KULTURY KOMÓRKOWE I TKANKOWE ZWIERZĄT

INSTRUKACJA DO ĆWICZENIA IV

ZAKŁADANIE HODOWLI PIERWOTNEJ KOMÓREK MACIERZYSTYCH

SZPIKU KOSTNEGO SZCZURA

1. Kości udowe i piszczelowe szczura umieścić w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) suplementowanym antybiotykami.

2. Przenieść kości do zlewki zawierającej PBS z antybiotykami.

3. Przenieść kości na sterylną szalkę. Obciąć nasady kości udowych i piszczelowych.

4. Przy pomocy strzykawki i igły przepłukać jamy szpikowe kości medium hodowlanym.

5. Zawiesinę komórek szpiku kostnego przenieść do sterylnej probówki i odwirować (5min., 2500 rpm).

6. Zlać supernatant, a osad zawiesić w 5 ml PBS.

7. Zawiesinę komórek ponownie odwirować (5min., 2500 rpm).

8. Zlać supernatant, a osad zawiesić w 2 ml medium hodowlanego.

9. Zawiesinę komórek przenieść do butelek hodowlanych zawierających 5 ml czystego medium hodowlanego.

Odczynniki:

- zbuforowany roztwór soli fizjologicznej bez jonów Ca²⁺ i Mg²⁺ (PBS) z dodatkiem antybiotyków (penicylina, streptomycyna, amfoterycyna B)

- medium hodowlane (DMEM/F-12, Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12) z suplementami:

• 10% surowicy płodowej wołowej (FBS, Fetal Bovine Serum)

• penicylina (100 IU/ml)

• streptomycyna (100 µg/ml)

• amfoterycyna B (2,5 µg/ml)

Materiały:
- narzędzia (pęsety, nożyczki)
- strzykawka i igła
- sterylne szalki Petriego
- sterylne probówki
- sterylne butelki hodowlane
- zlewka na zużyte płyny