KULTURY KOMÓRKOWE I TKANKOWE ZWIERZĄT

INSTRUKACJA DO ĆWICZENIA II

ENKAPSULACJA KOMÓREK. ZAMRAŻANIE KOMÓREK.

I. Pasażowanie i liczenie komórek

1. Usunąć medium hodowlane.

2. Dwukrotnie przepłukać (2 ml) powierzchnię wzrostu komórek roztworem soli fizjologicznej

pozbawionym jonów Ca²⁺ oraz Mg²⁺ (PBS).

3. Dodać 2 ml roztworu trypsyny/EDTA.

4. Przenieść butelkę do inkubatora (37°C, 5% CO₂) na 3 minuty.

5. Inaktywować trypsynę.

6. Zawiesinę komórek przenieść do probówki i odwirować (5 min., 2500 rpm).

7. Usunąć supernatant.

8. Osad komórkowy zawiesić w medium hodowlanym.

9. Komórki policzyć (test z błękitem trypanu).

10. Zawiesinę komórek rozdzielić na dwie probówki (oznaczyć je numerami 1 i 2).

2. Enkapsulacja komórek

1. Zawiesinę komórek (probówka nr 1) odwirować (5 min., 2500 rpm).

2. Powstały po odwirowaniu osad komórek zawiesić w roztworze alginianu tak, aby gęstość komórek wynosiła 1mln/1ml.

UWAGA! Nie można spienić powstałej zawiesiny komórek!

3. Zawiesinę komórek pobrać do strzykawki.

4. Powoli skraplać zawiesinę przy użyciu igły do 0,1 M roztworu chlorku wapnia, w celu uformowania kulek alginianowych.

5. Odczekać 10 min, a następnie przepłukać trzykrotnie kulki roztworem PBS.

6. Kulki alginianowe przenieść do naczynia hodowlanego z kompletną pożywką.

3. Zamrażanie komórek

1. Przygotować medium krioprotekcyjne.

2. Zawiesinę komórek (probówka nr 2) odwirować (5 min., 2500 rpm).

3. Powstały po odwirowaniu osad komórek zawiesić w medium krioprotekcyjnym.

4. Zawiesinę komórek przenieść do probówki krioprotekcyjnej.

5. Komórki zamrażać powoli, poprzez stopniowe obniżanie temperatury o 1°C na minutę.

Media do mrożenia komórek:
1. Kompletne medium bez dodatku krioprotektanta.

2. Kompletne medium z 10% DMSO.

3. Surowica z 10% DMSO.

Odczynniki:
- zbuforowany roztwór soli fizjologicznej bez jonów Ca2+ i Mg2+ (PBS)

- trypsyna/EDTA (0,05%/0,5mM)

- medium hodowlane (DMEM/F-12, Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12) z suplementami:

• 10% surowicy płodowej wołowej (FBS, Fetal Bovine Serum)

• penicylina (100 IU/ml)

• streptomycyna (100 µg/ml)

• amfoterycyna B (2,5 µg/ml)

- błękit trypanu (0,4%)
- roztwór alginianu (1%)
- roztwór chlorku wapnia (0,1M)
- dimetylosulfotlenek (DMSO)

Materiały:
- pipetor
- sterylne pipety jednorazowego użytku
- probówki
- sterylne naczynia hodowlane
- zlewka na zużyte płyny
- komora Neubauera
- strzykawka
- igła

- probówki do mrożenia