7 z 7
Data zajęć: 2008/05/29
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie I
Amfoteryczny charakter aminokwasów i białek
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Tabela 4. – Zmętnienie roztworu kazeiny w różnych pH
nr probówki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
2,44
2,58
2,81
2,96
3,15
3,39
3,63
3,86
4,16
zmętnienie
–
–
+
++
+++
++
–
–
–
osad
–
–
–
+
++
+
–
–
–
Wnioski
Doświadczenie 1.
Krzywe miareczkowania aminokwasów
Zarówno dla glicyny jak i kwasu asparaginowego wyznaczone wartości pK i pI pokrywają się
z danymi tabelarycznymi zawartymi instrukcji „I”.
glicyna
zmierzono
z instrukcji
pK
1
2,40
2,23
pK
2
10,00
9,82
pI
6,20
5,97
kwas asparaginowy
zmierzono
z instrukcji
pK
1
2,00
2,09
pK
2
10,20
9,82
pK
3
3,80
3,86
pI
3,00
2,97
Doświadczenie 2.
Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
Zgodnie z tabelą 4. największy osad jest w probówce 5. dla pH 3,15. To znaczy, że pI kazeiny
wynosi 3,15. Wyznaczony doświadczalnie punkt izoelektryczny jest znacznie niższy
niż wartość podana w literaturze (pI=4,5). Powodem może być niedokładność użytej metody,
czy subiektywna ocena ilości wytrąconego osadu. Innym powodem może być
zanieczyszczenie badanego roztworu kazeiny.