MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA W OCHRONIE ŚRODOWISKA

Ćwiczenie 2

Temat:

Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych - identyfikacja szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu katecholu oraz fenolu (cz. 2)

Zagadnienia teoretyczne:

• budowa ściany komórkowej bakterii gramdodatnich oraz gramujemnych, barwienie Grama

• węglowodory aromatyczne pochodzenia antropogenicznego i ich wpływ na organizmy żywe

• drogi rozszczepienia pierścienia aromatycznego (rozszczepienie typu orto i meta)

Część praktyczna:

Materiały:

• szkiełka podstawowe

• odczynniki do barwienia Grama

• sól fizjologiczna, eza

• denaturat

• testy API 20NE - pokazowe

• przygotowane, posiane skosy do założenia hodowli

• kolby z płynną pożywką Kojima

• sterylne pipety 5 ml

• pipety automatyczne, końcówki

• 0,25 M roztwór fenolu

• 0,5 M roztwór katecholu

Procedura:

IDENTYFIKACJA SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH:

• z uzyskanych hodowli płytkowych (cz.1) wybrać pojedyncze kolonie bakterii i oczyścić metodą posiewu redukującego na płytkach z zestalonym bulionem agarowym oraz przesiać na skos agarowy. Inkubować 48 godzin.

• Ze skosu oraz z płytki posianej redukcyjnie pobrać niewielką ilość materiału i wykonać rozmaz, na podstawie barwienia metodą Grama zaklasyfikować wyizolowane bakterie do grupy bakterii gramujemnych lub gramdodatnich.

ODCZYT PRZYGOTOWANYCH TESTÓW API 20 NE:

• przeprowadzono charakterystykę biochemiczną i fizjologiczną wybranych szczepów G(-), wyizolowanych z prób środowiskowych, w oparciu o test kodowy API 20 NE firmy BioMerieux Marcy I'Etoile (Francja), który służy do oznaczania pałeczek gramujemnych, nie należących do rodziny Enterobacteriaceae. Test wykonano zgodnie z instrukcjami i w oparciu o odczynniki, podane przez producenta

• po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 30^oC należy odczytać wynik w postaci siedmiocyfrowego kodu, odpowiadającemu poszczególnym rodzajom i gatunkom bakterii, opisanym w katalogu API 20 NE.

ZAŁOŻENIE HODOWLI:

• bakterie wyrosłe na skosach agarowych w sterylnych warunkach spłukać do kolby zawierającej pożywkę Kojima.

• oznaczyć spektrofotometrycznie gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm wobec próby ślepej (wody destylowanej).

• do każdej kolby dodać odpowiednio taką objętość 0,25 M roztworu fenolu lub 0,5 M katecholu aby stężenie substratu w kolbie wynosiło 5 mM (objętość podłoża wynosi 100 ml).

• hodowlę prowadzić przez tydzień.

LITERATURA ŹRÓDŁOWA:

1. KUNICKI-GOLDFINGER W.: „Życie bakterii” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005

2. CHMIEL A.: „Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1998

3. RÓŻALSKI A.: „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej” - Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996

4. SCHLEGEL G. H.: „Mikrobiologia ogólna” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

5. Źródła internetowe