1
ZAKŁAD BIOCHEMII
ENZYMOLOGIA
Biochemia i Biotechnologia
UMCS
KP/KR)
2012
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH – III
Czynniki wpływające na aktywność enzymów
Ćwicz. 4-7
Czynnikami wpływającymi na katalityczne działanie enzymów są: stężenie
substratu, stężenie enzymu, temperatura, pH środowiska, obecność aktywatorów
i inhibitorów, w niektórych przypadkach również potencjał redukcyjno-oksydacyjny, a także
siła jonowa i stała dielektryczna środowiska.
Stężenie enzymu (Ćwicz. 4)
Zależność szybkości reakcji od stężenia enzymu należy obserwować przy
dostatecznie dużych stężeniach substratu, zapewniających pełne wysycenie enzymu. W tych
warunkach reakcja przebiega według kinetyki zerowego rzędu, jej szybkość nie zależy już od
stężenia substratu i jest proporcjonalna do stężenia enzymu (przy niezbyt dużych jego
wartościach).
Badanie wpływu stężenia inwertazy na szybkość hydrolizy sacharozy
Oznaczenie wykonuje się przy ustalonym, dostatecznie dużym stężeniu substratu, stałym
optymalnym pH, stałej temperaturze i niezmienionych innych parametrach.
Przygotować 4 probówki zawierające po 3 ml następujących rozcieńczeń preparatu
enzymatycznego zawierającego inwertazę (o optymalnym stężeniu wyznaczonym w ćwicz. 2,
oznaczonym tutaj umownie jako „1”):
1
1/2
1/4
1/8
Do rozcieńczania preparatu enzymatycznego należy stosować H
2
O dest.
Do każdej probówki dodać po 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w 0,1 M buforze
octanowym o pH 4,7.
Natychmiast po wymieszaniu (próby odczynnikowe), a następnie dokładnie po 5, 10,
15 i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do odpowiednio oznakowanych
probówek zawierających po 4 ml 0,1 M buforu glicynowego o pH 10 (celu zatrzymania
reakcji enzymatycznej).
Dalszy tok postępowania jest zgodny z procedurą podaną przy wyznaczaniu
optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (ćwicz. 2).
2
Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie (μg/ml) monosacharydów uwolnionych
podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy, a następnie obliczyć ilość powstałych
produktów uwzględniając rozcieńczenie mieszaniny inkubacyjnej (30
):
Ilość produktu (μg) = A
520
× f (
μg/ml) × 1 ml × 30
Dla każdego stężenia enzymu (rozcieńczeń: „1/8”, „1/4”, 1/2”, „1”) sporządzić
krzywą progresji - wykres zależności ilości produktu (mg) od czasu reakcji (min.)
i wyznaczyć szybkość początkową reakcji (w mg glukozy-fruktozy uwolnionych na minutę).
Sporządzić wykres przedstawiający zależność szybkości początkowej v
0
(mg/min)
od stężenia enzymu.
pH środowiska (Ćwicz. 5)
Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym
stężeniu jonów wodorowych. W miarę oddalania się od optimum pH aktywność enzymów
spada, ponieważ jony wodorowe i wodorotlenowe w większym stężeniu powodują
inaktywację poprzez rozrywanie wiązań jonowych i wodorowych pomiędzy grupami
funkcyjnymi łańcuchów bocznych, stabilizujących strukturę przestrzenną enzymu.
Zależność aktywności enzymów od pH jest spowodowana stopniem zjonizowania
enzymu, substratu i kompleksu enzym-substrat. Grupy czynne centrum aktywnego enzymu
wykazują właściwości katalityczne tylko w jednej z jonowych form, podobnie w przypadku
substratu tylko jedna z możliwych form jonizujących jest rzeczywiście aktywna w reakcji
enzymatycznej. Ładunek substratu i enzymu ma znaczenie przy tworzeniu kompleksu enzym-
substrat, ponieważ siły wiążące mogą mieć charakter elektrostatyczny. Optimum pH i kształt
krzywych zależności aktywności od pH mogą się dla danego enzymu różnić w zależności od
reagującego substratu.
Optymalne dla danego enzymu pH utrzymuje się podczas oznaczania aktywności za
pomocą odpowiednio dobranego buforu. Istotne znaczenie mają: rodzaj, ilość użytego buforu,
jego siła jonowa i pojemność buforowa. Rozpuszczalność białek enzymatycznych, ich
konformacja zależą od siły jonowej roztworu, a więc od stężenia i wartościowości
występujących w nim jonów. Pojemność buforowa wzrasta wraz ze stężeniem roztworu,
a maleje z rozcieńczeniem. Dlatego rozcieńczanie buforu, choć nie zmienia pH, to jednak
ujemnie wpływa na pojemność buforową, ma to szczególne znaczenie przy reakcjach
enzymatycznych, w których powstają produkty kwasowe.
Wybór odpowiedniego buforu jest bardzo ważny, ponieważ niektóre jego składniki
np. fosforany, estry fosforanowe, kwasy karboksylowe – będące naturalnymi metabolitami –
mogą wiązać się z enzymem i zmieniać jego aktywność. Bufory boranowe często są
nieodpowiednie ze względu na kompleksowanie różnych alkoholi wielowodorotlenowych,
rybonukleotydów i węglowodanów.
3
Badanie wpływu pH i rodzaju buforu na aktywność inwertazy
Przygotować 7 probówek zawierających po 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy
w buforze Mc Ilvaine’a o następujących wartościach pH:
2,
3,
4,
4,8
6,
7,
8
oraz probówkę z 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w buforze octanowym, o pH 4,7.
Do każdej probówki dodać po 3 ml roztworu rozcieńczonego preparatu
enzymatycznego, zawierającego inwertazę (o optymalnym stężeniu, wyznaczonym
w ćwicz. 2).
Natychmiast po wymieszaniu (próby odczynnikowe), a następnie dokładnie po 5, 10,
15 i 30 min. pobierać po 1ml mieszaniny inkubacyjnej do odpowiednio oznakowanych
probówek zawierających po 4 ml 0,1 M buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania
reakcji enzymatycznej).
Dalszy tok postępowania jest zgodny z procedurą podaną przy wyznaczaniu
optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (ćwicz. 2).
Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie (μg/ml) monosacharydów uwolnionych
podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy, a następnie obliczyć ilość powstałych
produktów uwzględniając rozcieńczenie mieszaniny inkubacyjnej (30
):
Ilość produktu (μg) = A
520
× f (
μg/ml) × 1 ml × 30
Dla każdej wartości pH wyznaczyć (z prostoliniowego odcinka każdej krzywej
progresji) odpowiednią szybkość początkową v
0
(mg/min) i porządzić wykres zależności tej
szybkości od pH.
Porównać wpływ rodzaju buforu (Mc Ilvaine’a o pH 4,8 i octanowego o pH 4,7) na
szybkość reakcji hydrolizy sacharozy.
Temperatura (Ćwicz. 6)
Temperatura wpływa na wszystkie stadia reakcji enzymatycznych: na powstawanie
kompleksu enzym-substrat, przekształcenie go w kompleks enzym-produkt, dysocjację
produktu, może również wpływać na wiązanie aktywatorów lub inhibitorów.
Szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy wzrasta wraz z temperaturą, jak
szybkość reakcji niekatalizowanych, choć w mniejszym stopniu. Jednak po osiągnięciu
pewnego optimum w danych warunkach szybkość reakcji zaczyna maleć w następstwie
denaturacji cieplnej enzymu. Szybkość termicznej inaktywacji enzymów wzrasta gwałtownie
w miarę podwyższania temperatury. Większość enzymów ulega całkowitej inaktywacji po
5 minutach ogrzewania w roztworze wodnym w 70
o
C. Istnieją jednak enzymy, które
zachowują pełną aktywność nawet po ogrzaniu w 100
o
C. Zasadniczo enzymy są bardziej
4
stabilne w obniżonej temperaturze, ale niektóre zachowują wyższą aktywność w temperaturze
pokojowej niż po oziębieniu ich roztworów poniżej 10
o
C.
Szybkość inaktywacji cieplnej enzymów zależy również od stężenia enzymu,
stężenia soli i pH środowiska.
Badanie wpływu temperatury na szybkość hydrolizy sacharozy przez inwertazę
Przygotować 4 probówki zawierające po 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w 0,1 M
buforze octanowym o pH 4,7. Preinkubować po jednej z nich przez 2 minuty odpowiednio:
w temperaturze pokojowej (ok.20
o
C),
40
o
C,
60
o
C,
80
o
C
Przygotować roztwór preparatu enzymatycznego (o optymalnym stężeniu wyznaczonym
w ćwicz. 2) i poddać wstępnej inkubacji w odpowiednich temperaturach (przez 1 min.) po
ok.5 ml tego roztworu (żeby móc potem pobrać z niego 3 ml do zainicjowania reakcji).
Podczas preinkubacji w temp. 60
o
C i 80
o
C probówki z roztworami substratu i
preparatu inwertazy należy szczelnie zatkać, aby uniknąć zmian stężenia w wyniku
parowania.
Do probówek zawierających 3 ml preinkubowanej w odpowiedniej temperaturze
sacharozy dodać odpowiednio po 3 ml roztworu inwertazy o tej samej temperaturze.
Natychmiast po wymieszaniu (próby odczynnikowe), a następnie dokładnie po 5, 10,
15 i 30 min. inkubacji w podanych temperaturach pobierać po 1 ml mieszaniny reakcyjnej do
odpowiednio oznakowanych probówek zawierających po 4 ml 0,1 M buforu glicynowego
o pH 10 (w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej). Podczas 30 min. inkubacji w temp.
40
o
C, 60
o
C, 80
o
C probówki powinny być szczelnie zatkane, aby uniknąć zmian stężenia w
wyniku parowania.
Dalszy tok postępowania jest zgodny z procedurą podaną przy wyznaczaniu
optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (ćwicz. 2).
Na jednym wykresie przedstawić dla każdej wartości temperatury krzywe progresji,
obrazujące zależność ilości (mg) uwolnionej glukozy-fruktozy od czasu reakcji (min).
Z prostoliniowego odcinka każdej krzywej progresji obliczyć odpowiednią szybkość
początkową reakcji v
0
(mg/min).
Na drugim wykresie przedstawić zależność szybkości początkowej reakcji od
temperatury.
Stężenie substratu – nadmiar (Ćwicz. 7)
Możliwe są dwa typy reakcji w zależności od stężenia substratu. Jeden z nich
cechuje początkowy wzrost szybkości reakcji wprost proporcjonalny do stężenia substratu,
a następnie stała szybkość pomimo wzrastającego stężenia substratu (obrazuje to krzywa
Michaelisa-Menten).
5
W drugim typie reakcji nadmiar substratu powoduje zahamowanie aktywności
enzymatycznej. Przyczyny inhibicji przez substrat reakcji są różne. Nadmiar substratu może
powodować „tłok” w centrum aktywnym i powstawanie „nieproduktywnych” kompleksów.
Przy wysokim stężeniu substratu jego cząsteczki mogą przyłączać się do centrum
allosterycznego i powodować częściową lub całkowitą inhibicję. Znaczne stężenie substratu
może być przyczyną niespecyficznej inhibicji ze względu na wzrost siły jonowej. Ponieważ
enzymy działają w środowisku wodnym, bardzo wysokie stężenie substratu prowadzi do
zmniejszenia stężenia wody, co może powodować spadek szybkości reakcji, szczególnie gdy
woda jest drugim substratem (w przypadku hydrolaz).
Badanie wpływu nadmiaru substratu na szybkość hydrolizy sacharozy
Przygotować probówki zawierające po 3 ml następujących roztworów sacharozy
w 0,1 M buforze octanowym o pH 4,7:
1,0 M;
0,8 M;
0, 4M;
0,2 M
Do każdej probówki dodać po 3 ml roztworu rozcieńczonego preparatu enzymatycznego,
zawierającego inwertazę (o optymalnym stężeniu, wyznaczonym w ćwicz. 2).
Natychmiast po wymieszaniu (próby odczynnikowe), a następnie dokładnie po 5, 10,
15 i 30 min. pobierać po 1ml mieszaniny inkubacyjnej do odpowiednio oznakowanych
probówek zawierających po 4 ml 0,1 M buforu glicynowego o pH 10 ( w celu zatrzymania
reakcji enzymatycznej).
Dalszy tok postępowania jest zgodny z procedurą podaną przy wyznaczaniu
optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (ćwicz. 2).
Dla każdego stężenia substratu sporządzić krzywą progresji - wykres zależności
ilości produktu (mg) od czasu reakcji (min.) i wyznaczyć szybkość początkową reakcji
v
0
(mg/min).
Sporządzić wykres przedstawiający zależność szybkości początkowej reakcji od
wysokich stężeń sacharozy.
Odczynniki - ćwicz. 4
1. 0,1 M bufor octanowy (octan sodu – kwas octowy) o pH 4,7
2. 0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
3. 0,1 M bufor glicynowy (glicyna – NaOH) o pH 10
4. Odczynnik Somogyi I
288 g Na
2
SO
4
(bezw.) rozpuścić w 1l H
2
O dest. Dodać 24 g soli Rochelle’a
(winian sodowo potasowy), 48 g Na
2
CO
3
, 32 g NaHCO
3
. Roztwór rozcieńczyć
do 1600 ml gotowaną H
2
O dest. i przechowywać w temp. 27
O
C.
5. Odczynnik Somogyi II
72 g Na
2
SO
4
(bezw.) rozpuścić w 300 ml wrzącej H
2
O dest. Dodać 8 g
CuSO
4
×H
2
O. Roztwór rozcieńczyć do 400 ml gotowaną H
2
O dest. i
6
przechowywać w temp. 27
O
C.
6. Mieszaninę odczynników Somogyi I i Somogyi II (stosunku 4:1) przygotowują
studenci bezpośrednio przed użyciem.
7. Odczynnik Nelsona
100 g molibdenianu amonu rozpuścić w 1,8 l H
2
O dest. Dodać 84 ml stęż.
H
2
SO
4
i roztwór arsenianu sodu (12 g Na
2
H-arsenian w 100 ml H
2
O).
Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz.
w temp. 37
O
C, potem w pokojowej.
Sprzęt
1. łaźnia wodna (100
o
C)
2. micro-shaker (wytrząsarka)
3. spektrofotometr
4. stoper
5. probówki ze szczelnymi korkami
6. probówki krótkie
7. pipety automatyczne
8. cylindry miarowe, zlewki, kolbki (poj. 50, 100, 250 ml)
ćwicz. 5
– jak w ćwicz. 4,
dodatkowo 0,2 M roztwory sacharozy sacharozy w buforze Mc Ilvaine’a o pH:
2,
3,
4,
4,8
6,
7,
8
ćwicz. 6
– jak w ćwicz. 4,
dodatkowo termostaty
ćwicz. 7
– jak w ćwicz. 4,
dodatkowo 1,0 M roztwór sacharozy w 0,1 M buforze octanowym o pH 4,7.