1
ZAKŁAD BIOCHEMII
ENZYMOLOGIA
Biochemia i Biotechnologia
UMCS
(KP/KR)
2012
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH – II
Ćwicz. 3
Wyznaczanie stałych kinetycznych (V
max
i K
M
)
Celem badań kinetyki reakcji enzymatycznych jest uzyskanie informacji o ich
przebiegu w czasie, a więc o szybkości zaniku substratów i powstawania produktów.
Wyznaczone stałe kinetyczne pozwalają na wnioskowanie o liczbie i kolejności przyłączania
cząsteczek substratu do enzymu i odłączania cząsteczek produktów z kompleksu aktywnego,
o liczbie kompleksów pośrednich i izomeryzujących form enzymu oraz o efektach działania
inhibitorów lub aktywatorów.
Badania te prowadzą do stworzenia modelu kinetycznego, będącego zbiorem
wyrażeń matematycznych pozwalających przewidywać efekt działania enzymu w obecności
określonego stężenia substratu, z jednoczesnym uwzględnieniem ilościowego udziału
wszystkich etapów reakcji enzymatycznej.
Najstarszy model kinetyczny dla ilościowego opisu nieodwracalnej reakcji
enzymatycznej z jednym substratem, przebiegającej według schematu:
2
1
k
1
E
S
ES
E
P
przedstawili Leonor Michaelis i Maud Menten (1913).
Podstawy teorii Michaelisa–Menten są następujące:
1. Główne założenie:
Istnieje szybko ustalający się stan równowagi reakcji:
1
1
E
S
(ES)
który nie jest zaburzony przez dużo powolniejszy rozpad kompleksu (ES) na enzym
i produkt:
P
E
(ES)
2
k
2
2. Maksymalna szybkość reakcji: V
max
= k
+2
[E]
0
3. Stała K:
1
1
-
S
k
k
K
K
S
jest stałą dysocjacji kompleksu przejściowego (tzw. stała substratowa)
-1
2
2
M
S
1
1
k
k
k
K
K
k
k
K
M
jest stałą Michaelisa (wyprowadzoną przez Briggsa i Haldane’a), jej wartość liczbowa
odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym początkowa szybkość reakcji równa jest
połowie szybkości maksymalnej.
4. Warunek równoważności K
M
K
S
Równoważność stałych K
M
i K
S
występuje bardzo często w reakcjach enzymatycznych,
ponieważ kompleks przejściowy tworzy się przy udziale słabych oddziaływań
drugorzędowych, natomiast rozpad kompleksu na produkty i enzym wymaga przegrupowań
atomowych i rozerwania lub syntezy wiązań kowalencyjnych.
Wtedy k
-1
> k
+2
5. Warunek nierównoważności K
M
K
S
Utworzenie kompleksu przejściowego wymaga utworzenia wiązań kowalencyjnych, wtedy
k
-1
≤ k
+2
Zależność początkowej szybkości reakcji enzymatycznej w stanie stacjonarnym
(warunek d[ES]/dt = 0) od początkowego stężenia substratu jest określona równaniem:
max
0
0
M
0
V
S
v
K
S
v
0
– początkowa szybkość reakcji
V
max
– maksymalna szybkość reakcji
[S]
0
– początkowe stężenie substratu
K
M
– stała Michaelisa
3
Występujące w podanym powyżej równaniu hiperbolicznej kinetyki stacjonarnej
stałe kinetyczne K
M
i V
max
można wyznaczyć przez graficzne dopasowanie hiperboli do
doświadczalnych wartości v
0
i [S]
0
, ale postępowanie takie obarczone jest dużym błędem.
Istnieje kilka przekształconych form równania Michaelisa-Menten dających prostoliniową
zależność obu zmiennych. Najczęściej stosowaną metodą linearyzaji krzywej hiperbolicznej
jest metoda Lineweavera-Burke’a, która określa zależność 1/v
0
od 1/[S]
0
zgodnie
z równaniem:
M
0
max
max
0
K
1
1
1
v
V
V
S
Wykonanie ćwiczenia
Przygotować probówki zawierające po 3 ml następujących roztworów sacharozy
w 0,1 M buforze octanowym o pH 4,7:
0,2 M;
0,1 M;
0,05 M;
0,025 M
Do każdej probówki dodać po 3 ml roztworu rozcieńczonego preparatu enzymatycznego,
zawierającego inwertazę (o optymalnym stężeniu, wyznaczonym na poprzednich ćwiczeniach
– ćwicz. 2).
Natychmiast po wymieszaniu (próby odczynnikowe), a następnie dokładnie po 5, 10,
15 i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do odpowiednio oznakowanych
probówek zawierających po 4 ml 0,1 M buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania
reakcji enzymatycznej).
Dalszy tok postępowania jest zgodny z procedurą podaną przy wyznaczaniu
optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (ćwicz. 2).
Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie (μg/ml) monosacharydów uwolnionych
podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy, a następnie obliczyć ilość powstałych
produktów uwzględniając rozcieńczenie mieszaniny inkubacyjnej (30
):
Ilość produktu (μg) = A
520
× f (
μg/ml) × 1 ml × 30
Dla każdego stężenia substratu sporządzić krzywą progresji - wykres zależności
ilości produktu (mg) od czasu reakcji (min.) i wyznaczyć szybkość początkową reakcji.
Szybkość początkowa reakcji v
0
to tg α, nachylenie stycznej do krzywej progresji
w punkcie odpowiadającym stężeniu produktu w czasie t = 0 min., przechodzącej zawsze
przez początek układu współrzędnych.
4
Stężenie początkowe
substratu [S]
0
Ilość produktu (mg)
w zależności od czasu
Szybkość początkowa
(mg/min)
v
0
= tg α
5 min
10 min
15 min
30 min
0,2 M
0,1 M
0,05 M
0,025 M
Na podstawie szybkości początkowych wyznaczonych dla każdego stężenia
substratu wykreślić zależność tych szybkości od stężenia początkowego substratu (krzywą
Michaelisa-Menten).
Sporządzić wykres dla równania Lineweavera-Burke’a, wyznaczyć stałą Michaelisa
(K
M
) i szybkość maksymalną reakcji (V
max
).
Odczynniki
1. 0,1 M bufor octanowy (octan sodu – kwas octowy) o pH 4,7
2. 0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
3. 0,1 M bufor glicynowy (glicyna – NaOH) o pH 10
4. Odczynnik Somogyi I
288 g Na
2
SO
4
(bezw.) rozpuścić w 1l H
2
O dest. Dodać 24 g soli Rochelle’a
(winian sodowo potasowy), 48 g Na
2
CO
3
, 32 g NaHCO
3
. Roztwór rozcieńczyć
do 1600 ml gotowaną H
2
O dest. i przechowywać w temp. 27
O
C.
5. Odczynnik Somogyi II
72 g Na
2
SO
4
(bezw.) rozpuścić w 300 ml wrzącej H
2
O dest. Dodać 8 g
CuSO
4
×H
2
O. Roztwór rozcieńczyć do 400 ml gotowaną H
2
O dest. i
przechowywać w temp. 27
O
C.
6. Mieszaninę odczynników Somogyi I i Somogyi II (stosunku 4:1) przygotowują
studenci bezpośrednio przed użyciem.
7. Odczynnik Nelsona
100 g molibdenianu amonu rozpuścić w 1,8 l H
2
O dest. Dodać 84 ml stęż.
H
2
SO
4
i roztwór arsenianu sodu (12 g Na
2
H-arsenian w 100 ml H
2
O).
Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz.
w temp. 37
O
C, potem w pokojowej.
Sprzęt
1. łaźnia wodna (100
o
C)
2. micro-shaker (wytrząsarka)
3. spektrofotometr
4. stoper
5. probówki ze szczelnymi korkami
6. probówki krótkie
7. pipety automatyczne
8. cylindry miarowe, zlewki, kolbki
(poj. 50, 100, 250 ml)