Przygotowano 11 probówek do sporządzenia krzywej wzorcowej, do pierwszej dodano 0,5μl wody - próba ślepa odczynnikowa, a do reszty dodano odpowiednią ilość roztworu glukozy o stężeniu 200μg/ml i dopełniono daną ilością wody (do końcowej objętości próby 500μl
Nr próbki |
Ilość roztworu glukozy |
Objętość wody |
1.1 |
50 μl |
450 μl |
1.2 |
50 μl |
450 μl |
2.1 |
100 μl |
400 μl |
2.2 |
100 μl |
400 μl |
3.1 |
200 μl |
300 μl |
3.2 |
200 μl |
300 μl |
4.1 |
300 μl |
200 μl |
4.2 |
300 μl |
200 μl |
5.1 |
400 μl |
100 μl |
5.2 |
400 μl |
100 μl |
Przygotowano próbkę badanej surowicy -> 1) próbkę odbiałczano dodając : 750 μl H2O2 , 200 μl 5% ZnSO4, 200 μl 0,35M Ba(OH)2, następnie przygotowano próbę ślepą gdzie zamiast surowicy umieszczono wodę.
Próbkę badaną wykonano w dwóch powtórzeniach
Próbki - badane oraz ślepą odczynnikową odwirowano w wirówce przez 3 min przy obrotach 14 000obr./min.
Po odwirowaniu zebrano po 0,5 ml odbiałczanego roztworu surowicy do dwóch probówek (oraz 0,5ml nadsączu próby ślepej)
Do wszystkich 11 probówek krzywej wzorcowej oraz 3 próbek badanych dodano po 0,5ml odczynnika miedziowego i ogrzewano w łaźni wodnej przez 15 min
Po ochłodzeniu zawartości probówek dodano do wszystkich roztworów po 0,5ml odczynnika arseno-molibdenowego oraz po 3,5ml wody
Zmierzono absorbancję prób przy długości fali λ=520nm (względem próby ślepej)
Obliczono stężenie glukozy we wszystkich próbach krzywej wzorcowej w następujący sposób:
200 μg glukozy znajduje się w 1ml czyli 200 μg jest w 1000 μl, więc ile jest glukozy kolejno w 50, 100, 200, 300 i 400 μl?
200 μg - 1000 μl
X - 50 μl
X= 10 μg
Mamy więc 10 μg glukozy w 50 μl dodanych do 450 μl wody czyli mamy 10 μg w 500 μl, więc:
10 μg - 500 μl
X - 1000 μl
X= 20 μg/ml
Analogicznie wykonano obliczenia dla pozostałych roztworów i otrzymano wyniki:
Roztwór gdzie dodano 100 μl glukozy ma końcowe stężenie 40 μg/ml, 200 μl - 80 μg/ml,
300 μl- 160 μg/ml, 400 μl - 320 μg/ml.
Otrzymane dane pomiaru absorbancji umieszczono w tabeli:
Próba |
Stężenie glukozy [μg/ml] |
Absorbancja |
średnia |
Ilość glukozy [μg] |
Badana 1 |
x |
0,121 |
0,1305 |
|
Badana 2 |
x |
0,140 |
|
|
1.1 |
20 |
0,101 |
0,111 |
|
1.2 |
20 |
0,121 |
|
|
2.1 |
40 |
0,236 |
0,217 |
|
2.2 |
40 |
0,198 |
|
|
3.1 |
80 |
0,352 |
0,362 |
|
3.2 |
80 |
0,372 |
|
|
4.1 |
160 |
0,569 |
0,585 |
|
4.2 |
160 |
0,609 |
|
|
5.1 |
320 |
0,808 |
0,784 |
|
5.2 |
320 |
0,760 |
|
|
Tabela 2. wartość absorbancji w zależności od stężenia glukozy w roztworze.
Dla wartości absorbancji obliczono odchylenie standardowe ze wzoru :
σ = ΣA/N-1
σ = 0,457667
Z wykresu 1. wynika, że w badanej próbie ilość cukru wahała się od 10-18 mikrogramów. Wiedząc, że w surowicy zdrowego człowieka ilość glukozy waha się w granicach 3,6-6,1mM, możemy obliczyć:
Masa cząsteczkowa glukozy = 180 g/mol = 180 000 000 μg
1mol - 180g
1000mM - 180 000 000
Więc:
1000 mM - 180 000 000
X - 18 μg
X =
Lub
x mM- 10 μg
To x =