OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PSII.

Wstęp:

PSII-inaczej fotosystem II.Jest to jeden z dwóch kompleksów barwnikowo-białkowych aparatu fotosyntetycznego. PSII działa z maksymalną wydajnością przy długości fali 680 nm. Fotoukład PSII występuje głównie w tylakoidach gran. Charakterystyczne dla fotoukładu II są układy antenowego określane nazwą - LHC II, w których stosunek chlorofilu a do chlorofilu b wynosi: a:b = 1:1. PSII katalizuje indukowane światłem przeniesienie elektronów z utlenionej cząsteczki wody (donora) na pulę plastochinonu rozpuszczalnego w dwuwarstwie lipidowej chinonu. Aktywnośc PSII można zdefiniowac jako ilośc elektronów przeniesionych z wody na plastochinon w jednostce czasu , przeliczoną na jednostkę masy chlorofilu w próbce.

Wykonanie:

• Przed przystąpieniem do oznaczania aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę, wykonano izolację błon tylakoidów z liści sałaty zgodnie z instrukcją zawartą w rozdziale 9.1 (,,Praktikum z biochemii” pod zbiorową redakcją Amalii Guzdek i Pawła Maka).

• Po wyizolowaniu błon tylakoidów przystąpiono do oznaczenia zawartości chlorofilu w zawiesinie:

• Po dokładnym wymieszaniu zawiesiny tylakoidów uzyskanej wcześniej, odpipetowano po 400 mikrolitrów tej zawiesiny do przygotowanych wcześniej 2 probówek typu Eppendorf.

• Do każdej dodano po 1600 mikrolitrów acetonu

• Odwirowano je przez 5 minut(10000 obr./min.), a następnie zmierzono absorbancję wzgledem 80% acetonu przy 3 długościach fali: 645, 663, 710 ( poziom tła).

• Wyniki zestawiono W tabeli numer 1.

Tabela nr.1

Długośc fali	Wynik pomiaru absorbancji
645	0,462
663	1,114
710	-0,013

Następnie obliczono stężenie chlorofilu a i b.

Stężenie chlorofilu a i b:

C_{Chl (a+b)} = 20,2 (A645-A710) + 8,02(A663-A710)

CChl (a+b) = 20,2 * (0,462+0,013) + 8,02 *(1,114+0,013)=18,63354 μg/ml masy

Przystąpiono do oznaczania aktywności PSII.

• Przygotowaną wcześniej zawiesinę błon tylakoidów, rozcieńczono buforem 10 mM Tricyna-NaOH pH 7,7 z dodatkiem 1mM MgCl.2

• Próbkę przygotowano i przechowywano w lodzie, bez wystawiania na działanie światla.

18,63 µg ---1ml

x --- 7ml

x=130.41

130, 41/2 = 65,205 to jest ilośc chlorofilu a i b, znajdującgo się w 500 µl roztworu-uzyskaliśmy go po pobraniu połowy roztworu powstałego po połączeniu 400µl zawiesiny i 1600 µl acetonu stąd wynika,że w 500 µl roztworu jest 100µl zawiesiny chloroplastów.

400 - 1600 ul

X - 100 000 ul

X = 25 000 ul = 25 ml

Więc ostateczne stężenie:

65,205 µg---100 µl

x --- 1000 µl x= 652,05 µg- stężenie= 652,05 µg/ ml

Zgodnie z założeniem, że stężenie chlorofilu w próbce ma się zawierac w granicy 20-40 µg/ml, obliczono:

40 µg---1ml

x ---10ml x=400 µg

597,6 µg ---1ml

400 µg ---x x=0,669-tyle pobrano roztworu i uzupełniono 9,33 ml buforu

Ponieważ po pobraniu 1,9 roztworu, stęzenie było zbyt duże więc do 8,1 dodano 3 ml buforu:

40 µg---1ml

x ---8,1 ml x=324-masa chlorofilu

- następnie pobrano 1,5 ml roztworu i wymieszano z 1,5 ml buforu:

324---11,1

x---1,5 x=43,78-w 3ml roztworu w 1ml roztworu-14,5 µg

- z tego pobrano 1,92 ml 14,5—1ml, więc w 1,92 mamy 27,84 µg chlorofilu w ml uzyskanego roztworu.

• Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzono 0,5 ml zawiesiny i 1,5 ml buforu E i 100 mikrolitrów DCIP.

• Próbkę umieszczono w spektrofotometrze i dokonano pomiaru absorbancji przy długości fali=590 nm.

• Po pierwszym pomiarze próbkę wyciągnięto ze spektrofotometru , oświetlono ją wysycającym światłem białym przez czas=30 sekund, ponownie dokonano pomiaru absorbancji.

• Wykonano 3 pomiar absorbancji przy wcześniejszym podaniu do kuwety DCIP. Zmierzono absorbancję bezpośrednio po wymieszaniu składników, oraz po naświetleniu próbki przez 30 sekund - próba III- hamowanie aktywności PSII przez DCMU

• Wszystkie wyniki zestawiono w tabeli numer 2.

Tabela nr.2

	A	B	C	D
T [s]	λ=590nm	Zawiesina z DCMU	λ =590nm + DCIP 1900ul zawiesiny + 100ul DCIP	+DCMU 1850ul zawiesiny + 50ul DCMU + 100ul DCIP
0	0,473	0,431	0,441(A0)	0,456
30	0,266	0,423	0,237(A1)	0,448
60	0,082	------	0,052	------

Na podstawie wyników tabeli sporządzono wykresy zależności A(absorbancji) od T (czasu).

Wykres numer 1-zależnośc absorbancji od czasu dla próby A.

Wykres numer 2- zależnośc absorbancji od czasu dla próby B.

Wykres numer 3-zależnośc absorbancji od czasu dla próby 3.

Wykres numer 4-zależnośc absorbancji od czasu dla próby D.

Obliczenia:

A₀= 0,441

A₁= 0,237

∆A= 0,441-0,237 = 0,204

Na podstawie zmiany absorbancji obliczono zmianę stężenia DCIP:

Δc = ΔA/(k x l)

kDCIP=16000M-1cm-1

l=1 cm

Δc=0,204/(16000M-1cm-1 x 1 cm) = 1,27 * 10 ^-5mol/dm³= 12,7 μmol/dm³

Obliczono mase cząsteczkową chlorofilu (a+b) korzystając z następujących danych:

MChl a =893,5 g/mol

MChl b=907,5 g/mol

Chlorofil a :Chlorofil b = 3:1

M_Chl(a+b) =0,75 x 893,5 g/mol +0.25 x 907,5 g/mol = 897g/mol

Stężenie rozcieńczonej buforem zawiesiny błon tylakoidów = 30µg/ml, zatem ilość chlorofilu w pobranej próbce jest równa:

30µg - 1 ml

X µg - 1,9 ml

X= 57 µg

Co za tym idzie stężenie chlorofilu po dodaniu 0,100 ml DCIP wynosi:

C = 57 µg /2 ml = 28,5 µg/ml

Następnie obliczono ilość moli chlorofilu zawartych w 1000 ml (1 dm3) r-ru:

28,5 µg -1 ml

X µg-1000ml

X=28 500 µg

1 mol - 8,97 x 108µg

X moli - 1,944 x 104 µg

X=2.17 x 10-5 mola= 21,7µmola

Ostatecznie ustalono ile e (wartość DCIP x 2, bo podczas reakcji dochodzi do przeniesienia dwóch elektronów) w ciągu 1 s przenosi jedna cząsteczka chlorofilu w tym doświadczeniu:

15 µmol/litr DCIP - 21,7 µmol/litr Chlorofilu w ciągu 60 s

30 µmol e—21,7µmol chlorofilu w czasie 60s

1,38 cząsteczek e - 1 cząsteczka chlorofilu w ciągu 60 s

0,02 cząsteczek e - 1 cząsteczka chlorofilu w czasie 1 s

4 ) Hamowanie aktywności PSII przez DCMU

Do 1850 µl rozcieńczonej buforem 10 mM Tricyna-NaOH pH 7,7+1 mM MgCl2 zawiesiny tylakoidów dodano 100 µl DCIP i 50 µl DCMU. Zmierzono absorbancję(A0) zaraz po wymieszaniu, a następnie po 30 s oświetlania (A1):

A0 =0,456

A1=0,448

ΔA=0,008

Obliczono o ile procent została zahamowana aktywność fotochemiczna PSII po dodaniu DCMU:

ΔA/A0 x 100 % =0,008/0,456 x 100 %=1,75%

Wnioski:

a) DCMU hamuje działanie PSII(staje się inhibitorem reakcji).

b) do pomiaru I i II-w miarę naświetlania probówki spada wartośc absorbancji DCIP, światło wysyca PSII

c) Na podstawie Tabeli 2, w próbie bez DCIP oraz z DCIP chloroplasty są aktywne - można to zaobserwować dzięki spadkowi absorbancji.

W próbkach do których dodano DCMU można zaobserwować zahamowanie przebiegu reakcji - DCMU działa jak inhibitor dla chlorofilu.

---