Techniki Histologiczne 

Procedury przygotowywaia skrawków:

• pobieranie materiału

• utrwalanie

• zatapianie

• krojenie

• barwienie

Skrawki mogą pochodzić od osób żywych (biopsja), martwych (ustalanie przyczyny zgonu) lub od zwierząt laboratoryjnych. 

UTRWALANIE

• Powoduje występowanie śmierci kom poprzez zahamowaie ich procesów życiowych.

• Najlepszym utrwalaczem - ten co najszybciej zahamuje te procesy - zapobiega to autolizie (samotrawienie kom pod wpływem własnych zawartych w kom enzymów)

• Proces utrwalanie hamuje synteze i przemiany wszystkich subst budujących kom tj. białek i lipidów, węglowodanów, kw. nukleinowych i in.

• Najważniejsze jednak zmiany wyst w cząsteczkach białek, które ulegają procesom koagulacji i denaturacji

• Koagulacja - związ z usuwaniem przez utrwalacz wodnej otoczki otaczającej białka co powoduje ich wytrącenie (proc. odwracalny)

• Denaturacja - zmiana II- i III-rzędowej struktury białek (traci otoczkę wodną i staje się białkiem włókienkowym); likwidacja lub rozluźnienie wiązań - powstałe po denaturacji białka linearne zmieniają swą strukturę co powoduje w efekcie utrate ich aktywności biol.

• Utrwalenie lipidów - tylko poprzez zmianę ich struktury chem ( np. ich nierozpuszczalne sole) ; najczęściej stosowane utrwalacze powodują wypłukanie tłuszczy przez zastosowane do utrwalania i zatapiania związki org m.in. alkohole, benzeny; w kom tych pozostają wakuole po lipidach

• Węglowodany - wielkocząsteczkowe -> utrwalenie po zastosowaniu utrwalaczy bezwodnych m.in. płynu Carnoy'a ; niskocząsteczkowe -> praktycznie niemożliwe

• Białke enzymatyczne - te utrwalacze co w małym stopniu je denaturują np. aceton, glutaraldehyd, formaldehyd,

• Chromatyna - płyn Carnoy'a lub Bouin'a

• Stosunek ilościowy tkanki do utrwalacza : 1:20

• Objętość tkanki nie powinna przekraczać 1cm³

 

Utrwalacze proste:

1. FORMALINA - formaldehyd (ald. mrówkowy) , używa się r-ru 4% (przechowywac w ciemnym naczyniu, aby zapobiec rozkładowi 
   Powszechnie stosowana z powodu niskich kosztów, dobrych wyników utrwalania i trwałości stosowania. 
   Do utrwalania stosować r-ry zobojętnionej formaliny. 
   Szybko przenika wgłąb taknek, dobrze ścina białko, zachowuje w kom lipidy, węglowodany ulegają wypłukaniu. 
   Tak utrwalone prep można długo przechowywać.

2. ALKOHOL ETYLOWY - szybko wytrąca białko, glikogen, subst. śluzowe, ale rozpuszcza lipidy. 
   stosuje się rzadko jako samodzielny utrwalacz - najczęściej zastosow razem z chloroformem i kw. octowym lodowatym (?) jako tzw. utrwalacz Carnoy'a

3. ALDEHYD GLUTAROWY - proces utrwalania podobny do formaliny. 
   Stosuje się 1-6,25% r-ry . 
   najczęściej stosowany do przygotowywania do ME

4. KWAS OSMOWY - bardzo małą przenikliwość - stosowany więc do skrawków ultracienkich. 
   W praktyce używa się buforowanych r-rów kw. osmowego ; sam utrwalacz stosuje się i przechowuje w ciemnościach, aby zapobiec jego rozkładowi 
   Bardzo dobrze utrwala lipidy - wchodząc w reakcji z podwójnymi wiązaniami wszystkich lipidów wytwarzają c wiąz nadtlenkowe lub tworząc mostki między dwoma ich cząsteczkami. 
   Wybiórczo ukazuje ap. Golgiego oraz lipidy wewnątrzkom. 
   Stosuje się go w postaci par mało zmieniających strukturę kom i taknek. 
   Drogi i wymaga specjalnego przechowywania.

 

Utrwalacze złożone:

1. PŁYN CARNOY'A  
    
   Skład: 
   -alkohol absolutny 60ml 
   -chloroform 30ml 
   -kwas octowy  lodowaty 10ml 
    
   Zalety: posiada wszystkie zalety etanolu, utrwala b. dobrze jądra kom., zmniejsza kruchość takanek. Stosowany gł. do wykrywania węglowodanów złożonych np. glikogenu w kom (roztw. Bezwodny stosow do utrw. wielkocząsteczkowych cukrów). Proces utrwalania trwa kilka godzin. 

2. PŁYN BOUIN'A 
    
   Skład: 
   -kwas pikrynowy 15ml 
   -formalina 5ml 
   -kwas octowy lodowaty 1ml 
    
   Jeden z najlepszych płynów utrwalających, bardzo dobrze przenika do tkanek nie zmieniając zbytnio ich struktury. 
   Czas utrwalania 2-8 dni. 
   Po utrwaleni materiał płucze się w wodzie i alkoholu 70%, aby wypłukać nadmiar kw. pikrynowego

 
 

Najlepszym, najtańszym i najprostszym utrwalaczem jest foralina. W innych utrwalaczach raczej nie wolno przechowywać skrawków dłużej niż jest to zalecane (możliwość stwardnienia lub obkurczenia). 
 
 
 
 
 
 

LIOFILIZACJA 

• Szybkie zamrażanie tkanek i odwadnianie ich w próżni w niskiej temp.

• Niewielki fragmenty tkanki przenosi się do płynnego azotu (-160-190oC); także próbowano płynnego helu - temp. bliska OoK

• woda zawarta w kom ulega nitryfikacji (zeszkliwieniu) - nie powst kryształki lodu które mogłyby zniszczyć strukturę - powst mikrokryształki

• do zamrażania plemników (banki nasienia), linii kom w prowadzonych hodowlach tkankowych.

• po tym wszystkim następuje właściwa liofilizacja tj. usuniecie wody poprzez suszenie w niskiej temp -30-400oC w próżni (sublimacja)

• kom i tkanki dzięki liofilizacji zachowuje swą normalna struktur echem, a często też biofizyczną, ponieważ utrwalenie następuje błyskawicznie

• mrożenie z podstawieniem - zmodyfikowana liofilizacja ->liofilizacja właściwa zastąpiona działaniem etanolu, metanolu, acetonu w temp -20-60oC w celu rozpuszczenie pozostałych mikrokryształków  lodu

 
 

ODWADNIANIE 

• po utrwaleniu

• poprzez umieszczanie badanego materiału we wzrastających stężeniach np. alkoholu od 70-100% (szereg alkoholowy) -> należy całkowicie usunąć wodę ponieważ ani parafina, ani celoidyna ani też żywice syntetyczne nie rozpuszczają się w wodzie.

 
 

ZATAPIANIE 

• najczęściej zatapia się w parafinie

• czasem mieszaniny parafiny z różnymi polimerami np. preparat Paraplast

• nadanie odpowiedniej twardości i homogenności ułatwiającej krojenie.

 
 

KROJENIE 

• mikrotomy

• m. saneczkowe lub obrotowe kroją na grubość ok. 2-6µm

• do krojenie skrawków nie utrwalonych - specjalne mikrotomy wbudowane dokomór chłodzących w temp. -20oC (kriostaty)

• mikrotomy mrożeniowe - do uzyskania skrawków preparatów krótko utrwalonych lecz nie zatopionych -> tkanke zamraża się prz pomocy CO₂ lub stosując specjalne mrożące przystawki

• skrawki ultracienikie - 20-80nm - ME; mogą być także oglądane w MŚ - ultramikrotom

• w kierunku unieruchomionego noża diamentowego lub też szklanego przesuwa się zatopiony w żywicach syntetycznych obiekt, przy czym przesuw wywołany jest szerzeniem się metalowej sztabki pod wpływem ciepła

 
 
 
 
 

BARWIENIE 

• skrawki parafinowe przez barwwoieniem musza być odparafinowane -> umieszczone w benzenie lub ksylenie.

• jeżeli skrawki będą barwione r-rami wodnymi wówczas należy je nawodnić poprzez przeprowadzenie naklejonych na szkiełko podstawowe preparatów przez malejący szereg alkoholi (od 100 do 70%)

• po przeprowadzonym barwieniu preparaty należy odwodnic i prześwietlić np. ksylenie by preparat jednolicie łamał światło a następnie zamknąć w balsamie kanadyjskimprzykrywając go szkiełkiem nakrywkowym.

 
 

BARWIENIE CYTOLOGICZNE 

• barwiniki - większośc to barwniki aromatyczne

• zasadowe i kwaśne

• kwaśne -> zabarwienie dają gr. chromofobowe 9 zazwyczaj to gr. nitrowe lub chinonowe)

• zasadowe ->gr azotowe lub inamidowe

• barwniki łączą się gł. z białkami, kw. nul., gr funkcyjnymi cząsteczek np. -oh, przy czym intensywnośc barwienie zależy od szeregu czynników np. pkt. izoelektrycznego badanych struktur, pH, temp. itp.

• te co wiążą barwniki kwaśne- kwasochłonne (eozyna, oranż G)<-> zasadochłonne (hematoksylnina, błękit toluidyny)

 
 

Barwienie matachromatyczne:

• pewne struktury kom czy tkanek wybarwiają się na inny kolor niż kolor użytego barwnika

• np. ziarnistości kom. tucznych po zastosowaniu błękitu toluidyny - na czerwono

• najcześciej mamy do czynienie z barwieniem ortochromatycznym - kolory się zgadzają

• barwienie rozmazu krwi obwodowej met. Giemzy -> jest to mieszanina barwników zasado- i kwasochłonnych-> różne struktury wyłapuję co innego-> barwienie parachromatyczne

 
 
 

• skrawki muszą być specj. przygotowae do barwienia (np. skrwaki parafinowe)

• barwienie w kuwetach - maja specjalne zagłębienie- preparat tak się układa, że nie skleja się z innymi a barwnik swobodnie może przepływać

 
 
 
 
 
 
 

METODY BARWIENIA 

1. H+E 
    
   Wykonanie barwienia: 
   -odparafinowane skrawki barwi się hematoksylinie ałunowej 
   -płukanie wodą kranową i H₂o dest. 
   -barwienie eozyną 
   -różnicowanie w wodzie i alkoholu 
   odwadnianie, prześwietlanie, zamknięcie w balsamie kanadyjskim 
    
   Wynik: jądra kom. barwią się na nieb, cytoplazma na czerwono. 
    
   H+E jest rutynową met. barwienia - jest szybka, prosta, uniwersalna i tania. 
    

2. METODA PAS 
    
   materiał do barwienia musi być utrwalony w płynie Carnoy'a lub w alkoholu absolutnym 
    
   Wykonanie barwienia: 
   -odparafinowane skrawki umieszcza się w 70% alkoh. 
   -kwas nadjodowy (0,5-0,8%)/10min 
   -płukanie H₂O dest. 
   -odczynnik Schaffa (odbarwiona fuksyna) - 20-40 min 
   -hematoksylina ałunowa - 10min 
   -woda wodociągowa, odwodnienie w alkoholach, prześwietlenie w ksylenie, balsam kanad. 
    
   Wynik: glikogen, błony podstawne czerw,jądra nieb, wybarwia się śluz 
   W trakcie hydrolizy kwasem narodowym dochodzi do przekształcania grup 1,2 - glikolowych w gr. aldehydowe. Grupy te uwidacznia się na zasadzie reakcji barwnej odczynnikiem Schaffa - przyjmuje wówczas czerwono-purpurowe zabarwienie. Konieczne jest wykonanie reakcji kontrolnej np. z użyciem amylazy.

 

3. METODA FEULGENA 
    
   Do utrwalania mogą być użyte prawie wszystkie utrwalacze. 
    
   Wykonanie reakcji: 
   -odparafinowanie 
   -hydroliza 1mol HCl 60oC - 6min 
   -opłukać w zimnym HCl 
   -odzcynnki Schaffa 20-30min 
   -różnicowanie w siarczynie sodu- 3x po 1min 
   -podbarwić cytoplazmę zielenią świetlistą 
   -odwodnić, balsam 
    
   Wynik: chromatyna jądra zawierająca DNA barwi się na kolor czerwono-purpurowy, tkanka łączna ziel. 
   W wyniku hydrolizy HCl z DNA powstają wolne grupy aldehydowe, co któryc dołącza się odcz. Schaffa. Jest to reakcja specyficzna dla DNA. Reakcja kontrolna z DNA-azą. 
    
    

4. REAKCJA BRACHET'A 
    
   Preparaty utrwala się w płynie Carnoy'a lub formalinie 
    
   Wykonanie reakcji: 
   -odparafinować 
   -barwienie mieszaniną Poroniny i zieleni metylenowej 10min 
   -skrawki osuszyć bibuła filtracyjną 
   -odwodnić w acetonie, następnie przez aceton-ksylen 1:1 i ksylen zamnknąć w balsamie 
    
   Wynik: RNA czerwony. 
   Reakcja ta pozwala na różnicowanie kwasów nukleinowych (pyronina barwi RNA). 
   Reakcja kontrolan z RNA-azą. 
    
    
    
    
   ZASADA REAKCJ KONTROLNYCH DLA MEDOD: PAS I FEULGENA 
   -po 2 skrawki na oddzielnych szkiełkach podst 
   -1-kontrolny 
   -1-traktujemy subst kontrolna: amylaza, DNA-aza 
   -2-cała metoda 
   -kończymy je tak samo i potem porównujemy 
   -jeżeli w 1 nie ma zabarwienia a w 2 jest to to znaczy że jest to reakcja specyficzna - szukana subst występuje a enzymy ją rozłożyły. 
    

5. BARWIENIE LIPIDÓW 
    
   Utrwalacz : formalina lub kw. osmowy; krojenie - mikrotom mrożeniowy 
    
   Wykonanie reakcji: 
   -skrawki z wody do 50% alkoholu 1-2min 
   -barwić Sudanem III 20-230 min, lub tez szkarłatem R 2-3 min 
   -alkohol 50% - 2-3x krótko 
   -podbarwić jądra w hematoksylinie ałunowej 10min 
   -woda wodociągowa, zamknąć w gumie arabskiej lub glicerolu 
    
   Wynik: tłuszcze żywo-pomarańczowe (Sudan III) , czerwone (szkarłat R), jądra - niebieskie 
    
   Zasada polega na różnicy w rozpuszczalności stosowanych do ich barwienie związków w dwóch środowiskach. Barwnik dyfunduje do substratu w kom wykazująć jednocześnie jego lokalizację, ponieważ barwnik ten łatwiej rozp się lipidach. 
    

 
 
 
 

6. METODA MALLOR'EGO 
    
   Utrwalacze : formalina, płyn Boin'a 
    
   Wykonanie barwienia: 
   -odparafinowanie, nawodnienie 
   -barwienia 0,5% fuksyna kwaśna 5 min 
   -utrwalenie barwienia i różnicowanie w 2& kw. fosforomolibednowym(?) - 3min 
   -H₂O dest 
   -barwić mieszaniną zawierającą oranżG, błękit metylenowy i kw. szczawiowy 10-15min 
   -H₂O dest., a następnie różnicowanie w alkoholu 96% 
   -odwodnienie i balsam 
    
   Wynik: włókna kolagenowe- nieb, mięśnie - czerw., śluz 0 nieb., erytrocyty - pomarańczowo czerw. 
    
   Różnicowanie tkanki mięśniowej, łącznej, kom. w przednim płacie przysadki. 
    
   Wykorzystuje się różne właściwości barwienia się poszczególnych struktur odmiennymi barwinikami, dzięki czemu uzyskuje się zróżnicowany obraz morfologiczny. 
    

 
 

7. BARWIENIE WŁÓKIEN ELASTYCZNYCH REZORCYNA-FUKSYNA 
    
   utrwalenie- formalina lub alkohol absolutny 
    
   Wykonanie barwienia: 
   -odpar, alkoh. 80% 
   -ra=rezorcyna-fuksyna temp. 56oC 15-30min 
   -różnicować w alkoh. 80% 
   -podbarwić jądra - czerwienią jądrową lub hematoksyliną 
   -odwodnić, prześwietlić w ksylenie, balsam 
    
   Wynik: włókna sprężyste czarno-fioletowe, jądra czerwone 
    
   Włókna elastyczne barwią się rezorc-fuks (jest t o elektropolarny barwnik o ładunku dodatnim) na swojej powierzchni, która zawiera mikrofibryle zbudowane z glikoproteidów 
    
    

8. SREBRZENIE - IMPREGNOWANIE (włókna retikulinoewe i nerwowe) 
    
   Utrw. - formalina 
    
   Wykonanie barwienia: 
   -odparaf., skrawki w KMnO₄ 3min 
   -pirosziarczan (IV) potasu 1min 
   -H₂O dest, ałun żelazowy 
   -impregnować skrawki w amoniakalnym r-rze azotanu srebra 1min 
   -płukanie w H₂2O a nast. formalina 10% 5min 
   -chlorek złota 0,1% 10 min 
   -metasiarczan (IV) sodu i pirosiarczan (IV) sodu 1min 
   -czerwień jądrowa 1min 
   -H₂O wodociągowa, odwodnienie, balsam 
    
   Wynik: włokna retikulinowe czarne, kolagenowe brązowe, jądra czerwone, nerwowe czarne na jasnym tle 
    
   Określone struktury np. wł. retikulinwe, neurofibryle we wł. nerw. wybiórczo impregnuja się srebrem. Odłożone na tych elem srebro pochodzi z r-ru  bromku srebra pod wpł działania świtała. formalina działa tu jako wywoływacz. Nie zredukowane sole srebra zostają usunięte przez tiosiarczan sodu. Po impregnacji srebrem stosowane są zwykle różne barwienia kontrastowe. Wyzłacanie przy użyciu chlorku złota ma tę zaletę, ze zminieia brązowo-czarny kolor wysrebrzanej struktury na kolor niebiesko-czaryny, zaś subst. międzykom. ulega rozjaśnieniu.

 
 
 

9. BARWIENIE TKANKI KOSTNEJ 
    
   Uzyskiwanie skrawków: 
   -odwapnianie kości - rozpuszczenie fosforanów wapnia; wykonywane po zastosowaniu kwasów nieorg. np. azotowego lub org. np. trójchlorooctowego; 
   Dobre wyniki również po zastosowaniu mieszaniny formaliny i EDTA (wersenian sodu) w stosunku 1:1; mieszanina ta oprócz właściwości odwapniających utrwala materiał nie zmieniając stęż. jonów wodorowych. 
   -zatopienie materiału w parafinie i krojenie na skrawki histologiczne 
   -przeprowadzenie barwienia preparatu np. met. H+E 
    
   Wyniki: osteocyty występują w jamkach kostnych, ossemukoid czerwony. 
    
    
   Uzyskiwanie szlifów kostnych: 
   Ze zmacerowanej kości (po usunięciu z niej związków org przez gotowanie w alkoholach i ługach) wycina się przy pomocy cienkiej piłki małe płytki około 2mm, które szlifuje się następnie przy pomocy drobnoziarnistego specjalnego kamienia lub też na płytkach drobnoziarnistego karborundu. Gdy szlif stanie się prawie przezroczysty wypłukujemy resztki użytego do szlifowania materału przy pomocy alkoholu. Szlif można podbarwić np. fioletem goryczki (wypełnia jamik kostne i kanały Haversa). Po ułożeniu na szkiełku podstawowym szlif zamyka się w balsamie kanadyjskim. 
    
   Wynik: W jamkach kostnych nie ma osteocytów, widoczne blaszki kostne zawierają subst. mineralne. 

 
 

 

10. METODA NISSLA 
    Prep. utrwala się w formalinie lub alkoholu absolutnym. 
     
    Wykonanie barwienia: 
    -skrawki po odparafinowaniu nawodnić 
    -barwienie błękit  toluidyny 0,5% lub fiolet krezolu w pH 4,0 10min 
    -różnicowanie w 95% alkoh. z aniliną 
    -podbarwić w erytrozynie 1-2min 
     
    Wynik barwienia: ciałka Nissla barwią się na kolor niebieski lub fioletowy, podobnie jąderka. 
    Stosowane barwniki łączą się z kwaśnymi grupami RNA szczególnie przy niskim pH, w którym prowadzone jest barwienie. Metoda wykorzystywana głównie do wykazywania ciałek Nissla w kom. nerwowych. 
     
     

11. BARWIENIE METODĄ GIEMSY 
     
    Utrwalone rozmazy szpiku, krwi obwodowej lub też odparaf. skrawki badanych narządów, 
     
    Wykonanie barwienia: 
    -barwienie alkoholowym roztworem Giemzy ( Azur A, Azur B, błękit metylenowy, chlorek błękitu metylenowego, eozyna, metanol); rozmazy krwi obw. 1min, szpik- 4min., skrawki paraf. do 1 godz. 
    -przemyś buforem fosforanowym pH 6,6 - kilka sek., następnie H₂O dest. 
    -przemyś dwukrotnie w izopropanolu i po osuszeniu bibułą filtracyjną rozmazy przechowywać na sucho lub preparaty zamknąć w olejku cedrowym. 
     
    Wynik barwienia: Uzyskujemy wielobarwny obraz - jądra ciemnonieb., ziarnistości w eozynofilach czerwone, erytrocyty, kom. nabł. i tk.łączna - jasnoczerwone, do pomarańczowo-czerwonych, ziarnistości kom. tucznych i śluz czerwono-purpurowy.

 
 
 
 

PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADANIA W MIKROSKOPIE ELEKTRONOWYM 

1. Małe wycinki tkanek utrwala się w aldeh. glutarowy

2. Utrwalanie oraz kontrasowanie kw. osmowym (ma wysokie powinowactwo do tych kom, które zawieraja lipidy - np. błona kom., mitochondria, ap. Golgiego). Kwas osmowy wchodzi w reakcję  z podwójnymi wiązaniami wszystkich tłuszczów wytwarzając wiązaia nadtlenkowe. Może on także tworzyć mostki pomiędzy dwoma cząst lipidów. W praktyce - buforowany r-r kw. osmowego.

3. Zatapianie materiału w żywicach syntetycznych : metakrylany, żywice epoksydowe, epon. żywice wraz z zawartym w nich skrawkiem ulegaja polimeryzacji. Bloczki przed krojeniem muszą być odpowiednio obcięte (tzw. trymowanie) tak, aby powstał ostrościan o krawędzi dopasowanej do szerokości używanego noża

4. Krojenie na skrawki ultracienkie 20-80nm na ultramikrotomie. Skrawki następnie umieszcza się na metalowych siatkach, których oczka pokryte są cienką przepuszczalną dle elektronów błonką z kolodium lub węgla.

5. Umieszczenie skrawków na siatce w ME.

6. Obserwacja w ME

 
 

METODA IMMUNOCYTOCHEMICZNA WYKRYWANIA ANTYGENÓW (MET. PAP) 
 

Preparaty powinny być utrwalone w płynie Bouina 

Wykonanie reakcji:

1. odparaf., blokować endogenną peroksydazę przy pomocy 0,5% wody utlenionej w metanolu.

2. umieścic prep. w normalnej surowicy zwierzęcia od którego pochodzi swoista p-ciało w rozcieńczeniu 1:10 w celu blokowania nieswoistego wiązania.

3. nanieśc na prep. swoiste p-ciało (skierowane przeciw antygenowi, który w tkance poszukujemy) w rozicenczeniu ok. 1:400 temp. +40oC na kilkanaście godzin

4. opłukac dokładnie w r-rze PBS (buforowany r-r NaCl)

5. nanieśc na preparat II p-ciało (surowica kozia przeciw króliczym IgG) 1:10

6. przepłukać dokładnie w r-rze PBS

7. nanieść na prep. PAP (peroksydaza- antyperoksydaza)

8. nanieść na prez. DAS (dwuamino-benzydyna) 5min

9. H₂O kranowa, balsam Kanad.

 

Wynik: w miejscu lokalizacji antygenu wyst brunatno-czarne ziarna. Zastosowane specyficzne p-ciało lęczy się z poszukiwanym antygenem tworząc kompleks, do którego następnie przyłącza się II p-ciało i kompleks PAP. 

---