KULTURY KOMÓRKOWE I TKANKOWE ZWIERZĄT

INSTRUKACJA DO ĆWICZENIA III

ZAKŁADANIE HODOWLI PIERWOTNEJ KOMÓREK MACIERZYSTYCH TKANKI TŁUSZCZOWEJ SZCZURA

1. Pobrać tkankę tłuszczową i umieścić ją w roztworze PBS z antybiotykami.

2. Przenieść tkankę tłuszczową na sterylną szalkę.

3. Usunąć naczynia krwionośne.

4. Zważyć tkankę.

5. Przepłukać tkankę w roztworze PBS z antybiotykami.

6. Przenieść tkankę tłuszczową na sterylną szalkę i rozdrobnić ją.

7. Rozdrobnioną tkankę umieścić w probówce.

8. Dodać kolagenazę P (1ml/1g tkanki). Dobrze wymieszać.

9. Inkubować 10 minut w łaźni wodnej od czasu do czasu mieszając.

10. Inaktywować enzym przez dodanie równej objętości medium hodowlanego z surowicą.

11. Przepuścić roztwór przez sito (ang. cell strainer) celem uzyskania zawiesiny pojedynczych

komórek.

12. Zawiesinę komórek odwirować (5 min., 2500 rpm).

13. Przy pomocy pipety Pasteura usunąć supernatant.

14. Osad zawiesić w kompletnym medium i przenieść do sterylnego naczynia hodowlanego.

Odczynniki:

- zbuforowany roztwór soli fizjologicznej bez jonów Ca²⁺ i Mg²⁺ (PBS) z antybiotykami (penicylina/ streptomycyna/amfoterycyna B)

- kolagenaza P (1mg/ml)

- medium hodowlane (DMEM/F-12, Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12)
z suplementami:

• 10% surowicy płodowej wołowej (FBS, Fetal Bovine Serum)

• penicylina (100 IU/ml)

• streptomycyna (100 µg/ml)

• amfoterycyna B (2,5 µg/ml)

Materiały:
- narzędzia (pęsety, nożyczki)
- szalki Petriego
- zlewki
- sito do komórek
- probówki
- pipety Pasteura
- butelki hodowlane