TECHNIKI HISTOLOGICZNE - oprac. by AK i starsze roczniki:

1) CEL UTRWALANIA TKANEK: przykłady płynów utrwalających i ich zastosowanie w zależności od wykrywanych struktur

Cel:

a) zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach (denaturacja enzymów)

b) zachowanie przed samotrawieniem - autolizą

c) związanie i wytrącenie (precypitacja) niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych

d) wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie odporności na działanie odczynników w dalszych etapach preparatyki

e) utrwalanie lipidów np. poprzez utworzenie do nierozp. soli

Płyny utrwalające:

a) proste

- formalina (denaturacja i koagulacja białek, zmiana struktury lipidów, sieciowanie białek)

- aldehyd glutarowy - do mikroskopii elektronowej (sieciuje białka)

- aceton

- alkohol metylowy i etylowy

- kwas osmowy - zmienia strukturę lipidów i sieciuje białka

Mechanizmy utrwalania poprzez:

• odwodnienie:

- alkohol etylowy

- aceton

• zmianę stopnia uwodnienia:

- kwas octowy

- kwas trichlorooctowy

- kwas chromowy

• sieciowanie białek:

- formalina

- glutaraldehyd

- kwas osmowy

• tworzenie soli z białkami:

- sublimat

- kwas pikrynowy

- dichromian potasu K2Cr2O7

- octan uranylu

b) złożone

- płyn Boina (formalina+kwas pikrynowy+kwas octowy) powoduje: koagulację i denaturację białek

- płyn Carnoya (alkohol etylowy + chloroform + kwas octowy) powoduje: wytrącenie cukrów wielkocząstoczkowych

- płyn Zenkera (sublimat=HgCl2 + dwuchromian potasu + kwas octowy + siarczan sodu)

2) PRZYKŁADY SPOSOBÓW UZYSKIWANIA SKRAWKÓW PARAFINOWYCH, ŚWIEŻYCH MROŻONYCH, MOŻLIWOŚCI WYKORZYSTANIA

Źródła pozyskania: śródoperacyjne, biopsyjne, sekcyjne, ze zwierząt laboratoryjnych

skrawek parafinowy - płyn utrwalający szereg alkoholi o wzrastającym stężeniu (odwodnienie) zatopienie w parafinie, paraplaście, celoidynie krojenie w mikrotomie na paski o grubości 1-10 µm

szkiełko pokryte białkiem kurzym lub silanizowane odparafinowanie w ksylenie

nawodnienie w alkoholach o malejących stężeniach barwienia odwadnianie w szeregu alkoholi o wzrastających stężeniach zmontowanie pod mikroskop

skrawek mrożony - mrożenie w ciekłym azocie lub rozprężającym się CO2 (-150 do - 180 st. C) odwadnianie w próżni krojenie w kriostacie (5-10 µm) montujemy na szkiełko

Zastosowania:

- komórkowa lokalizacja enzymów i tłuszczy

- identyfikacja za pomocą metod immunocytohistochemicznych

- do zamrażania plemników (banki nasienia),

- do zamrażania linii kom w prowadzonych hodowlach tkankowych

3) NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE METODY BARWIENIA:

a) hematoksylina + eozyna: H-zasada, barwi kwaśne jądra na niebiesko, E-słaby kwas, barwi słabozasadową cytoplazmę na różowo,

komórki bardziej zasadochłonne - są aktywniejsze przez RNA z rybosomów

b) czerwień oleista - wybarwia lipidy na pomarańczowo

c) trójbarwna metoda Mallory'ego (utrwalacze: formalina, płyn Bouina)

- błękit aniliny, oranż G, fuksyna kwaśna

- włókna kolagenowe na niebiesko

- śluz na niebiesko

- jądra komórkowe na czerwono

- mięśnie szkieletowe na czerwono-pomarańczowo

- erytrocyty - pomarańczowe

d) hematoksylina i czerwień KONGO - barwienie na dno żołądka, komórki okładzinowe barwią się na pomarańczowo a główne na niebiesko, wykorzystywana jest tu zmiana barwy wskutek zmiany pH

Czerwień Kongo barwi amyloid na zielono w świetle spolaryzowanym.

e) met. srebrowe (w formalinie jako wywoływacz):

- wł. retikulinowe

- błony podstawne

- aparat Golgiego

- wł. nerwowe - czarne na jasnym tle

Właściwości ziarnistości kk. serii APUD:

1. argentofilne - precypitują Ag z amoniakalnego roztworu AgNO3

2. enterochromafinowe - barwią się roztworami di chromianu potasu K2Cr2O7

3. argyrofilne - precypitują Ag w obecności zewnętrznego czynnika redukującego (np. formaliny)

f) met. Nissla (formalina lub alkohol absolutny)

- barwniki: tionina i anilina

- ciałka Nissla i jąderka barwią się na ciemnoniebiesko

g) barwienie czterotlenkiem osmu OsO4:

- mielina wybarwia się na czarno

h) met. Gomoriego - na neurosekret:

- hematoksylina żelazista

4) ZASADA REAKCJI FEULGENA (utrwalacz: dowolny, preferowany jednak z sublimatem HgCl2)

- hydroliza w 1 M HCl

- płukanie

- reakcja z odczynnikiem Schiffa (nasycony tlenkiem siarki (IV) roztwór fuksyny)

- podbarwianie cytoplazmy zielenią świetlistą

DNA czerwono-purpurowy,

Cytoplazma, tkanka łączna zielone

5) ZASADA REAKCJI BRACHETA (utrwalacz: płyn Carnoy'a lub formalina)

- barwienie pyroniną (na RNA) i zielenią metylenową (na DNA)

RNA czerwony, DNA zielony.

6) ZASADA REAKCJI PAS (utrwalacz: płyn Carnoy'a lub alkohol absolutny)

- 1% kwas nadjodowy; służy do wybarwiania glikogenu, oraz muko- i glikoprotein (śluzu) na kolor czerwono fioletowy

- odczynnik Schiffa (nasycony tlenkiem siarki (IV) roztwór fuksyny)

- dodaje się hematoksylinę ałunową

Glikogen, błony podstawne, glikokaliks - czerwone, jądra komórkowe - niebieskie

7) ZASADA REAKCJI METACHROMATYCZNYCH (co nią wykrywamy)

Pewne struktury komórkowe wybarwiają się na inny kolor niż samego barwnika.

Np. ziarnistości komórek tucznych barwione niebieskim błękitem toluidyny przybierają zabarwienie czerwone.

Fiolet metylenowy zabarwia tkankę na niebiesko, a amyloid na czerwnono

8) SPOSOBY WYKRYWANIA LIPIDÓW, BARWNIKI ROZPUSZCZALNE W LIPIDACH, ROZPUSZCZALNIKI TŁUSZCZOWE I EFEKT ICH DZIALANIA:

- używa się preparatów mrożeniowych

- barwniki rozpuszczalne w tłuszczach

(Sudan III, Sudan IV, Sudan czarny, czerwień oleista, szkarłat R, błękit nilu)

- kwas osmowy do ultacienkich skrawków, wiąże lipidy

9)ZASADA REAKCJI IMMUNOCYTOCHEMICZNYCH I ICH ZASTOSOWANIE:

Do wykrywania swoistych składników komórki stosuje się przeciwciała przeciwko specyficznym cząsteczkom białkowym pozwalające uwidocznić składniki komórkowe na poziomie mikroskopu świetlnego.

- zastosowanie fluorochromów (fluoresceina, rodamina) - immunofluorescencja - metoda w której przeciwciała znakowane są barwnikami fluorescencyjnymi

- zastosowanie enzymów - metody immunoperoksydazowe - umiejscowienie swoistych przeciwciał jest wykrywane przez drugie przeciwciało (połączone z peroksydazą chrzanową) - lokalizowane za pomocą barwnego (najczęściej brązowego) produktu reakcji

- zastosowanie metali (złoto koloidalne, ferrytyna zawierająca żelazo)

10) ZASADA REAKCJI HISTOAUTORADIOGRAFII I PRZYKŁADY JEJ WYKORZYSTANIA

Znaczenie izotopem do nukleotydu dzielących się komórek, dzięki temu można zaobserwować intensywność promieniotwórczym wprowadzanym podziałów komórkowych. (znakowana radioaktywnie tymidyna - składnik DNA). Po inkubacji do preparatu przykłada się błonę fotograficzną lub wkłada się go pod detektor.

11) WYKRYWANIE STRUKTUR KOMÓRKOWYCH - HISTOCHEMIA:

a) błona komórkowa (rąbek szczoteczkowy) - wyznaczniki cytochemiczne

- fosfataza zasadowa (np. nerka)

- Na⁺ - K⁺ ATPaza (np. wątroba)

b) mitochondria - metoda klasyczna - hematoksylina żelazista (met. Regaud);

wyznaczniki cytochemiczne:

- (MAO) oksydaza monoaminowa- błona zewnętrzna

- kinaza adenilanowa - PRZESTRZEŃ PERIMITOCHONDRIALNA

- oksydaza cytochromowa - błona wewnętrzna

- markery cyklu Krebsa (np. dehydrogenaza izocytrynianowa) - MATRIX

c) siateczka śródplazmatyczna - glukozo-6-fosfataza

d) aparat Golgiego - impregnacja chromowo - srebrowa,

- pirofosfataza tiaminowa,

e) lizosomy - fosfataza kwaśna, β-glikuronidaza

12) OGÓLNE ZASADY UTRWALANIA, ZATAPIANIA I BARWIENIA MATERIAŁU DO MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ:

- pobranie i docięcie fragmentu tkanki

- utrwalenie w glutaraldehydzie i przepłukanie w buforze

- barwienie kontrastowe

- odwadnianie w alkoholach o wzrastającym stężeniu

- zatopienie w żywicy (epoksyd lub żywica akrylowa) polimeryzacja 60 st. C

- krojenie na mikrotomie na paski o grubości 20-100nm

13) ZASADY HISTOLOGICZNEGO BADANIA TKANEK TWARDYCH:

a) szlify - pozbawiony składników organicznych podbarwiony tuszem (pobranie maceracja [rozklad części miękkich przy pomocy ługów lub podchlorynów] szlifowanie do uzyskania cienkiej płytki 20-50 mikrometrów), którą montuje się w balsamie kanadyjskim ­- mogą być barwione gencjaną (fioletem goryczki)

b) skrawek - odwapniony (brak składników nieorganicznych, przygotowywany jak zwykły preparat parafinowy) (demineralizacja za pomocą EDTA, kw. azotowego lub trichlorooctowego z jednoczesnym utrwalaniem w formalinie płukanie w alkoholach barwienie

c) demineralizacja kości i zębów:

kwas azotowy V, kwas trójchlorooctowy, EDTA - wersenian sodu (etylenodiaminotetraoctan sodu)

14) METODY BARWIENIA WŁÓKIEN ŁĄCZNOTKANKOWYCH

Włókna kolagenowe	Barwią się kwasochłonnie, eozyną na różowo a Mallory na kolor niebieski
Włókna sprężyste	orceina na kolor brunatny lub rezorcyno - fuksyna na kolor stalowoniebieski.
Włókna retikulinowe	Metoda srebrowa,

15) WYKORZYSTANIE KOLOIDOPEKSJI DO INDENTYFIKACJI KOMÓREK

Koloidopeksja, to zdolność wychwytywania zbędnych ciał koloidowych, znajdujących się w płynach tkankowych, krwi i limfie, dlatego podajemy taki związek, który jest wchłaniany jedynie przez wybrane komórki i jednocześnie nie jest przez nie trawiony - tzn. że staja się zabarwione (np. komórki Browicza - Kupffera w wątrobie)

Dootrzewnowe podanie barwnika (błękit trypanu, błękit toluidyny, błękit metylenowy, tusz chiński, czerwień obojętna, karmin litu).

Można też zastosować przyżyciowo zieleń janusową do mitochondriów lub barwniki fluorescencyjne.

16) MOŻLIWOŚCI UWIDACZNIANIA NACZYŃ KRWIONOŚNYCH NA PREPARATACH HISTOLOGICZNYCH:

a) nastrzyknięcie błękitem metylu na bijącym sercu, następnie masa jest rozprowadzana np. nerka

b) hematoksylina + eozyna

c) metody immunocytochemiczne - markery śródbłonka

17) HYBRYDYZACJA „IN SITU”

Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ (FISH z ang. fluorescent in situ hybridization) jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. W celu analizy badanego materiału konieczne jest użycie mikroskopii fluorescencyjnej.

TECHNIKA: (Najczęściej odpowiednie przygotowanie komórek do badania polega na usunięciu cytoplazmy i utrwaleniu jąder komórkowych na szkiełku podstawowym. Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całość podawana jest krótkotrwałej denaturacji w podwyższonej temperaturze, a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Kolejnym etapem jest usunięcie nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy przez kilkukrotne odpłukanie preparatu i uwidocznienie jąder komórkowych barwnikiem specyficznym dla DNA (przeważnie stosowany jest DAPI). Tak przygotowany preparat można analizować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Popularnymi znacznikami fluorescencyjnymi, używanymi do znakowania sond są rodamina i fluoresceina, a także kumaryna.)

ZASTOSOWANIA:(Technika FISH może być wykorzystana do badania wielu typów komórek i tkanek. Mogą to być limfocyty (jądra metafazowe oraz interfazowe) uzyskane w wyniku hodowli komórkowej, jak również w bezpośrednim rozmazie krwi, rozmazy szpiku kostnego, preparaty moczu, komórki guzów nowotworowych, blastomery, polocyty, czy amniocyty. Możliwa jest także analiza jąder z tkanek zabezpieczonych w blokach parafinowych. Technikę FISH stosuje się chętnie w przypadkach, gdy zawodzi klasyczna analiza cytogenetyczna, innymi słowy gdy w badaniu kariotypu niemożliwe jest ustalenie dokładnego rodzaju bądź miejsca powstania mutacji w genomie. Zastosowanie unikalnych sond umożliwia zlokalizowanie miejsc pęknięć chromosomów czy określenie rodzaju translokacji. FISH jest również narzędziem w badaniu anomalii genetycznych, będących markerami nowotworów (cytogenetyka onkologiczna). Metoda ta, obok techniki PCR, jest także nieocenioną pomocą w diagnostyce preimplantacyjnej, gdzie badanie pojedynczej komórki polocytu czy blastomeru pozwala uniknąć podania zarodka, któremu jeden lub oboje rodzice przekazali określone wady genetyczne (zobacz: zapłodnienie in vitro). W badaniach prenatalnych z wykorzystaniem amniocytów jako analizowanego materiału, możliwe jest określenie wady genetycznej płodu.

chromatyna

Słabo denaturują białka

odwadniają

stosowane jako dodatki do mieszanin

(za mocno utwardzają materiał)

czarne

---