Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
Ć
wiczenie 10
Enzymologia 2010
1
Ćwiczenie 10. Oznaczanie stęŜenia fosforanów.
1. Wstęp
Kolorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawę ilościowego
oznaczania substancji w roztworze stanowi prosta zaleŜność między intensywnością
zabarwienia roztworu, a stęŜeniem zawartej w nim substancji (prawo Lamberta-Beera).
A =
εεεε
××××
C
××××
l
lub
gdzie:
A – absorbancja,
ε
– molowy współczynnik absorpcji
1
,
C – stęŜenie molowe substancji absorbującej w roztworze,
l – droga optyczna (grubość warstwy roztworu),
I
1
– natęŜenie światła padającego,
I
2
– natęŜenie światła, które przeszło przez roztwór.
Metodami kolorymetrycznymi moŜna oznaczać zarówno stęŜenia substancji barwnych, jak
i substancji bezbarwnych, które na drodze stechiometrycznej reakcji chemicznej
przeprowadza się w związki barwne. Reakcja barwna musi szybko przebiegać do końca,
a powstałe zabarwienie winno być dostatecznie trwałe, czyli niewraŜliwe na działanie światła
i mało zaleŜne od zmian pH, temperatury, nadmiaru odczynnika itp. WaŜne jest równieŜ, aby
odczynnik reagował jedynie z substancją badaną i nie dawał barwy z Ŝadną inną substancją
obecną w roztworze (tj. aby reakcja była specyficzna). W niektórych przypadkach, w celu
oznaczenia stęŜenia próbki metodą kolorymetryczną potrzebny jest standard, który słuŜy do
przygotowania tzw. krzywej standardowej (wzorcowej).
Krzywa kalibracyjna (wzorcowa)
Krzywa kalibracyjna podaje zaleŜność między absorbancją a stęŜeniem lub licznością
substancji w próbce (jeśli roztwór podlega prawu Lamberta-Beera, krzywa kalibracyjna jest
linią prostą przechodzącą przez punkt przecięcia się osi układu współrzędnych).
Przygotowuje się ją przez wykonanie pomiarów absorbancji dla kilku lub kilkunastu stęŜeń
wzorca i wykreśla się krzywą odkładając na osi odciętych stęŜenia lub ilość substancji,
1
JeŜeli stęŜenie wyraŜamy w gramach na litr roztworu, a grubość warstwy absorbującej w centymetrach,
to współczynnik ten nosi nazwę właściwego współczynnika absorpcji (E).
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
Ć
wiczenie 10
Enzymologia 2010
2
a na osi rzędnych – odpowiednie wartości absorbancji (Rys.1.). StęŜenie substancji w próbie
badanej odczytuje się z krzywej kalibracyjnej przez interpolację, biorąc pod uwagę wartość
absorbancji tej próby.
Rys.1. Krzywa kalibracyjna
NaleŜy pamiętać, aby standard przygotowywać zawsze „na świeŜo” i w identycznym buforze
jak oznaczana próbka [1].
Fosfor (gr. phosphoros – "niosący światło")
Fosfor naleŜy do grupy makroelementów. W organizmie człowieka znajduje się około 700 g
fosforu, z czego 75 % występuje w kościach, a pozostała cześć rozmieszczona jest w
mięśniach, układzie nerwowym, we krwi i innych płynach ustrojowych. Związki fosforu
odgrywają podstawową rolę w przemianach energetycznych ustroju, w utrzymaniu
równowagi
kwasowo-zasadowej
(działają
jako
bufory),
wzmagają
pobudliwość
nerwowo-mięśniową i są składnikami tak waŜnych fizjologicznie związków jak: kwasy
nukleinowe, białka, koenzymy czy lipidy złoŜone [4, 5, 6, 7].
Oznaczanie grup fosforanowych
Grupy fosforanowe oznacza się wyłącznie metodami kolorymetrycznymi i tylko w formie
ortofosforanowej (V). Ogólna zasada oznaczania polega na wytwarzaniu się w środowisku
kwasowym w reakcji z molibdenianem (VI) amonu cztero(trójmolibdeniano)fosforanu
amonowego (NH
4
)
3
P(Mo
3
O
10
)
4
, który moŜe być redukowany do błękitu molibdenowego
(mieszanina niŜszych tlenków molibdenu) o niebieskim zabarwieniu. Poszczególne metody
róŜnią się od siebie tylko warunkami redukcji. Jako reduktory stosowane są najczęściej:
eikonogen (kwas 1-amino-2-naftalo-4-sulfonowy), chlorek cyny(II), amidol, hydrochinon
i kwas askorbinowy [2, 3].
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
Ć
wiczenie 10
Enzymologia 2010
3
2. Cel ćwiczenia:
Zapoznanie się z metodą oraz określenie stęŜenia grup fosforanowych w próbce otrzymanej
do analizy.
3. Odczynniki, szkło, aparatura:
1 M HCl,
1 M KH
2
PO
4
(roztwór wzorcowy),
10 % roztwór wodny kwasu askorbinowego,
0,42 % roztwór molibdenianu amonu w 0,5 M H
2
SO
4
(1:6 v/v),
próbka do analizy,
łaźnia wodna,
spektrofotometr,
kuwety pomiarowe,
parafilm,
zlewki,
probówki.
4. Sposób wykonania ćwiczenia
Uwagi:
Zanotować numer próbki otrzymanej.
Przed wykonaniem ćwiczenia umyć probówki dobrze wypłukując detergent
(niektóre detergenty mogą zawierać fosforany!).
Wykonać wszelkie obliczenia potrzebne do wykonania ćwiczenia (wyjaśnia
prowadzący).
Próbki potrzebne do przygotowania krzywej standardowej oraz próbkę analizowaną
naleŜy przygotowywać równolegle.
Oprócz próbek wzorca i do analizy naleŜy przygotować dwa odnośniki potrzebne przy
zerowaniu aparatu („próbka 0”).
Krzywa standardowa:
Roztworem wzorcowym jest 1M roztwór KH
2
PO
4
.
W celu sporządzenia krzywej standardowej naleŜy przygotować szereg rozcieńczeń
(6-10) roztworu wzorcowego (0,1 – 1 mM; 5-50 nmola) w objętości końcowej 50
µ
l.
Wykonać test według podanego poniŜej przepisu.
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii
Ć
wiczenie 10
Enzymologia 2010
4
Przygotowanie próbki analizowanej:
Zaplanować cztery rozcieńczenia próby badanej, tak aby znaleźć się w przedziale
krzywej standardowej .
Wykonanie testu:
Przygotować zaplanowane rozcieńczenia wzorca i próby badanej w wysokich
probówkach (proszę pamiętać o przygotowaniu 2 probówek na odnośnik potrzebny do
zerowania aparatu).
Do wszystkich probówek dodać po 300
µ
l 1M HCl.
Umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez 15 minut.
Po ostudzeniu, dodać po 700
µ
l mieszaniny: 10 % wodnego roztworu kwasu
askorbinowego i 0,42 % roztworu molibdenianu amonu w 0,5 M H
2
SO
4
(1:6 v/v).
Próbki przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 45
°
C i inkubować przez 20 minut.
Do kaŜdej probówki dodać 1 ml wody destylowanej.
Odczytać absorbancję przy długości fali 820 nm wobec „próbki 0”.
Aby oznaczyć stęŜenie jonów fosforanowych w próbce, naleŜy wykreślić krzywą
standardową i na jej podstawie określić stęŜenie roztworu wyjściowego próby badanej.
5. Opracowanie wyników
Wyniki naleŜy opracować w postaci sprawozdania, które powinno składać się z pięciu części:
protokołu, przykładowych obliczeń, wyników z ich opracowaniem, obserwacji i wniosków.
W sprawozdaniu, proszę koniecznie wpisać imię i nazwisko wszystkich osób z trzyosobowej
grupy, dzień tygodnia i godzinę zajęć, datę wykonania ćwiczenia oraz nazwisko osoby, do
której są Państwo zapisani na zajęcia.
6. Literatura
1.
„Ćwiczenia z biochemii” pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz PWN W-wa 2003
2.
Chen, P.S., Toribara, T.Y. i Warner, H., (1956) „Microdetermination of phosphorus.”
Analyt.Chemistry 28:1756-58
3.
Ames, B.N. i Dubin, D.T., (1960) „The Role of Polyamines in the Neutralization
of Bacteriophage Deoxyribonucleic Acid.” J Biol Chem 235(3), 769-775
4.
Yu, G.C. i Lee, D.B. (1987) „Clinical disorders of phosphorus metabolism.”
West J Med. 147(5):569-76
5.
Cashman, K.D. i Flynn, A. (1999) „Optimal nutrition: calcium, magnesium and
phosphorus.” Proc Nutr Soc. 58(2):477-87
6.
Berndt, T.J., Schiavi, S. i Kumar, R. (2005) „"Phosphatonins" and the regulation
of phosphorus homeostasis.” Am J Physiol Renal Physiol. 289(6):F1170-82
7.
Shaikh, A., Berndt, T. i Kumar, R. (2008) „Regulation of phosphate homeostasis
by the phosphatonins and other novel mediators.” Pediatr Nephrol. 23(8):1203-10.