AMINOKWASY
1. Analiza jakościowa aminokwasów
Na podstawie reakcji a, b, c rozróżnić następujące związki: prolinę, metioninę, cysteinę,
tyrozynę, kwas bursztynowy
a. Odróżnianie aminokwasów od innych związków
Wykonanie:
Odmierzyć do 5 probówek po 0,5 cm
3
roztworów oznaczonych jako A, B, C, D, E. Do wszystkich
probówek dodać po 0,5 cm
3
0.1% roztworu ninhydryny w acetonie i ogrzewać przez trzy minuty
na łaźni wodnej. Pojawia się intensywne zabarwienie fioletowe w obecności wolnego aminokwasu
lub żółte w obecności wolnego iminokwasu. Reakcja ta może być używana do ilościowego
oznaczania wolnych aminokwasów, a reakcja z tzw. kwaśną ninhydryną (roztwór ninhydryny w
mieszaninie kwasu octowego i fosforowego) do ilościowego oznaczania wolnej proliny.
Rys. 16. Wzory strukturalne A. izoleucyny i B. proliny (iminokwasu)
A B
b. Wykrywanie wolnych grup tiolowych
Zasada:
Do aminokwasów zawierających atomy siarki należy metionina, cysteina i cystyna (Rys. 17). W
celu wykrycia obecności grupy tiolowej należy do eksperymentu wziąć cysteinę lub cystynę,
bowiem metionina ma atom siarki związany z grupą metylową.
Rys. 17. Wzory strukturalne A. metioniny, B. cysteiny i C. cystyny.
A B C
Wykonanie:
Odmierzyć do probówek po 0,5 cm
3
roztworów niezidentyfikowanych w punkcie a. Do każdej
próby dodać po 1 cm
3
20% roztworu NaOH oraz po 0,25 cm
3
2% roztworu octanu ołowiowego.
Ogrzewać przez 3 do 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. W obecności grup tiolowych tworzy się
brunatnoczarny osad.
c. Wykrywanie obecności pierścieni aromatycznych
Zasada:
Do aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny zaliczane są: tryptofan, tyrozyna i
fenyloalanina (Rys. 18). Ten ostatni aminokwas jest na tyle niestabilny, że w poniżej
przedstawionej reakcji w roztworze wodnym pierścień aromatyczny ulega rozerwaniu. Obecność
grup -OH przy pierścieniu zwiększa natomiast jego trwałość. Z tego względu eksperyment lepiej
wykonać na tyrozynie i tryptofanie.
Rys. 18. Wzory strukturalne aminokwasów aromatycznych
Wykonanie:
Odmierzyć do probówek po 0,5 cm
3
roztworów niewyeliminowanych w podpunktach a i b. Do
każdej próby dodać po 0,5 cm
3
stężonego kwasu azotowego i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej
łaźni wodnej. Po ostudzeniu dodać ostrożnie (!), małymi porcjami, i ciągle mieszając po 1,75 cm
3
20% roztworu NaOH. W obecności pierścieni aromatycznych pojawia się pomarańczowe
zabarwienie.
Sprawozdanie:
Podać jakie związki były oznaczone literami A, B, C, D, E i na jakiej podstawie poszczególne
aminokwasy zostały rozróżnione.
2. Oznaczanie ilościowe aminokwasów metodą formaldehydową Sorensena
Zasada:
Formaldehyd (HCOH) kondensuje z grupą aminową aminokwasów wydzielając wodę i tworząc
grupę -N=CH
2
. Tym samym aminokwasy tracą właściwości amfoteryczne i można je
miareczkować wodorotlenkiem sodowym w obecności fenoloftaleiny.
COOH
COOH
|
|
H-C-NH
2
+ HCOH = H-C-N=CH
2
+ H
2
O
|
|
R
R
Wykonanie:
Pobrać 10 cm
3
roztworu glicyny do kolby stożkowej, dodać 20 cm
3
20% formaliny (pod wyciągiem) i
zmiareczkować 0,1 mol/dm
3
roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny. Oddzielnie w ten sam sposób
wykonać miareczkowanie ślepej próby (do formaliny dodać wodę destylowana zamiast roztworu
aminokwasu zachowując proporcje objętościowe oraz dwie krople fenoloftaleiny). Z różnicy ilości
zużytego NaOH wyliczyć ilość moli aminokwasu w próbce. Wynik podać w mg/cm
3
. Biorąc pod
uwagę, że 1 mol NaOH reaguje z 1 molem aminokwasu można wyliczyć, że 1 cm
3
0,1 M roztworu
NaOH odpowiada 100 mikromolom aminokwasu.
3. Miareczkowanie aminokwasu
Wykonanie:
Do zlewki o pojemności 50 cm
3
nalać 20 cm
3
roztworu trzech różnych aminokwasów, np.
alaniny, kwasu glutaminowego i lizyny o stężeniu 1 mol
dm
-3
. Zlewkę ustawić na mieszadle
magnetycznym, wrzucić do środka „element mieszający”, uruchomić mieszadło i umieścić w
zlewce elektrodę pH-metru w sposób uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH.
Dodawać stopniowo (po 0,5 cm
3
) 10 cm
3
1 molowego roztworu HCl. Każdorazowo, po
ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość. Powtórzyć procedurę używając do
miareczkowania roztworu NaOH o stężeniu 1 mol
dm
-3
.
Rys. 19. Przykładowa krzywa miareczkowania glicyny
Sprawozdanie:
Na podstawie obydwu wyników narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na
osi y ilość dodanego HCl (wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu
wartość punktu izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pK
a
i pK
b
(punkty
przegięcia krzywej). Narysować na wykresie w jakich formach jonowych występuje dany
aminokwas na poszczególnych odcinkach krzywej, oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg.
4. Chromatografia bibułowa aminokwasów
Zasada:
Informacje na temat metod chromatograficznych podano na str…..
Wykonanie:
Przygotować cztery szalki Petri’ego. Do dolnej części każdej z szalek wlać rozpuszczalnik
(mieszaninę trzeciorzędowego butanolu, 88% kwasu mrówkowego i wody w stosunku
objętościowym 15:15:70). Z bibuły wyciąć 4 krążki o średnicy trochę większej niż szalka. W
każdym krążku naciąć pasek o szerokości 5 mm dochodzący do środka krążka i zagiąć tak, by
tylko on sięgał do rozpuszczalnika w szalce, a reszta krążka była w powietrzu. W odległości 2
mm od środka krążka zakreślić ołówkiem na naciętym pasku kółeczko o średnicy 1,5 mm (Rys.
20 b). Na narysowaną kroplę nakładać powoli 1% roztwory: glicyny, fenyloalaniny, seryny i
badanego aminokwasu (na jeden krążek po jednym aminokwasie). Nanoszenie przeprowadzamy
stopniowo (tak by mokra plama nie wyszła poza zaznaczone pole) za pomocą pipety o
pojemności 0,2 do 10
l. Po dodaniu każdej kolejnej kropli bibułę należy przesuszyć. Łącznie
należy nanieść 20
l aminokwasu.
Rys. 20. Schemat chromatografii bibułowej aminokwasu
a) widok ogólny
b) nakładanie aminokwasu c) sposób odczytu R
f
Krążek bibuły umieścić między dwoma częściami szalki, tak, aby koniec zgiętego paska
zanurzył się w rozpuszczalniku, a brzegi wystawały poza szalkę (Rys. 20 a). Tym paskiem
rozpuszczalnik będzie podsiąkał i stopniowo rozprowadzał aminokwas ku brzegom krążka. Po
około godzinie, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do brzegu bibuły, wyjąć chromatogram i
zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika. Całość wysuszyć w 110
C i spryskać 0,1%
roztworem ninhydryny w 95% etanolu. Wysuszyć ponownie w 110
C i obrysować ołówkiem
barwny krążek. Obliczyć współczynnik migracji R
f
dla każdego wzorcowego i badanego
aminokwasu według wzoru:
B
A
R
f
(Rys. 20 c). Zidentyfikować nieznany aminokwas
porównując wartości R
f
nieznanego aminokwasu z R
f
wzorców.
5. Oznaczanie zawartości proliny
Zasada:
Prolina jest aminokwasem syntetyzowanym często w reakcji obronnej rośliny na stresy
powodujące odwodnienie cytoplazmy, przykładowo w czasie suszy czy w trakcie wzrostu
rośliny w zasolonym podłożu. Główną rolą proliny jest obniżenie potencjału osmotycznego
komórki dla wyrównania stężeń jonów pomiędzy wakuolą, gdzie są akumulowane sole, a
cytoplazmą. Ponadto, prolina chroni strukturę białek i błon cytoplazmatycznych przed ujemnymi
skutkami zbyt dużego stężenia jonów soli.
Wykonanie:
Ilościową analizę zawartości wolnej proliny wykonuje się najczęściej metodą kolorymetryczną
(Bates i in. 1973). Tkankę roślinną o masie 250 mg homogenizować w 3% kwasie
sulfosalicylowym, a następnie odwirować przy 14 000 obr./min. Do 2 cm
3
supernatantu dodać 2
cm
3
lodowatego kwasu octowego i 2 cm
3
kwaśnej ninhydryny (1,25 g ninhydryny rozpuścić w
30 cm
3
lodowatego kwasu octowego i 20 cm
3
6 M kwasu ortofosforowego). Całość zmieszać na
wstrząsarce, a następnie inkubować przez 1 godzinę w 100ºC. Po zatrzymaniu reakcji w lodzie
do próbek dodać 4 cm
3
toluenu i ponownie wytrząsać. Toluen zawierający barwnik odessać
znad fazy wodnej i po osiągnięciu temperatury pokojowej zmierzyć jego absorbancję przy
=520 nm względem ślepej próby, którą stanowił toluen. Stężenie aminokwasu obliczyć na
podstawie równania regresji liniowej dopasowanego do punktów krzywej kalibracyjnej
wykonanej dla roztworów proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym o stężeniu: 3,62; 7,25; 12,5;
25 i 100 μg/cm
3
.
Piśmiennictwo:
Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D., 1973. Rapid determination of free proline for water stress
studies. Plant and Soil 39: 205-207.
BIAŁKA
Najczęściej stosowane metody oznaczania białek
Elektroforeza SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis),
Elektroforeza to przemieszczanie się obdarzonych ładunkiem cząstek (jonów) w polu
elektrycznym, np. cząsteczek białek lub kwasów nukleinowych. Większość metod
elektroforetycznych wykorzystuje specyficzne nośniki, tj. żele poliakrylamidowe lub agarozowe,
lub bibułę. Przemieszczanie się jonów w polu elektrycznym zależy od ich ładunku, wielkości i
kształtu. Im większy jon lub bardziej rozbudowany jego kształt, tym wolniej porusza się w polu
elektrycznym, a im bardziej naładowany – tym porusza się szybciej. Jony naładowane ujemnie
migrują do anody, a naładowane dodatnio – do katody. W przypadku cząstek zawierających w
swym składzie ugrupowania naładowane dodatnio i ujemnie (np. białka), o kierunku migracji
decyduje ich ładunek wypadkowy.
Białka najczęściej rozdzielamy metodą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych w
obecności SDS (dodecylosiarczan sodu), w której ich rozdział jest zależny tylko od ich
wielkości. SDS jest detergentem anionowym denaturującym i „spłaszczającym” białko, w
wyniku czego łańcuch polipeptydowy a) traci struktury wyższego rzędu, b) staje się anionem.
Dodatkowo, przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych białka i w wyniku tego jego
poszczególne łańcuchy polipeptydowe funkcjonują w roztworze niezależnie od siebie. W
efekcie, wszystkie białka (łańcuchy polipeptydowe) mają taki sam liniowy kształt oraz ładunek
ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości. Białka na ogół są
bezbarwne, w związku z tym po przeprowadzonym rozdziale żel trzeba zabarwić, aby
uwidocznić obecne w nim białka. W tym celu najczęściej stosuje się barwienie błękitem
kumasyny lub związkami srebra.
SDS-PAGE wykorzystuje się także do wyznaczania masy cząsteczkowej analizowanego białka
(przez porównanie z wielkością białek wzorcowych) oraz do określania liczby jego podjednostek
polipeptydowych.
Rys. 21. Zestaw do elektroforezy żelowej
Rys. 22. Schemat nanoszenia próbek do studzienek zawierających żel oraz zasada rozdziału
białek
Rys. 23. Przykładowy żel poliakrylamidowy ujawniający obecność enzymu SOD (białe prążki).
Elektroforeza kapilarna (CE - capillary electrophoresis)
Elektroforeza kapilarna to nowa metoda analityczna, wykorzystująca efekt elektroforezy do
separacji jonów oraz naładowanych makrocząsteczek i agregatów cząsteczek, zachodzący w
cienkiej kapilarze kwarcowej. Pomimo odmiennego mechanizmu rozdziału, wykazuje ona wiele
podobieństw do metod chromatograficznych. Istnieją różne typy sorbentów, przeznaczonych do
oczyszczania wielu różnych rodzajów próbek. Rurki zawierające sorbenty SPE przypominają
plastikowe strzykawki. Specjalne akcesoria umożliwiają jednoczesną pracę z kilkunastoma
próbkami. Metoda SPE jest prosta, szybka i tania, nie wymaga zaawansowanych umiejętności
ani stosowania skomplikowanej aparatury. W porównaniu z innymi metodami znacznie
ogranicza zużycie rozpuszczalników.
Rys. 24. Przykładowy aparat do elektroforezy kapilarnej
Rys. 25. Zasada wykrywania białek przy użyciu elektroforezy kapilarnej
Ćwiczenia
1. Wykrywanie wiązań peptydowych (reakcja biuretowa - Piotrowskiego)
Zasada:
Reakcja biuretowa polega na tworzeniu kompleksu miedzi z atomami tlenu i azotu z wiązań
peptydowych -CO-NH- o charakterystycznej fioletowej barwie. Warunkiem koniecznym
zachodzenia reakcji jest by w cząsteczce związku występowały przynajmniej dwa takie wiązania.
Stąd nazwa reakcji „biuretowa", ponieważ najprostszym związkiem spełniającym ten warunek jest
dwumocznik, czyli biuret NH
2
-CO-NH-CO-NH
2
(produkt powstały w wyniku ogrzania mocznika).
W białkach występuje wiele wiązań peptydowych, których enolowe formy tautomeryczne HO-
C=N- dają reakcję biuretową. Kompleks z jonem miedzi tworzą dwa atomy tlenu (wiązania atomo-
we) i cztery atomy azotu (wiązania koordynacyjne).
Wykonanie:
Do trzech probówek wlać po 2 cm
3
roztworu białka z jaja kurzego, kazeiny i glicyny (do każdej
probówki po jednym roztworze), a następnie do każdej z nich dodać po 2 cm
3
10% NaOH i parę
kropel 0,5% CuSO
4
. W obecności wiązań peptydowych pojawia się fioletowa barwa.
Uwaga! nie stosować zbyt dużej objętości CuSO
4
, ponieważ jego niebieska barwa może maskować
pozytywny wynik reakcji biuretowej.
2. Miareczkowanie białka
Zasada:
Krzywa zmian pH podczas miareczkowania mocnego kwasu mocną zasadą ma charakterystyczny,
esowaty kształt z bardzo stromym przebiegiem przy pH około 7. Miareczkowanie aminokwasu daje
przebieg z dwoma skokami pH przy zobojętnianiu grup aminowych i karboksylowych. W
przypadku miareczkowania białka składającego się z różnych aminokwasów krzywa
miareczkowania ma przebieg łagodny, pozwalający wyznaczyć ich pojemność buforową (ilość
kwasu lub zasady powodującą określoną zmianę pH). Własności buforujące białek w komórkach
łagodzą zmiany pH spowodowane np. wymianą jonową, tworzeniem i rozkładem różnych kwasów,
spożyciem kwaśnych pokarmów, zmianą równowagi pomiędzy jonami węglanowymi i
wodorowęglanowymi itp.
Wykonanie:
Do 2 zlewek o pojemności 100 cm
3
wlać po 40 cm
3
wody, a do dwóch następnych po 40 cm
3
1%
kazeiny. Zlewki ustawić na mieszadle magnetycznym, wrzucić do środka „myszkę” (element
mieszający), uruchomić mieszadło i umieścić w zlewce elektrodę pH-metru w sposób
uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH. Następnie jedną parę roztworów (woda,
białko) miareczkować 0,5 M HCl (do osiągnięcia pH < 4), a drugą parę miareczkować 0,5 M NaOH
(do pH > 10). Kwas solny i wodorotlenek sodu dodawać porcjami (po 1 cm
3
za pomocą pipety
automatycznej). Każdorazowo, po ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość.
Sprawozdanie
Narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na osi y ilość dodanego HCl
(wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu wartość punktu
izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pK
a
i pK
b
(punkty przegięcia
krzywej) oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg.
3. Właściwości ochronne koloidów hydrofilnych
Zasada:
Białka są cząsteczkami wykazującymi ładunek dodatni lub ujemny, w zależności od przewagi
budujących je aminokwasów kwaśnych lub zasadowych. Białka mają zatem wybitnie charakter
hydrofilny i są w roztworach otoczone dipolami wody, tworzącymi tzw. otoczkę wodną wokół
każdej cząsteczki. Koloidy hydrofilne, same trwałe w środowisku wodnym i nie ulegające
samorzutnej koagulacji, mogą osadzać się na powierzchni innych nietrwałych koloidów, i
wówczas oddziałują jako czynnik zwiększający ich trwałość, wytwarzając na ich powierzchni
wspólną otoczkę wodną. W ten sposób białka np. spowolniają proces łączenia się micelli
tłuszczu, bądź też nie dopuszczają do reakcji poszczególnych jonów ze sobą.
Rys. 26. Cząsteczka białka z otoczką wodną
Wykonanie:
Do 2 probówek wlać po 2 cm
3
0,01 mol·dm
-3
roztworu AgNO
3
i kilka kropel rozcieńczonego
HNO
3
. Następnie do pierwszej probówki dodać 2 cm
3
0,5-proc. roztworu albuminy lub białka z
jaja kurzego, a do drugiej 2 cm
3
wody. Po zmieszaniu do obydwu probówek wlać kroplami 4
cm
3
0,01 mol·dm
-3
NaCl. W probówce z białkiem nie wytrąca się charakterystyczny osad AgCl.
4. Wysalanie białek
Zasada:
Białka ulegają wysoleniu z roztworu wodnego pod wpływem wysokiego stężenia soli, takich jak
MgSO
4
, NaCl, Na
2
SO
4
oraz przede wszystkim (NH
4
)
2
SO
4
. Mechanizm procesu polega na
konkurencji o wodę i w konsekwencji – na niszczeniu otoczki wodnej miceli białkowych. Proces
ten jest odwracalny, tzn. osad białkowy rozpuszcza się ponownie po zmniejszeniu stężenia soli.
Białka z grupy globulin wysalają się już przy 50% nasycenia siarczanem amonowym, podczas
gdy albuminy tracą trudniej otoczkę wodną i wysalają się dopiero przy całkowitym wysyceniu
roztworu siarczanem amonowym. Ta właściwość globulin i albumin pozwala rozdzielić te grupy
białek podczas stopniowego zwiększania stężenia siarczanu amonowego. Stosowana jest też
często do oczyszczania innych białek, gdyż poszczególne białka ulegają wytrącaniu przy
właściwym im stopniu wysycenia roztworu siarczanu amonowego.
Wykonanie:
Do 100 cm
3
kolby stożkowej wlać 20 cm
3
roztworu białka jaja kurzego i następnie równą
objętość nasyconego roztworu (NH
4
)
2
SO
4
. Wymieszać i odstawić na kilka minut dla wytrącenia
osadu globulin. Osad oddzielić poprzez filtrowanie lub wirowanie. Następnie do roztworu dosy-
pywać małymi porcjami krystaliczny siarczan amonowy mieszając roztwór intensywnie. Kiedy
pierwsza porcja soli nie rozpuści się, przerwać proces i odstawić roztwór na kilka minut. W tych
warunkach wytrącają się albuminy. Osad oddzielić poprzez filtrowanie lub wirowanie. Obydwa
osady białkowe rozpuścić w wodzie.
5. Wyznaczanie wartości punktu izoelektrycznego białka
Zasada:
Wiele właściwości białek jest związanych z ich strukturą pierwszorzędową, wynikającą z sekwencji
(kolejności) aminokwasów, między którymi powstają wiązania peptydowe. Większość aminokwasów
posiada jedną grupę aminową (o charakterze zasadowym) i jedną grupę karboksylową (o charakterze
kwasowym). Grupy te łącząc się ze sobą tworzą wiązania peptydowe i w związku z tym tracą
dotychczasowe właściwości. W powstających łańcuchach polipeptydowych zbudowanych z reszt
aminokwasowych takiego typu występowałaby tylko jedna wolna grupa aminowa na N-końcu i jedna
grupa karboksylowa na C-końcu łańcucha peptydowego. Ponieważ w skład cząsteczek białek wchodzą
również reszty aminokwasów jednoamino-dwukarboksylowych (kwas asparaginowy, kwas
glutaminowy) oraz (diamino?) dwuamino-jednokarboksylowych (lizyna, arginina, histydyna), w białku
pozostaje pewna liczba wolnych grup aminowych i karboksylowych. Gdy więcej jest wolnych grup kar-
boksylowych niż aminowych, wówczas cząsteczki dysocjując w środowisku o odczynie obojętnym
wykazują właściwości kwasów: w obrębie cząsteczek występuje w takich warunkach więcej ładunków
ujemnych niż dodatnich. W cząsteczkach białek zasadowych natomiast, znajdujących się w środowisku o
odczynie obojętnym, występuje więcej ładunków dodatnich niż ujemnych. Przewaga ładunków
jednoimiennych (dodatnich lub ujemnych) sprzyja wiązaniu wody przez cząsteczki białka na zasadzie
oddziaływania elektrostatycznego na dipole wody. Prowadzi to do tworzenia się otoczek wodnych wokół
cząsteczek białka. Roztwór koloidowy białka jest wówczas trwały, gdyż poszczególne cząsteczki nie
łączą się w agregaty, które mogłyby tworzyć zawiesinę wytrącającą się z roztworu (koagulacja).
Zwiększanie stężenia jonów wodorowych (pH maleje) w środowisku powoduje cofanie dysocjacji grup
karboksylowych i ułatwianie dysocjacji grup aminowych, a obniżenie stężenia H
+
(pH rośnie) wywołuje
efekt odwrotny. Dla każdego białka można dobrać taki odczyn środowiska, przy którym jest ono w
jednakowym stopniu zdysocjowane jako kwas i jako zasada. Wartość takiego odczynu (w jednostkach
pH) jest określana mianem punktu izoelektrycznego. Dla białek kwaśnych wartości punktu
izoelektrycznego są niższe od 7, a dla białek zasadowych wyższe. W punkcie izoelektrycznym liczby
ładunków ujemnych i dodatnich w obrębie cząsteczek białka są jednakowe, wskutek czego wypadkowy
ładunek jest równy zero. Z tego powodu zanika oddziaływanie elektrostatyczne cząsteczek białka na
cząsteczki wody. Cząsteczki białka w takich warunkach z łatwością tracą otoczki wodne, co sprzyja ko-
agulacji. Białka w punkcie izoelektrycznym wykazują zatem zmniejszone powinowactwo do wody i
dlatego odczyn środowiska może również wpływać na pęcznienie koloidów białkowych. W układach
biologicznych skutki tego oddziaływania zazwyczaj nie są wyraźnie widoczne w związku z dużą różno-
rodnością białek posiadających różne wartości punktu izoelektrycznego.
Wykonanie:
Do 8 probówek odmierzyć wodę destylowaną i kwas octowy o stężeniu w ilościach podanych w
tabeli 2, zmierzyć pH w probówkach i zanotować w tabeli. Następnie dodać po 1 cm
3
roztworu
kazeiny rozpuszczonej w octanie sodowym. Zawartość probówek wymieszać i po około 5 minutach
ocenić stopień zmętnienia płynów w poszczególnych probówkach.
Substancje
[cm
3
]
Nr probówki
1
2
3
4
5
6
7
8
woda destylowana
8,9 8,8 8,5 8,0
7,0
5,0
1,0
0,0
kwas octowy 0,05 mol dm
-3
0,1 0,2 0,5 1,0
2,0
4,0
8,0
9,0
roztwór kazeiny w octanie
sodowym
1,0 1,0 1,0 1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
pH roztworu
stopień zmętnienia
5. Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości białka w materiale roślinnym
Wykonanie:
Pobrać 1 g świeżej masy liścia badanej rośliny i utrzeć w moździerzu w ciekłym azocie. Po
odparowaniu azotu, podczas ucierania, dodawać stopniowo 3 cm
3
buforu ekstrahującego Tris-
HCl (0,0625 mol
dm
-3
, pH 6,8). Homogenat przenieść do probówki wirówkowej, moździerz
przepłukać kolejnymi 3 cm
3
buforu, które należy dodać do homogenatu. Następnie próbki
odwirować przez 10 minut przy 13 000 obr./min.
Sporządzanie krzywej kalibracyjnej
Przygotować wyjściowy roztwór BSA (albuminy wołowej) o stężeniu 10 mg
cm
-3
w buforze
ekstrahującym (rozpuścić 100 mg BSA w 10 cm
3
wody destylowanej). Do probówki pobrać 2
cm
3
roztworu wyjściowego i dopełnić 8 cm
3
wody destylowanej uzyskując w ten sposób stężenie
2 mg w 1 cm
3
. Z roztworu tego pobrać 5 cm
3
do następnej probówki i dopełnić 5 cm
3
wody
uzyskując roztwór o stężeniu 1 mg białka w 1 cm
3
. W ten sposób, metodą kolejnych rozcieńczeń
przygotować roztwory zawierające dalsze stężenia tj. 0,5; 0,25 i 0,125 mg BSA w 1 cm
3
.
Przygotować odczynnik Bradford: 60 mg odczynnika Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpuścić
w 1 litrze 3% kwasu nadchlorowego i przefiltrować przez bibułę filtracyjną. Absorbancja
uzyskanego roztworu powinna mieścić się w przedziale 1,3-1,5 przy długości fali 465 nm.
Do każdej z kuwetek spektrofotometrycznych o objętości 3 cm
3
dodać po 0,5 cm
3
wody
destylowanej, 0,5 cm
3
odczynnika Bradford oraz 0,18 cm
3
buforu ekstrakcyjnego (Tris-HCl) a
następnie po 0,02 cm
3
z każdego z roztworów wzorcowych oraz z supernatantu uzyskanego po
odwirowaniu próbek roślinnych. Po zmieszaniu na wstrząsarce laboratoryjnej kuwety odstawić
na 5 minut, po czym zmierzyć wartość absorbancji przy
= 595 nm względem ślepej próby
sporządzonej z 200
l buforu i 1 cm
3
odczynnika Bradford.
Sprawozdanie
Za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Excel wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć
równanie regresji liniowej zależności absorbancji od stężenia BSA (wzorca). Z równania regresji
odczytać zawartość białka w badanej próbce (mg/cm
3
). Wartość tą należy przemnożyć przez 7
(można założyć, że 6 cm
3
buforu ekstrahującego + 1g świeżej tkanki daje około 7 cm
3
mieszaniny) otrzymując zawartość białka w 1 g świeżej masy.