MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA W OCHRONIE ŚRODOWISKA

Ćwiczenie 3

Temat:

Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych - kolorymetryczne oznaczanie stężenia katecholu oraz fenolu w założonych hodowlach (cz. 3).

Zagadnienia teoretyczne:

• materiał obowiązujący na ćwiczeniu numer 2,

• komórka prokariotyczna i jej elementy składowe,

• rodzaje adaptacji mikroorganizmów (genetyczna, socjologiczna, fizjologiczna),

• definicja biodegradacji i bioaugmentacji,

Część praktyczna:

Materiały:

• probówki

• pipety 100µl, 200 μl, 500 μl, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml

• spektrofotometr

• para-nitroanilina

• 2% roztwór NaNO₂

• 10% Na₂CO₃

• 10% NaOH

• woda destylowana

• 10% molibdenian sodu

• 0,5 M HCl

Procedura:

Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fenolu i katecholu:

• do probówek odmierzyć odpowiednie objętości poszczególnych roztworów, zgodnie z tabelkami zamieszczonymi na kartach pomiarowych,

• zmierzyć ekstynkcję przy odpowiedniej długości fali ( dla fenolu λ = 550 nm, dla katecholu
  λ = 480 nm),

• zrobić wykres krzywej kalibracyjnej. Stężenie fenolu oraz katecholu obliczać z otrzymanego równania krzywej.

A. Oznaczanie stężenia fenolu w założonych hodowlach:

• do oznaczanie stężenia fenolu wykorzystano metodę polegającą na barwnej reakcji jednowodorotlenowych fenoli z dwuazowaną para-nitroaniliną w środowisku alkalicznym.

• do probówki pobrać 1 ml supernatantu i dodać 4 ml wody destylowanej (możliwe, że będzie wymagane przygotowanie rozcieńczenia 0,1 ml supernatantu i 4,9 ml wody destylowanej).

• do tak przygotowanej próbki dodać 1 ml zdwuazowanej para-nitroaniliny. Dwuazowanie polega na wprowadzeniu do odpowiedniej objętości para-nitroaniliny kroplami 2% NaNO₂ aż do odbarwienia roztworu.

• kolejno dodać 0,5 ml 10% Na₂CO₃ i 1 ml 10% NaOH.

• tak przygotowaną mieszaninę uzupełnić do 10 ml wodą destylowaną.

• w spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej, w której supernatant zastąpić wodą destylowaną.

• stężenie fenolu odczytać na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.

B. Oznaczenie stężenia katecholu w założonych hodowlach:

• do probówki pobrać 1 ml supernatantu (możliwe, że będzie wymagane przygotowanie rozcieńczenia 0,1 ml supernatantu i 0,9 ml wody destylowanej).

• dodać kolejno 1 ml 10% Na₂MoO₄ · 2H₂O, 0,5 ml 0,5 M HCl, 0,5 ml NaNO₂ oraz 1 ml 10% NaOH.

• w spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy długości fali 480 nm wobec próby ślepej, w której supernatant zastąpić wodą destylowaną. Stężenie katecholu odczytać na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.

LITERATURA ŹRÓDŁOWA:

1. KUNICKI-GOLDFINGER W.: „Życie bakterii” -  Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005

2. CHMIEL A.: „Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1998

3. RÓŻALSKI A.: „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej” - Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996

4. SCHLEGEL G. H.: „Mikrobiologia ogólna” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

5. Źródła internetowe

6. MIKSCH K.: „Laboratorium podstaw biochemii technicznej” - Dział Wydaw. Politechniki Śląskiej, Gliwice 1978