SPRAWOZDANIE NUMER 2

ENZYMY- PRZYKŁADY OZNACZEŃ NIEKTÓRYCH ENZYMÓW.

Natalia Mucha, Laura Pardyak, Justyna Piekara

Część pierwsza: Oznaczanie aktywności katalazy i wyznaczanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej.

Część druga: Oznaczanie aktywności rodanazy.

Część trzecia: Oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej.

Część pierwsza: oznaczanie aktywności katalazy i szybkości początkowej reakcji enzymatycznej.

Wstęp:

Enzymy są katalizatorami reakcji chemicznych zachodzących w układach biologicznych. Są to białka o masie cząsteczkowej pojedyńczego łańcucha polipeptydowego od 9000 ( acylofosfataza) do 155000 (podjednostak beta polimerazy RNA).

Katalaza: białko zawierające hem jako grupę prostetyczną, spełniające funkcję redukcji nadtlenków.

Reakcje enzymatyczne: Przebieg reakcji eznymatycznych charakteryzowany jest przez dwie wielkości- stałą równowagi reakcji i stałą szybkość reakcji.Wszystkie reakcjie odwracalne biegną do osiągnięcia stanu równowagi. Szybkość przemiany substratu w produkt charakteryzuje kinetyczną nietrwałość substratu i jest niezależna od standardowego potencjału termodynamicznego. Aby doprowadzić do zajścia reakcji, zwykle wymagane jest dostarczenie cząsteczce pewnej energii, zwanej energią aktywacji. Każdy katalizator, więc również enzym, działą w ten sposób, że obniża energię aktywacji reakcji, nie wpływając na różnicę jej potencjału termodynamicznego.

Użyty sprzęt labloatoryjny, szkło i odczynniki:

7 zlewek: 6 o pojemności ok.25-50 ml, 1 o pojemności 100 ml.

Pipety automatyczne.

Biureta.

H2SO4; MnSO4; KMnO4; hemolizat krwinek, bufor fosforanowy; nadboran sodu.

Stoper do pomiaru czasu.

Wykonanie:

1. Do przygotowanych 6 zlewek (ponumerowanych), odpipetowano po 2ml 1 molowego H2SO4, z dodatkiem 1% MnSO4.

2. Do zlewki o pojemności 100 ml, dodano 1,5 ml hemolizatu krwinek, który został rozcieńczony 100 razy ( rozcieńczono w następujący sposób: roztwór zawierający 1980 mirolitrów- H2O i 20 mikrolitrów hemolizatu- z tego pobrano 1.5 ml), 15 ml 0,1 molowego buforu fosforanowego i 15 ml nadboranu sodu.

3. Otrzymany roztwór wymieszano dokładnie i zaraz po wymieszaniu pobrano 5 ml roztworu do zlewki numer 1. Pozostałość roztworu była inkubowana w temperaturze pokojowej.

4. Następnie co 3 minuty pobierano kolejne 5 ml inkubowanego roztworu, do zlewek o numerach od 2-6.

5. Zawartość zlewek została miareczkowana 0,02 M KMnO4.

Obliczenia i wnioski:

Rozkład H2O2 przebiega według równania:

H2O2 + H2O2 2 H2O + O2 ↑

Miareczkowanie przebiega zgodnie z równaniem:

2KMnO4 + 5 H2O2 + 3 H2SO4 2 MnSO4 + 5 O2↑ + K2SO4 + 8 H2O

Na podstawie tych równań można obliczyć ile mikromoli H2O2 odpowiada 1 molowi 0.02 M KMnO4, użytego do miareczkowania.

Obliczenia:

C=n/V n= C * V, gdzie C-stężenie molowe KMnO4, V-objętość KMnO4, n- liczba moli.

Podstawiając do wzoru:

n= 0,02 mol/l * 0,001 l=20 mikromoli

Korzystając z równania drugiego ( na podstawie stechiometrii)

obliczono:

2 mole KmnO4 - 5 moli H2O2

20 mikromoli KMnO4 - X

X = 50 mikromoli H2O2

Na tej podstawie obliczono ilość moli H2O2 (podane w kolumnie 4 w tabeli).

Nr.	Czas pobrania ( min. )	Objetość zużytego KMnO4-w mililitrach	Ilość moli H2O2	Ilość H2O2 rozpuszcz. przez enzym
1.	0	2.4	120	0
2.	3	2.0	100	20
3.	6	1.4	70	50
4.	9	0.8	40	80
5.	12	0.5	25	95
6.	15	0.2	10	110

Dla próbki 1: Dla próbki 2:

n= 0.02 M *2.4=0.048 mola=48 mikoromoli n= 0.02 M *2.0=0.04 mola=40 mikoromoli

2 mole KMnO4 - 5 moli H2O2 2 mole KMnO4 - 5 moli H2O2

48 mikromoli KMnO4 - X 40 mikromoli KMnO4 - X

x=120 mikromoli x=100 mikromoli

Dla próbki 3: Dla próbki 4:

n= 0.02 M *1.4=0.028 mola=28 mikoromoli n= 0.02 M *0.8=0.016 mola=16 mikoromoli

2 mole KMnO4 - 5 moli H2O2 2 mole KMnO4 - 5 moli H2O2

28 mikromoli KMnO4 - X 16 mikromoli KMnO4 - X

x= 70 mikromoli x=40 mikromoli

Dla próbki 5: Dla próbki 6:

n= 0.02 M *0.5=0.01 mola=10 mikoromoli n= 0.02 M *0.2=0.004 mola=4 mikoromoli

2 mole KMnO4 - 5 moli H2O2 2 mole KMnO4 - 5 moli H2O2

10 mikromoli KMnO4 - X 4 mikromoli KMnO4 - X

x= 25 mikromoli x= 10 mikromoli

Następnie obliczono ilość H2O2, rozłożonego przez katalazę.

Obliczenia:

120-stężenie początkowe, od niego odejmujemy ilość moli H2O2, charakterystyczną dla danej próbki-jako stężenie po reakcji (kolumna 4 w tabelce- tj. 100; 70; 40; 25; 10). Wyniki podano w tabeli, w kolumnie 5.

Na podstawie uzyskanych danych narysowano wykres zależności liczby mikromoli nadtlenku wodoru rozłożonego przez enzym- katalazę od czasu. ( załącznik nr.1)

Po wykresleniu krzywej, została poprowadzona do niej styczna rozpoczynająca się w punkcie (0.0). Na tej podstawie obliczono szybkość początkową reakcji ( tangens kąta nachylenia stycznej).

V0= tg alfa=a/b=85/9=9,4 mikromola/minutę

Część druga: Oznaczanie aktywności rodanazy.

Wstęp:

Rodanaza- enzymatyczny znacznik mitochondriów wątroby.

Użyty sprzęt labloatoryjny, szkło i odczynniki:

2 zlewki o pojemności 25 ml (jedna przeznaczona na próbę ślepą).

Pipety automatyczne , spektrofotometr.

Homogenat wątroby; woda destylowana; tiosiarczan; KH₂PO₄; KCN; formalina; odczynnik żelazowy.

Wykonanie:

1. Do zlewki o pojemności 25 ml, odmierzono 0,5 ml rozcieńczonego ( 25 razy) enzymu- homogenatu wątroby szczura.( rozcieńczonego według zasady: 1 jednostka objętości homogenatu i 24 jednostki objętości buforu).

2. Po odmierzeniu homogenatu do zlewki odmierzono 1 ml 0,125 M tiosiarczanu i 0.5 ml 0.2 M KH₂PO₄ .

3. Po wymieszaniu dodano 0.5 ml 0.25 M roztworu KCN.

4. Po ponownym wymieszaniu i inkubowaniu roztworu w temp. pokojowej przez 5 minut dodano 0.5 ml formaliny, wstrząśnięto roztworem i dodano 2.5 ml odczynnika żelazowego.

5. W identyczny sposób sporządzono próbkę ślepą,z tą różnicą, że formalinę dodano do roztworu przed KCN.

6. Ponieważ otzrymany roztwór miał barwę czerwonawą rozcieńczono je 25 ml wody destylowanej.

7. Dokonano pomiaru absorbancji przy 460 nm, próbki badanej wobec próbki ślepej.

Obliczenia i wnioski:

Wynik absorbancji: 0,12

Wiadomo, że 1mikromol rozcieńczonego SCN- daje absorbancję 0,11 więc:

absorbancja 0,12---x mikromoli SCN-

absorbancja 0,11--- 1 mikromol SCN-

x= 1,090 mikromola SCN-

1 ml homogenatu--- y mikromoli SCN- 5 minut

0.05 ml homogenatu--- 1.090 mikromoli SCN—5 minut

y=1,090 mikromoli SCN-/ 0.05 ml=21,8 mikromoli SCN- ( w 5 minutach)

więc: 21,8/ 5 min.=4,36 mikromola SCN- ( ilośc mikromoli produktu uwolniowego w 1 minucie, przez enzym.)

Część trzecia: Oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej.

Wstęp:

Dehydrogenaza mleczanowa- enzym działający na chiralny substrat katalizując przemianę kwasu mlekowego w kwas pirogronowy.

Użyty sprzęt labloatoryjny, szkło i odczynniki:

Kuweta kwarcowa, probówka, spektrofotometr, pipety automatyczne.

Woda destylowana, homogenat wątroby, bufor fosforanowy, NADH.

Wykonanie:

1. Sporządzono roztwór rozcieńczonego 20- krotnie wodą destylowaną homogenatu ( rozcieńczono w nastepujący spsób- 20 mikrolitrów homogenatu i 280 mikrolitrów wody destylowanej).

2. Bezpośrednio do kuwety kwarcowej odmierzono 3 ml 0.05 M buforu fosforanowego pH 7,5 zawierającego 3 mM pirogronianu, po czym dodano 0.05 9 Mm NADH i 0,1 ml rozcieńczonego wcześniej homogenatu.

3. Natychmiast po zmieszaniu dokonano pierwszego pomiaru, a kolejnych w odstepach 30 sekund, przez 5 minut.

Obliczenia i wnioski:

Otrzymane wyniki:

1. ( w zerowym czasie): 0,340

2.(po 30 sekundach): 0,290

3.(po 60 s.):0,254

4.(po 90 s.): 0,223

5.(po 120 s.):0,193

6.(po 150 s.):0,184

7.(po 180 s.):0,152

8.(po 210 s.):0,156

9.(po 240 s.):0,153

10.(po 270 s.): 0,157

11.(po 300 s.): 0,152

12.(po 330 s.):0,139

13.(po 360 s.): 0,124

Sporządzono wykres zależności absorbancji od czasu ( załącznik numer 2).

Wartośc A po 1 minucie- 0,254.

---