popraw. 06 GESE str. 651-659

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str. 651–659

PRACA POGLĄDOWA – Review Article

ANNA GESE, KATARZYNA ROSZEK

Metody wydajnej izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzy-
stych z krwi pępowinowej

Methods of efficient isolation and culture of umbilical cord blood mesenchymal
stem cells

Zakład Biochemii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik Zakładu: Dr hab. Michał Komoszyński, prof. UMK

STRESZCZENIE

Krew pępowinowa jest jednym z najwaŜniejszych i najłatwiej dostępnych źródeł mezenchymalnych komórek macie-
rzystych (MSC, ang. mesenchymal stem cells). MoŜe być wykorzystywana w terapii wielu chorób, jednak jej zasto-
sowanie jest ograniczone głównie do dzieci. Wynika to z mniejszej ilości komórek macierzystych w porównaniu na
przykład ze szpikiem kostnym. Z tego względu niezwykle istotne jest poznanie biologii komórek MSC, identyfikacja
czynników pozwalających na ich efektywną izolację z krwi pępowinowej oraz hodowlę i namnaŜanie tych komórek
w warunkach in vitro.

SŁOWA KLUCZOWE: Mezenchymalne komórki macierzyste – Krew pępowinowa

SUMMARY

Umbilical cord blood is one of the most important and most readily available source of mesenchymal stem cells
(MSC). It can be used in the treatment of many diseases, although its application is restricted mainly to children. This
is caused by the lower availability of stem cells in this particular type of body fluid (that is umbilical cord blood) in
comparison with other sources of MSC, such as bone marrow. Therefore, it is crucial to understand the biology of
MSC in order to identify the factors enabling their effective isolation from cord blood as well as the culture and proli-
feration of these cells in vitro.

KEY WORDS: Mesenchymal stem cells – Umbilical cord blood

WSTĘP

DuŜym zainteresowaniem badaczy w ostatnich latach cieszą się multipotencjalne mezenchymalne

komórki macierzyste (MSC, ang. mesenchymal stem cells). W terminologii naukowej nazywa się je
takŜe komórkami mezenchymalnymi stromy (MSC, ang. mesenchymal stromal cells) [1]. Określa się je
jako niehematopoetyczne [2, 5], niezróŜnicowane [6, 7], mononuklearne [8, 9] komórki zdolne do ad-
hezji do plastiku [2-5, 8, 10-15]. W warunkach in vitro dzielą się z duŜą szybkością [4, 9], tworząc ko-
lonie wydłuŜonych komórek wrzecionowatych o morfologii zbliŜonej do fibroblastów [2, 9, 12-16]
o długości 0,1-0,7 mm [17].

MSC występują w tkankach większości narządów dorosłych osobników, w których są róŜnorodnie

rozmieszczone [15]. Do roku 2007 udało się je zlokalizować we wszystkich analizowanych tkankach,
zarówno pochodzących od myszy jak i od człowieka [9, 18]. Najwcześniej odkrytym, a zarazem głów-
nym ich źródłem jest jednak szpik kostny [3-5, 12, 15, 18-20]. Pierwsza udana izolacja MSC z tego
ź

ródła miała miejsce w 1976 roku i przeprowadził ją Friedenstein i wsp. [4].

MSC cechuje ogólna multipotencja [4, 10, 15]. NiezaleŜnie od rodzaju subpopulacji, komórki te

wykazują zdolność do róŜnicowania w komórki pochodzenia mezodermalnego, takie jak: osteocyty,

A. GESE, K. ROSZEK

652

chondrocyty oraz adipocyty [2-6, 8-10, 13-17, 19, 21]. Zmiana fenotypu na bardziej wyspecjalizowany
zachodzi w specyficznych warunkach in vitro i in vivo [3, 14, 15]. Ponadto róŜne grupy badawcze po-
twierdziły  zdolność  MSC  do  róŜnicowania  w  kierunku  innych  tkanek  pochodzenia  mezodermalnego
(np.  komórki  mięśniowe,  kardiomiocyty,  ścięgna,  więzadła,  komórki  stromy),  ektodermalnego  (np.
neurony,  oligodendrocyty,  astrocyty,  komórki  glejowe)  oraz  endodermalnego  (np.  hepatocyty)  [9,  13,
16, 22].

Określenie warunków efektywnej izolacji, hodowli i kontrolowanego róŜnicowania niezróŜnicowa-

nych komórek jest kwestią kluczową dla rozwinięcia przyszłych zastosowań klinicznych w sferze na-
prawy i regeneracji tkanek łącznych. Wyzwaniem jest takŜe utrzymanie w hodowli multipotencjalności
uzyskanych komórek macierzystych [2]. Między innymi z tego powodu przeprowadza się próby izolacji
MSC z innych tkanek. Do tej pory udało się ustalić, Ŝe ich źródłem mogą być: maź stawowa oraz błona
maziowa, okostna, tkanka chrzęstna, mięśnie szkieletowe, ścięgna, tkanka tłuszczowa, tkanki płodowe
(w tym np. wątroba), łoŜysko, krew płodowa, płyn owodniowy, błona owodniowa, błona kosmówkowa,
pępowina wraz z galaretą Wharton’a, krew pępowinowa), krew obwodowa, trzustka, stroma śledziony,
stroma grasicy, skóra, istota gąbczasta kości, płuca, endometrium, miazga zębowa, zęby mleczne [2, 4,
15, 18, 22].

Krew pępowinowa jako źródło komórek macierzystych

Krew pępowinowa stanowi część krwi wytworzonej przez rozwijający się płód w trakcie trwania

ciąŜy. Podczas Ŝycia płodowego jest ona konieczna do prawidłowej wymiany tlenu oraz substancji od-
Ŝ

ywczych między matką a płodem. Wymiana ta zachodzi za pośrednictwem pępowiny, przy czym sama

krew pępowinowa nie miesza się z krwią matki.

Po porodzie krew pępowinowa pozostaje w sznurze pępowinowym oraz w naczyniach części pło-

dowej łoŜyska [6, 17, 22]. Pomimo udowodnionej znacznej zawartości komórek macierzystych [23],
krew pępowinowa wraz z łoŜyskiem stanowi najczęściej odpad biologiczny i zwykle jest poddawana
utylizacji [22].

Krew pępowinową moŜna pobierać zarówno podczas porodu odbywającego się siłami natury [7, 22,

24], jak i w trakcie cesarskiego cięcia [22, 25]. W drugim przypadku wiąŜe się to jednak ze zmniejsze-
niem  liczby  białych  krwinek  na  mililitr  pobranej  krwi  pępowinowej  [25].  W  większości  przypadków
krew pępowinowa jest pobierana przed urodzeniem łoŜyska [7, 19, 26], jednak w sytuacji, gdy proces
pobierania  krwi  zakłócałby  przebieg  porodu,  krew  pępowinową  uzyskuje się  z  łoŜyska,  które  po jego
urodzeniu  umieszcza  się  na  specjalnym  statywie  [11,  26].  Następująca  po  pobraniu  preparatyka  krwi
pępowinowej  jest  procesem  wieloetapowym,  obejmującym  izolację  komórek  mononuklearnych  i
oczyszczanie populacji komórek macierzystych. Liczba uzyskanych w ten sposób komórek macierzys-
tych zaleŜy od umiejętności pobierającego, a takŜe od takich czynników jak: wielkość łoŜyska i pojem-
ność jego naczyń, długość sznura pępowinowego, czas trwania porodu oraz czas krzepnięcia krwi.

Krew pępowinowa jest waŜnym, szeroko akceptowanym źródłem hematopoetycznych komórek

macierzystych  [17,  19],  dlatego  coraz  częściej  zostaje  ona  pobierana  podczas  porodu  i  następnie  gro-
madzona  w  bankach  krwi  pępowinowej  [23].  Na  świecie  do  roku  2004  pobrano,  zamroŜono  i  nadal
przechowuje  się  ponad  100000  jednostek  krwi  pępowinowej  [6],  które  mogą  zostać  wykorzystane  do
przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych zarówno u dzieci, jak i u dorosłych [19].

Krew pępowinowa jest trzecim pod względem waŜności źródłem komórek macierzystych wykorzy-

stywanych do transplantacji. Pozostałymi dwoma są szpik kostny oraz krew obwodowa [9]. Do prze-
szczepu moŜna wykorzystać zarówno całkowitą krew pępowinową, jak i wysoko oczyszczone popula-
cje komórek macierzystych, czy nawet pojedyncze komórki [9]. Do 2003 roku na świecie przeprowa-
dzono 3000 autologicznych i allogenicznych przeszczepów krwi pępowinowej [11], natomiast do roku
2008 liczba ta wzrosła do prawie 8000 [13].

W 1994 roku ukazało się doniesienie dotyczące moŜliwości uzyskania z krwi pępowinowej komó-

rek adherentnych stromy, co udało się wstępnie potwierdzić w roku 2000 [12]. 3 lata później krew pę-

Metody wydajnej izolacji i hodowli

653

powinowa została uznana za alternatywne źródło MSC, zarówno do przeszczepów auto-, jak i alloge-
nicznych [11, 14, 19]. Obecnie nie jest znane dokładne pochodzenie MSC krwi pępowinowej, jednak
sugeruje się, Ŝe komórki te wywodzą się z płodowej wątroby lub szpiku kostnego i w trakcie Ŝycia pło-
dowego zostają uwolnione do krwioobiegu płodu, skąd trafiają do krwi pępowinowej [21, 27].

W porównaniu z innymi źródłami komórek macierzystych, krew pępowinowa ma wiele zalet [9, 11,

20]. Jedną z nich jest fakt, Ŝe obecne w niej komórki macierzyste są mniej dojrzałe zarówno pod wzglę-
dem stopnia zróŜnicowania, jak i pod względem immunologicznym [9, 22, 27]. Komórki  macierzyste
krwi pępowinowej wykazują takŜe większy potencjał proliferacyjny w porównaniu z dorosłymi komór-
kami macierzystymi [11]. Szybsze tempo podziałów oraz mniejsza dojrzałość komórek macierzystych
z krwi pępowinowej wynikają z obecności w tych komórkach dłuŜszych odcinków telomerowych, bę-
dących  skutkiem  obecności  aktywnej  telomerazy.  Dodatkowo  genom  komórek  macierzystych  z  krwi
pępowinowej  nie  wykazuje  cech  starzenia  się,  co  stwierdza  się  na  postawie  znikomego  (bądź  braku)
stopnia uszkodzenia materiału genetycznego spowodowanego promieniowaniem, mutagenami środowi-
skowymi lub błędami powstałymi w trakcie replikacji DNA oraz podziału chromosomów [11].

Korzystnym aspektem wykorzystania komórek macierzystych z krwi pępowinowej do transplantacji

jest takŜe fakt, Ŝe proces ten obarczony jest niskim ryzykiem odrzucenia przeszczepu [9, 20]. Stąd teŜ
moŜliwe jest wykonanie transplantacji komórek krwi pępowinowej od niespokrewnionego dawcy, po-
siadającego do dwóch niedopasowań w układzie antygenów HLA. Ostatecznie prowadzi to do znaczne-
go poszerzenia puli dostępnych dawców [20, 22].

Kolejną zaletą komórek macierzystych z krwi pępowinowej jest większa prostota i nieinwazyjność

metody  pobrania  materiału  biologicznego  w  porównaniu  z  innymi  tkankami,  takimi  jak  szpik  kostny
czy  tkanka  tłuszczowa  [21,  22].  Obecnie  ze  względu  na  niewielką  liczbę  MSC  w  jednej  porcji  krwi
pępowinowej  [21,  26,  28],  transplantacje  komórek  macierzystych  z  tego  źródła  stosuje  się  głównie
w przypadku dzieci [11]. Wynika to z faktu, Ŝe do przeprowadzenia transplantacji komórek macierzys-
tych z krwi pępowinowej niezbędna jest odpowiednia ilość komórek jądrzastych, wynosząca 2,5×10

kilogram masy ciała pacjenta [26]. Równocześnie trwają jednak badania nad namnaŜaniem pozaustro-
jowym komórek macierzystych, co wraz z moŜliwością łączenia kilku jednostek krwi od róŜnych daw-
ców, moŜe spowodować rozszerzenie puli odbiorców tej metody leczenia takŜe o osoby dorosłe [11,
26].

Mezenchymalne komórki macierzyste

Populacja MSC pochodzących z jednego źródła jest heterogenna. Do tej pory nie udało się bowiem

zdefiniować markera powierzchniowego charakterystycznego dla tych komórek, który tym samym po-
zwalałby na standaryzację procedur ich izolacji z róŜnych źródeł [2, 3, 5, 9]. Prawdopodobną tego przy-
czyną jest fakt, Ŝe MSC dzielą pewne cechy z komórkami endotelialnymi, epitelialnymi oraz mięśnio-
wymi [2]. Dodatkowym utrudnieniem jest zmiana fenotypu MSC w trakcie ich hodowli w warunkach
in vitro [3].

MSC nie posiadają takich antygenów, jak: CD45 (wspólny antygen leukocytarny), CD34 (sialomu-

cyna,  prymitywny  marker  ludzkich  hematopoetycznych  komórek  macierzystych),  CD14  (receptor
LPS), CD11b (marker komórek odpornościowych), CD235 (glikoforyna A, marker linii erytroidalnej),
Ter119,  CD31,  MHC  klasy  II  [2,  9,  10,  16,  22].  Na  powierzchni  tych  komórek  występują  natomiast:
CD73  (ekto-5’nukleotydaza),  STRO-1,  CD105  (endoglina),  CD44,  CD29,  CD90/Thy-1,  CD106
(VCAM-1), CD27, CD271, CD13, Sca1, CD10, CD166, HLA klasy I [3, 5, 9, 10, 16, 22]. Szczególne
zainteresowanie  wzbudza  antygen  CD146,  wykazujący  zmienną  ekspresję  w  MSC.  Sugeruje  się  bo-
wiem, Ŝe moŜe on stanowić marker multipotencji tych komórek [21].

Na immunofenotyp komórek wpływa wiele czynników. Z punktu widzenia hodowli MSC w warun-

kach in vitro, najbardziej znaczącym jest jego zmienność pod wpływem trwania samej hodowli [3].
Poza tym na ekspresję markerów powierzchniowych wpływają takŜe inne czynniki, jak rodzaj tkanki

A. GESE, K. ROSZEK

654

ródłowej, wiek dawcy, rodzaj przeciwciał stosowanych do izolacji, senescencja w hodowli in vitro,

rodzaj zastosowanej poŜywki czy jej suplementacja [18].

Podczas hodowli in vitro, wzrastające komórki MSC naleŜy analizować pod względem cząsteczek

zaliczanych  do  negatywnych  markerów  MSC,  obecnych  na  powierzchni  tych  komórek,  które  mogą
przypadkowo zostać wyizolowane wraz z MSC. Do tych typów komórek naleŜą: komórki dendrytyczne
(CD1a,  CD33),  monocyty  (CD14,  CD33), limfocyty  (CD3,  CD45),  hematopoetyczne  komórki  macie-
rzyste (CD34). Ze względu na brak charakterystycznego markera, a takŜe na róŜnice w fenotypie komó-
rek  MSC,  koniecznym  elementem  oceny  jakości  wyizolowanych  MSC  jest  określenie  zdolności  do
róŜnicowania w kierunku tkanki kostnej, chrzęstnej oraz tłuszczowej [18, 22].

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej

Standardowe podejście do izolacji MSC obejmuje uzyskanie z tkanki wyjściowej populacji komó-

rek mononuklearnych, którą następnie wysiewa się na szalki w standardowej gęstości w minimalnych
poŜywkach zawierających płodową surowicę bydlęcą (FBS, ang. fetal bovine serum) [14, 21, 22]. Po
24

–

48 godzinach poprzez zmianę poŜywki usuwane są komórki nieadherentne, a hodowla komórek

przylegających do plastiku prowadzona jest do momentu znacznej redukcji szybkości wzrostu komórek
[7, 8]. Następuje to najczęściej po przekroczeniu wartości 40 podwojeń populacji. Po tym czasie dodaje
się czynniki wzrostu, w wyniku czego otrzymuje się selektywne wzbogacenie określonej subpopulacji
MSC. Najczęściej wykorzystywanym czynnikiem wzrostu jest zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów
(bFGF, ang. fibroblast growth factor), który w obecności 10% FBS wydłuŜa długość Ŝycia MSC do 70
podwojeń populacji [2].

Przed przystąpieniem do izolacji MSC, krew pępowinową rozcieńcza się często buforem fosfora-

nowym (PBS, ang. phosphate-buffered saline) w stosunku 1:1 [7, 14, 19]. Czasami usuwa się takŜe z
próbki erytrocyty poprzez dwugodzinną inkubację krwi z 3% Ŝelatyną w soli fizjologicznej w tempera-
turze pokojowej. Po tym czasie próbkę wiruje się przez 10 minut przy 400g. W wyniku tej procedury
otrzymuje się supernatant bogaty w komórki mononuklearne [24].

Właściwa izolacja komórek mononuklearnych obejmuje nałoŜenie próby na medium do izolacji i

wirowanie w gradiencie gęstości. Stosuje się róŜne rodzaje roztworów na bazie glicerolu o gęstości
1,077 g/cm

: Ficoll-Paque-Plus [7, 20, 21], Ficoll/Uropolina [11], Ficoll [14], Ficoll-Hypaque [17, 19,

24],  Ficoll-Paque  [8,  25,  28].  Tak  przygotowane  próby  następnie  się  wiruje  w  następujących  warun-
kach: 20–30 minut [7, 14, 19-21, 24, 25], 400-435g [7, 14, 19, 21, 24, 25], 10ºC [14] lub temperatura
pokojowa  [7,  19,  21].  W  wyniku  tej  procedury  krew  rozdziela  się  na  szereg  frakcji  w  zaleŜności  od
gęstości  komórek  w  nich  zawartych.  MSC  znajdują  się  w  interfazie,  nad  fazą  fikolową  [14,  19,  21].
Komórki te pobiera się i przemywa roztworem PBS [14, 19, 21], a następnie wiruje przy 200g przez 10
minut  w  temperaturze pokojowej  [14].  Uzyskane  komórki  mononuklearne są najczęściej  umieszczane
w  gęstości  1–4×10

komórek/cm

[7, 11, 17, 19-21, 24] na szalkach powlekanych płodową surowicą

cielęcą (FCS, ang. fetal calf serum) [7, 19] bądź niepowlekanych [14].

Nie istnieje metoda, która gwarantowałaby równocześnie odpowiednią wydajność i powtarzalność

przeprowadzanej izolacji MSC, gdyŜ metoda łącząca obie te cechy wymagałaby odtworzenia w hodow-
li złoŜonego środowiska in vivo danej tkanki [2].

Aby zwiększyć wydajność izolacji dodatkowo wykorzystuje się róŜnorodne techniki wzbogacania

populacji  w  komórki  o  poŜądanych  właściwościach.  Metody  te  wykorzystują  róŜne  cechy  MSC,  jak
wielkość, zdolność tworzenia monowarstwy lub rodzaj występujących na powierzchni komórek cząste-
czek  markerowych  [2].  W  wyniku  zastosowania  tych  procedur  uzyskuje  się  populacje  odmienne  pod
względem potencjału do wzrostu oraz róŜnicowania [2, 18].

NiezaleŜnie od rodzaju tkanki, moŜliwe jest przeprowadzenie etapu wzbogacania populacji w poŜą-

dane komórki. Na tym poziomie moŜna zastosować kilka metod. Najczęściej wykorzystywanymi z nich
są: wzbogacanie przez wirowanie w gradiencie gęstości oraz oczyszczanie w oparciu o zdolność MSC
do adhezji. Pierwsze podejście wykorzystuje znaną gęstość MSC, która wynosi 1,073 g/ml [12], jednak

Metody wydajnej izolacji i hodowli

655

w jej wyniku nadal otrzymuje się populację heterogenną pod względem zdolności do proliferacji i róŜ-
nicowania [10]. Druga procedura obejmuje usuwanie niezwiązanych z powierzchnią naczynia hodow-
lanego komórek poprzez wymianę poŜywki po określonym czasie od załoŜenia hodowli (1–7 dni) [12,
18].  Dodatkowo  istnieje  takŜe  metoda  pozwalająca  na  usunięcie  innych  adherentnych  komórek  zanie-
czyszczających populację MSC, takich jak: makrofagi i komórki endotelialne. Jest to procedura czaso-
chłonna, wymagająca wielu cykli obejmujących hodowlę i pasaŜowanie [12]. Redukcję adhezji mono-
cytów  znajdujących  się  w  izolowanym  preparacie  komórek  mononuklearnych  uzyskuje  się  przez  su-
plementację  medium  hodowlanego  10

–7

M deksametazonem. Po tygodniowej hodowli usuwa się ko-

mórki nieadherentne i wymiena poŜywkę na pozbawioną deksametazonu [21].

Podczas oczyszczania heterogennej populacji komórek wykorzystuje się specyficzne przeciwciała

przeciwko obecnym na powierzchni MSC cząsteczkom markerowym [18]. Wykorzystuje się je podczas
pozytywnej  lub  negatywnej  selekcji  z  wykorzystaniem  cytometrii  przepływowej  [22],  magnetycznej
separacji  komórek  opłaszczonych  metalowymi  kulkami  powlekanymi  immunoglobulinami  (MACS,
ang. magnetic immunobead-activated cell sorting) [18, 28] bądź poprzez sortowanie komórek w opar-
ciu  o  fluorescencję  barwników  związanych  z  przeciwciałami  (FACS,  ang.  fluorescence-activated  cell
sorting) [18].

Do izolacji oczyszczonych populacji MSC wykorzystuje się takŜe technikę polegającą na selektyw-

nej hodowli komórek o odpowiedniej wielkości [29]. Uzyskanie czystej kulury komórek jest takŜe moŜ-
liwe dzięki metodzie zwanej ograniczonym rozcieńczaniem [8, 18]. Dodatkowo stosuje się nowatorskie
techniki. Jedną z nich jest izolacja MSC w oparciu o kulki magnetyczne powlekane aptamerami – spe-
cyficznymi względem komórek cząsteczkami DNA [18].

Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych

W hodowli MSC w warunkach in vitro stosuje się róŜnorodne poŜywki: DMEM [17, 21, 22], LG-

DMEM [7, 14, 20, 25], IMDM [8, 11, 24], MSCGS [7, 19, 25],

-MEM [25] wzbogacane surowicą 10–

20% (FBS (8, 17, 20, 21, 25) lub FCS [7, 11, 14]), 2-20mM L-glutaminą [8, 14, 17, 20, 24, 25], piro-
gronianem sodu [25], antybiotykami [8, 14, 17, 20, 24] oraz cytokinami: bFGF [8, 21], SCF (czynnik
wzrostu  komórek  pnia,  ang.  stem  cell  factor)  [21],  IL-3  [21],  EGF  (czynnik  wzrostu  naskórka,  ang.
epidermal  growth  factor)  [25],  VEGF  (czynnik  wzrostu  śródbłonka  naczyniowego,  ang.  vascular
endothelial growth factor) [25].

Od momentu stwierdzenia w 1995 roku przez Caplana, Ŝe podstawowa poŜywka jest niewystarcza-

jąca  do  zapewnienia  adhezji  i  proliferacji  MSC,  coraz  częściej  stosuje  się  suplementację  mediów  ho-
dowlanych róŜnymi rodzajami surowic [12]. Do tej pory nie opracowano niezawodnej metody izolacji
MSC, niewykorzystującej surowicy. Najczęściej stosuje się suplementację surowicą o stęŜeniu od 2 do
20%.  Większość  protokołów  opiera  się  o  dodanie  FCS  [3].  Dostarcza  ona  komórkom  niezbędnych
czynników  wzrostu  oraz  białek  odpowiedzialnych  za  adhezję  [12].  Obawy  wynikające  z  moŜliwości
przeniesienia na hodowane komórki BSE lub innej infekcji oraz nieprzewidywalna reakcja immunolo-
giczna  gospodarza  powodują  prowadzenie  dalszych  badań  nad innymi  suplementami  poŜywek.  Udało
się  opracować  techniki  oparte  na  alternatywnych  odczynnikach  pochodzenia  ludzkiego  –  surowicy,
lizatu płytkowego bądź osoczu. JednakŜe wpływ tych składników na jakość preparatów komórkowych
jest nieznany. Badania nad kinetyką wzrostu oraz morfologią komórek wskazują na ich istotne znacze-
nie  w  procesie  izolacji  i  wzrostu  komórek  [3,  30].  Wadą  płodowej  surowicy  cielęcej,  a  takŜe  innych
preparatów surowiczych, jest takŜe brak stałego, zdefiniowanego i niezmiennego składu. Zawierają one
nieznane czynniki wzrostu, które mogą wpływać na fizjologię MSC lub modyfikować ekspresję genów
[12]. Rozwój w chemicznie zdefiniowanym, pozbawionym surowicy środowisku jest istotny dla ujed-
nolicenia  metod  izolacji  MSC  [3].  Suplementacja  poŜywki  bFGF  minimalizuje  wpływ  róŜnic  w  skła-
dzie surowicy, natomiast czynniki wzrostowe zawarte w płytkach krwi znoszą całkowicie jej działanie.
Szczególnie waŜny jest w tej grupie płytkowy czynnik wzrostu (PDGF, platelet-derived growth factor).
W hodowli MSC wykorzystywany jest od lat osiemdziesiątych XX wieku, ze względu na silne działa-

A. GESE, K. ROSZEK

656

nie mitogenne, w wyniku czego komórki dzielą się szybciej, przy zachowaniu ogólnej, charakterystycz-
nej morfologii [12].

W latach dziewięćdziesiątych XX wieku opracowano poŜywkę do hodowli MSC, pozwalającą na

jej prowadzenie w określonych warunkach składu podłoŜa. PoŜywka ta nie zawiera cząsteczek odpo-
wiedzialnych za adhezję ani czynników wzrostu. Zatem do utrzymania odpowiedniego poziomu proli-
feracji niezróŜnicowanych komórek niezbędne jest zastosowanie powlekania powierzchni naczyń ho-
dowlanych fibronektyną oraz dodanie do poŜywki odpowiednich czynników wzrostu [12].

Hodowla in vitro MSC jest prowadzona w 37ºC [7, 11, 14, 17, 19, 20, 24], w atmosferze o odpo-

wiedniej wilgotności [7, 19, 20, 24] i stęŜeniu dwutlenku węgla wynoszącym około 5% [7, 11, 14, 17,
19, 20, 24] do momentu uzyskania 60-80% stanu konfluencji [8, 11, 14, 17, 20]. Po ustalonym czasie
usuwa się z hodowli komórki nieadherentne poprzez wymianę poŜywki nad warstwą komórek przykle-
jonych do podłoŜa [8, 19]. Najczęściej przeprowadza się to po więcej niŜ 12 godzinach hodowli [7, 17,
20] (1-5 dni [17, 20]). Zbyt krótki czas pozwalający komórkom adherentnym na przyleganie do naczyń
hodowlanych powoduje obniŜenie efektywności izolacji MSC [6].

Po uzyskaniu populacji komórek adherentnych wymienia się całą objętość poŜywki co 3-5 dni [8,

14, 20], bądź połowę objętości poŜywki raz w tygodniu [11, 17, 24]. Hodowlę prowadzi się do momen-
tu uzyskania ponad 50% konfluencji [8, 11, 14, 17, 20], a następnie przeprowadza się pasaŜowanie
przez trypsynizację [7, 8, 11, 14, 17, 19, 20], rozcieńcza w stosunku 1:3 [8, 11] i wysiewa w gęstości 2–
5×10

komórek/cm

[7, 17, 19, 20].

Na zdolność proliferacji MSC w warunkach in vitro duŜy wpływ ma stęŜenie tlenu w fazie gazowej

nad powierzchnią poŜywki. 20% zawartość tlenu obecna w powietrzu atmosferycznym nie przypomina
warunków  fizjologicznych  właściwych  dla  MSC.  W  warunkach  in  vivo  stęŜenie  tlenu  jest  znacznie
niŜsze  i  róŜni  się  w  zaleŜności  od  rodzaju  tkanki  i  umiejscowienia  w  niej  komórek  macierzystych.
Przykładowo w tkance kostnej stęŜenie tlenu waha się od 1–12%. MSC w tych warunkach są naraŜone
na  działanie  hipoksji.  Hodowla  pozaustrojowa  w  warunkach  niedoboru  tlenu  stymuluje  proliferację
i wydłuŜa czas Ŝycia komórek. Hipoksja zwiększa produkcję (zarówno syntezę, jak i organizację) ele-
mentów macierzy zewnątrzkomórkowej, a takŜe zmienia ekspresję genów zaangaŜowanych w metabo-
lizm. ObniŜona zawartość tlenu indukuje takŜe produkcję czynników wzrostu takich, jak: VEGF, endo-
telialny czynnik wzrostu wiąŜący heparynę (HB-EGF, heparin-binding endothelial growth factor) oraz
czynnik  wzrostowy  łoŜyska  (PGF,  placenta  growth  factor).  Dodatkowo  hipoksja  obniŜa  potencjał  do
róŜnicowania MSC, ułatwiając w ten sposób utrzymanie ich w stanie niezróŜnicowanym [12].

Odpowiednie warunki hodowli oraz przeprowadzanie pasaŜowania wystarczają do otrzymania osta-

tecznie  oczyszczonych  MSC  pozbawionych  populacji  innych  komórek  adherentnych  (makrofagi,  lim-
focyty,  komórki  endotelialne).  Jednak  kolejne  pasaŜe  mogą  zmieniać  cechy  MSC.  Mogą  powodować
redukcję  szybkości  podziałów  oraz  utratę  multipotencjalności.  Starzenie  się  MSC  podczas  wzrostu  w
warunkach in vitro moŜe być powiązane z długością telomerów [12].

Jakość otrzymanych MSC moŜna ocenić na podstawie analizy morfologii komórek [7, 17, 19], ich

zdolności do proliferacji [8, 20], potencjału do róŜnicowania [7, 8, 14, 20], immunofenotypu (np. meto-
dą FACS) [7, 8, 14, 17, 19, 20] oraz ekspresji genów [17, 20].

Uwagi końcowe

Porównanie efektywności metod stosowanych do izolacji MSC z krwi pępowinowej jest utrudnione

poprzez brak standaryzacji protokołów oraz przez szereg róŜnych czynników wpływających na wydaj-
ność izolacji oraz hodowli tych komórek – Rycina 1.

Metody wydajnej izolacji i hodowli

657

Ryc. 1. Czynniki wpływające na wydajność izolacji i hodowli MSC (3) – zmodyfikowano.

Fig. 1. Factors affecting the efficiency of MSC isolation and culture (3)

–

modified

Ustalono doświadczalnie, Ŝe objętość pobranej próbki krwi pępowinowej przekraczająca 33 ml,

czas od pobrania do izolacji komórek macierzystych – nie większy niŜ 15 godzin oraz uzyskana ogólna
liczba komórek mononuklearnych przekraczająca 10

pozwalają na efektywną izolację MSC z 60%

jednostek krwi [12, 25, 31]. Znaczną poprawę efektywności (nawet 90%) uzyskuje się skracając czas do
mniej niŜ 2 godzin, przy wyselekcjonowaniu jednostek krwi pępowinowej przekraczających objętość
90 ml [21].

Na efektywność izolacji MSC wpływają takŜe czynniki niezaleŜne od samej procedury izolacji [3,

12]. NajwaŜniejszym parametrem tego typu jest zmienność dawcy materiału. MSC są izolowane jako
pierwotne preparaty komórkowe od dawców o róŜnym podłoŜu genetycznym. Dlatego wykluczenie
wpływu tego parametru na izolację jest praktycznie niemoŜliwe [3].

MSC mogą być pasaŜowane ograniczoną liczbę razy – ok. 8–15 pasaŜy, co odpowiada 25–40 po-

dwojeniom  populacji.  Po  tym  czasie  komórki  ulegają  senescencji  (starzeniu  się)  i  przestają  prolifero-
wać. Towarzyszą temu zmiany morfologiczne objawiające się powiększeniem komórek. Obserwowana
jest  takŜe  redukcja  gęstości  hodowli.  Dokładny  molekularny  mechanizm  senescencji  jest  nieznany.
Wiadomo  jednak,  Ŝe  proces  starzenia  komórkowego  ma  wpływ  na  profile  molekularne  oraz  cechy
funkcjonalne  MSC.  Wykazano  takŜe,  Ŝe  komórki  w  stanie  konfluencji  tracą  częściowo  potencjał  do
róŜnicowania [3].

MSC są często poddawane zamraŜaniu w ciekłym azocie w obecności dimetylosulfotlenku

(DMSO). Udowodniono, Ŝe w wyniku kriokonserwacji komórki te nie tracą potencjału do róŜnicowania
[3], jednak ilość komórek macierzystych po rozmroŜeniu spada do 0–19% liczebności wyjściowej po-
pulacji [12]. Nie moŜna wykluczyć takŜe wpływu zamraŜania na właściwości biologiczne MSC [3].

Wszystkie te czynniki wpływają na brak powtarzalności rezultatów zastosowanych procedur izola-

cji MSC z krwi pępowinowej, przez co ograniczają kliniczne moŜliwości ich wykorzystania [21]. Ze
względu na liczbę moŜliwych róŜnic wynikających z wpływu wspomnianych czynników, nie jest moŜ-
liwe uwzględnienie ich wszystkich w procedurze izolacji i hodowli MSC. Dlatego właśnie odnalezienie
precyzyjnego markera molekularnego, który mógłby być stosowany do specyficznej izolacji wszystkich
MSC – niezaleŜnie od ich źródła, wydaje się być niezbędne [3].

Wydajność izolacji i hodowli MSC

Zmienność dawcy

Rodzaj tkanki:
- szpik kostny
- krew pępowinowa
- krew obwodowa
- tkanka tłuszczowa
- skóra

Hodowla in vitro:
- czas hodowli
- pasaŜowanie
- senescencja
- gęstość komórek
- kriokonserwacja

Suplementacja surowicą:
- FCS (i inne)
- ludzka surowica
- osocze bogate w płytki

Suplementacja związkami
chemicznymi:
- L-glutamina
- pirogronian sodu
- antybiotyki
- cytokiny i czynniki wzro-
stu

Warunki hodowli:
- rodzaj poŜywki podstawo-
wej
- ciśnienie tlenu
- stęŜenie dwutlenku węgla

Biomateriały i powlekanie powierzchni:
- adhezja do plastiku
- powlekanie fibronektyną, Ŝelatyną, kolagenem
- hodowle 3D

Metoda izolacji komórek i wzbo-
gacanie:
- ficoll
- rodzaj uŜytych markerów moleku-
larnych:
- eliminacja komórek CD45
- pozytywna selekcja (np. CD271)
- kriokonserwacja

A. GESE, K. ROSZEK

658

PIŚMIENNICTWO

Urbaniak-Kujda D, Wołowiec D, Tomaszewska-Toporska B, Kapelko-Słowik K, Kuliczkowski K. Mezenchymalne
komórki macierzyste: ich biologia i perspektywy zastosowań klinicznych. Acta Haematol Pol. 2005; 36(2):161-6.

Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and
gene therapy. J Cell Mol Med. 2004; 8(3): 301-16.

Wagner W, Ho AD. Mesenchymal stem cell preparations - comparing apples and oranges. Stem Cell Rev. 2007; 3(4):
239-48.

Pountos I, Giannoudis PV. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 2005; 36 Suppl 3:S8-S12.

Bajek A, Olkowska J, Drewa T. Mezenchymalne komórki macierzyste narzędziem terapeutycznym w regeneracji tkanek i
narządów. Postepy Hig Med Dosw. 2011; 65: 124-32.

Lee MW, Choi J, Yang MS, Moon YJ, Park JS, Kim HC, et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human
umbilical cord blood. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 320(1): 273-8.

Kern S, Eichler H, Stoeve J, Kluter H, Bieback K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,
umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006; 24(5): 1294-301.

Lee OK, Kuo TK, Chen WM, Lee KD, Hsieh SL, Chen TH. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from
umbilical cord blood. Blood. 2004; 103(5): 1669-75.

Bieback K, Kluter H. Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood. Curr Stem Cell Res Ther. 2007;2(4):310-23.

10.

Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche,
self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 2007; 9(1): 204.

11.

Pojda Z, Machaj EK, Gajkowska A, Ołdak T, Jastrzewska M. Badanie potencjalnej przydatności klinicznej komórek
macierzystych uzyskiwanych z krwi pępowinowej. Postępy Biol Kom. 2003; 30: 127-37.

12.

Bourin P, Gadelorge M, Peyrafitte J-A, Fleury-Cappellesso S, Gomez M, Ragea C, et al. Mesenchymal Progenitor Cells:
Tissue Origin, Isolation and Culture. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2008; 35: 160-7.

13.

Roszek K, Komoszynski M. Kontrola i kierunki róŜnicowania komórek macierzystych krwi pępowinowej oraz ich
zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw. 2008; 62: 660-7.

14.

Musina RA, Bekchanova ES, Belyavskii AV, Grinenko TS, Sukhikh GT. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
Bull Exp Biol Med. 2007; 143(1): 127-31.

15.

Chen Y, Shao JZ, Xiang LX, Dong XJ, Zhang GR. Mesenchymal stem cells: a promising candidate in regenerative
medicine. Int J Biochem Cell Biol. 2008; 40(5): 815-20.

16.

Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm (Lond). 2005;
2: 8.

17.

Goodwin HS, Bicknese AR, Chien SN, Bogucki BD, Quinn CO, Wall DA. Multilineage differentiation activity by cells
isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers. Biol Blood Marrow Transplant. 2001;
7(11): 581-8.

18.

Rojewski MT, Weber BM, Schrezenmeier H. Phenotypic Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Various
Tissues. Transfus Med Hemother. 2008; 35: 168-84.

19.

Feldmann RE, Jr., Bieback K, Maurer MH, Kalenka A, Burgers HF, Gross B, et al. Stem cell proteomes: a profile of
human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood. Electrophoresis. 2005; 26(14): 2749-58.

20.

Gang EJ, Hong SH, Jeong JA, Hwang SH, Kim SW, Yang IH, et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical
cord blood-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 321(1): 102-8.

21.

Zhang X, Hirai M, Cantero S, Ciubotariu R, Dobrila L, Hirsh A, et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem
cells from human umbilical cord blood: Reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to
proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose
tissue. J Cell Biochem. 2011; 112(4): 1206-18.

22.

Malgieri A, Kantzari E, Patrizi MP, Gambardella S. Bone marrow and umbilical cord blood human mesenchymal stem
cells: state of the art. Int J Clin Exp Med. 2010; 3(4): 248-69. PMCID: 2971538.

23.

Sikora MA, Olszewski WL. Komórki macierzyste - biologia i zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw. 2004;
58: 202-8.

24.

Alfonso ZZC, Forneck ED, Allebrandt WF, Nardi NB. Establishment of an adherent cell layer from human umbilical cord
blood. Genetics and Molecular Biology. 2000; 23(3): 519-22.

25.

Flynn A, Barry F, O'Brien T. UC blood-derived mesenchymal stromal cells: an overview. Cytotherapy. 2007; 9(8): 717-
26.

26.

Rubinstein P. Cord blood banking for clinical transplantation. Bone Marrow Transplant. 2009; 44(10): 635-42.

27.

Korycka A, Robak T. Komórki macierzyste krwi pępowinowej - nadzieje i rzeczywistość. Acta Haematol Pol. 2005; 36:
389-98.

28.

Laitinen A, Laine J. Isolation of mesenchymal stem cells from human cord blood. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2007;
Chapter 2: Unit 2A 3.

29.

Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL, Li H, Ma HL, Lo WH. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human
bone marrow. Stem Cells. 2002; 20(3): 249-58.