Natalia Maciejewska, Paulina Rusinek, Aleksandra Smędzik gr. Pon. 12.15

1. Oznaczanie aktywności katalazy (EC 1.11.1.6) i wyznaczanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej.

Cel : Katalaza czyli oksydoreduktaza nadtlenek wodoru : nadtlenek wodoru jest to hemoproteina rozkładająca nadtlenek wodoru wg następującej reakcji :

H₂O₂ + H₂O₂ -> 2 H₂O + O₂↑

Celem ćwiczenia było poznanie szybkości rozkładu nadtlenku wodoru zawartego w roztworze hemolizatu krwinek przez katalazę.

- Wykonano 200-krotne rozcieńczenie hemolizatu krwinek

- Do 6 zlewek o pojemności ok. 25-50 ml odpipetowano po 2 ml 1 M H₂SO₄ z dodatkiem 1% MnSO₄.

- Przygotowano także mieszaninę reakcyjną -> 1,5 ml rozcieńczonego hemolizatu krwinek + 15 ml 0,1 M buforu fosforanowego + 15 ml nadboranu sodu

- Natychmiast do 1 zlewki zawierającej kwas i katalizator odpipetowano 5 ml mieszaniny reakcyjnej. Resztę mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej i co 3 minuty pobierano próbę i umieszczano ją w kolejnych zlewkach.

- Zawartość zlewek miareczkowano 0,02 M KMnO₄

- Otrzymano następujące wyniki:

Tabela 1. Zależność zużytego titranta a ilość rozłożonego nadtlenku wodoru

Numer zlewki	Ilość KMnO4 [ml]	μmol H2O2
1	2,75	137,5
2	1,8	90
3	0,95	47,5
4	0,65	32,5
5	0,4	20
6	0,25	12,5

Wykres 1. Wykres zależności ubytku substratu od czasu.

- Wniosek z ćwiczenia : Im dłużej reakcja enzymatyczna w roztworze nie została zahamowana działaniem kwasu siarkowego, tym więcej cząsteczek substratu zostało rozłożonych na tlen i wodę. Obserwujemy to dzięki spadającej zawartości nadtlenku wodoru w roztworach.

---