plik

ZAKŁAD BIOCHEMII

UMCS

BIOCHEMIA II

I rok II stopnia

Biochemia

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO GLUTATIONU

Wstęp

Oznaczanie składu aminokwasowego białek i peptydów obejmuje dwa etapy:

1) hydrolizę (uzyskanie wolnych aminokwasów) i 2) rozdział tych aminokwasów metodami

chromatograficznymi.

Hydroliza próbki musi być całkowita, tzn. dać w wyniku wyłącznie wolne aminokwasy i nie powinna

powodować zmian w ich cząsteczkach. Istnieją dwie metody hydrolizy - chemiczna i enzymatyczna.

Hydroliza chemiczna (alkaliczna lub kwaśna) polega na działaniu wysokich temperatur (ok. 100°C) w

środowisku o skrajnych wartościach pH. Powoduje ona uwolnienie wszystkich aminokwasów, ale też częściowe

zniszczenie niektórych z nich (hydroliza kwaśna – cystyny i metioniny, hydroliza alkaliczna - tryptofanu).

Hydroliza enzymatyczna polega na trawieniu białka za pomocą enzymów proteolitycznych. Ich działanie

nie uszkadza poszczególnych aminokwasów, lecz nie prowadzi również do całkowitej hydrolizy łańcucha

polipeptydowego. W wyniku działania enzymów proteolitycznych powstaje mieszanina wolnych aminokwasów

i oligopeptydów, którą trudno rozdzielić metodami chromatograficznymi na poszczególne składniki.

Z obu metod hydrolizy wybiera się wiec tę, która dogodniejsza jest w danych warunkach

doświadczalnych. Do celów rutynowej analizy najwygodniej jest stosować hydrolizę kwaśna, przy pomocy 6N

HCl w temp. wrzącej łaźni wodnej. Czas trwania procedury zależy od rodzaju hydrolizowanej próbki i wynosi:

30-60 min. dla oligopeptydów, 12-24 godz. dla białek (polipeptydów).

Do rozdzielania mieszaniny aminokwasów uzyskanych w wyniku hydrolizy peptydów stosuje się

zwykle jedną z trzech metod chromatograficznych: chromatografię bibułową, cienkowarstwową lub

jonowymienną.

Chromatografia bibułowa pozwala na rozdział mieszaniny kilku aminokwasów w bardzo prosty i

ekonomiczny sposób. Dla mieszaniny kilkunastu aminokwasów (powstałe w wyniku hydrolizy polipeptydu)

należy stosować chromatografię dwukierunkową, co proces rozdziału komplikuje i wydłuża w czasie.

Chromatografia cienkowarstwowa pozwala na rozdział małych ilości aminokwasów, rzędu

mikromoli. Rozdział przeprowadzany jest dwukierunkowo, na płytkach pokrytych sproszkowaną celulozą

(nośnikiem analogicznym do stosowanego w chromatografii bibułowej) lub sproszkowanym tworzywem

sztucznym - poliamidem. Użycie do rozdziału chemicznych pochodnych aminokwasów, np. dansylo-

aminokwasów, zwiększa czułość metody i pozwala na rozdział nanomoli aminokwasów w postaci ich

pochodnych.

Obie metody - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa pozwalają na analizę jakościową

mieszaniny aminokwasów w hydrolizacie.

Chromatografia jonowymienna pozwala na ilościową analizę - określenie stężeń aminokwasów w

hydrolizacie peptydów i w związku z tym stosowana jest do badań rutynowych w specjalnie wyposażonych

laboratoriach. Z reguły do analizy służy automatyczny zestaw - analizator aminokwasów, który umożliwia

rozdział dużych ilości hydrolizatu na kolumnach wypełnionych syntetycznymi żywicami jonowymiennymi.

Uzyskane wyniki pozwalają na dokładne obliczenie procentowej zawartości aminokwasów w badanej próbie, z

uwzględnieniem poprawek dotyczących aminokwasów ulegających przekształceniom w wyniku hydrolizy.

Glutation jest trójpeptydem, który do całkowitej hydrolizy wymaga 30 min., przy zastosowaniu

stężonych kwasów i temp. 100°C. Aminokwasy wchodzące w skład glutationu nie ulegają przy tym

uszkodzeniom i można je rozdzielić po hydrolizie stosując jednokierunkową chromatografię bibułową.

Wykonanie ćwiczenia:

Hydroliza glutationu

Do 2 probówek odważyć po 5 mg glutationu: do jednej - 5 mg preparatu otrzymanego na

wcześniejszych ćwiczeniach, a do drugiej - 5 mg wzorcowego preparatu glutationu.

Do obu probówek dodać po l ml mieszaniny HCl i HCOOH (w stos. 1:1). Zatkane korkami probówki wstawić

do wrzącej łaźni wodnej na 30 min.

Po tym czasie hydrolizaty przenieść do odpowiednich parowniczek, odparować je do sucha na wrzącej

łaźni wodnej, a uzyskane osady rozpuścić w 0,5 ml 0,01N roztworu HCl. Uzyskane w ten sposób roztwory

nanosić na bibułę chromatograficzną.

Rozdział chromatograficzny

Na arkuszu bibuły Whatman nr 1, o wymiarach 12 cm x 20 cm, zaznaczyć ołówkiem w odległości 2 cm

od krótszego boku linią startu. Na niej zaznaczyć punkty naniesienia dla: hydrolizatu uzyskanego wcześniej

preparatu, hydrolizatu wzorcowego preparatu glutationu, roztworów wzorcowych aminokwasów.

Na zaznaczone punkty nanosić kroplami odpowiednie roztwory, za każdym razem susząc bibułę

strumieniem gorącego powietrza.

Bibułę z naniesionymi próbkami umieścić w komorze chromatograficznej zawierającej 200 ml

rozwijającego układu rozpuszczalników: butanol - kwas octowy - woda (w stos. 3:1:1). Zamknąć szczelnie

komorę i rozwijać chromatogram 2,5 godz.

Po tym czasie, chromatogram wyjąć z komory, wysuszyć strumieniem gorącego powietrza i wywołać

zwilżając bibułę 0,1% roztworem ninhydryny w acetonie, a następnie susząc ponownie w celu uwidocznienia

barwnych plam aminokwasów.

Odczynniki i sprzęt:



glutation (wzorcowy)

10mg



mieszanina HCl : HCOOH w stos. 1:1

10ml



0,01N HCl

10ml



wzorcowy r-r kwasu glutaminowego

10ml



wzorcowy r-r cysteiny

10ml



wzorcowy r-r glicyny

10ml



0,1% r-r ninhydryny w acetonie

200ml



rozwijacz (butanol: kwas octowy: woda) w stos. 3:1:1

200ml



parowniczki

2 szt



bibuła Whatman nr 1 o wymiarach 12x20cm

1 szt.



komora chromatograficzna

1 szt.



suszarka

1 szt.

Piśmiennictwo:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), 2005, Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa.

2. Berg J.M., Stryer L., Tymoczko J.L., 2009, Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

3. Jakubke, H-D., Jeschkeit, H., 1989, Aminokwasy, peptydy, białka. PWN, Warszawa.