1 

 

Ćwiczenie 2 

Temat: Fizjologia bakterii 

 

Demonstracja i omówienie: 

1.  Podłoża bakteriologiczne wykorzystywane w rutynowym badaniu mikrobiologicznym.  

2.  Posiew izolacyjny na podłoże stałe i posiew na podłoże płynne. 

 

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 

 

Zadanie 1.

 Wykonanie posiewu izolacyjnego bakterii na podłożu stałym 

Cel: Zapoznanie się z technikami izolacji drobnoustrojów w laboratoriach mikrobiologicznych 

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (dotyczy zadań 1A, 1B) i 6-osobowych (1C) 

 

Posiew izolacyjny bakterii 

 

1)  Pobrać jałową ezą bakterie (1 oczko ezy) 

2)  Nanosić bakterie na podłoże według załączonego schematu 

Uwaga! W sektorach B, C i D wykonywać posiewy wyłącznie jałową, ostudzoną ezą! 

3)  Po wykonaniu zadania opalić ezę nad płomieniem palnika i odłożyć do statywu 

Schemat: 

 

 

 

 

 

 

 

 

Obróć płytkę o 90° 

Obróć płytkę o 90° 

Obróć płytkę o 90° 

Opal ezę 

Opal 
ezę 

 

2 

 

1A.  Cel:  Badanie wymagań odżywczych bakterii 

 

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa wykonuje posiew izolacyjny 1 hodowli 

bakteryjnej) 

 

 

Materiał:  

 

24-48 godz. hodowle drobnoustrojów na podłożu krwawym (Streptococcus sp.,  

Neisseriae sp., Staphylococcus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Bacillus sp.) 

 

płytki z podłożem wzbogaconym (agar krwawy) 

 

płytki z podłożem zwykłym (agar mięsny) 

 

cieplarka na temp. 37°C 

 

Badanie wymagań odżywczych bakterii 

 

1)  Wykonać posiew izolacyjny bakterii na podłoże zwykłe i podłoże wzbogacone  

2)  Płytki inkubować w cieplarce w 37°C przez 24-48 godzin 

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH! 

3)  Po inkubacji odczytać wynik:  

 

porównać intensywność wzrostu bakterii na badanych podłożach 

 

określić, która grupa drobnoustrojów ma większe wymagania odżywcze 

 

Wyniki: 

 

Tabela 1A 

Bakterie 

Wzrost 

(- , +, ++, +++) 

Interpretacja wyników 

(drobnoustrój 

wymagający/niewymagający) 

podłoże  

zwykłe 

podłoże 

wzbogacone 

Streptococcus sp. 

 

 

 

Neisseriae sp.  

 

 

 

Staphylococcus sp.  

 

 

 

Corynebacterium sp.   

 

 

Escherichia sp. 

 

 

 

Bacillus sp. 

 

 

 

 

 

 

3 

 

 

1B. Cel: Badanie wymagań tlenowych bakterii  

 

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa otrzymuje 1 drobnoustrój) 

Materiał:  

  24-48 godz. hodowle drobnoustrojów na agarze mięsnym:  Pseudomonas sp., Escherichia 

sp., Micrococcus sp., Serratia sp., Klebsiella sp., Enterococcus sp. 

 

2 płytki z podłożem zwykłym (agar mięsny) 

  cieplarka na temp. 37°C 

 

Badanie wymagań tlenowych bakterii 

 

1)  Wykonać posiew izolacyjny bakterii na 2 podłoża  

2)  Jedną płytkę inkubować w warunkach beztlenowych (anaerostat), drugą płytkę 

inkubować w warunkach tlenowych. 

3)  Inkubować podłoża w 37°C przez 24-48 godzin 

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH! 

4)  Odczytać wynik po inkubacji i zapisać w tabeli 1B. 

 

 

Wyniki: 

Tabela 1B 

Bakterie 

Wzrost 

(- , +) 

Określić grupę 

drobnoustrojów* 

warunki 

tlenowe 

warunki 

beztlenowe 

Pseudomonas sp. 

 

 

 

Escherichia sp. 

 

 

 

Micrococcus sp. 

 

 

 

Serratia sp. 

 

 

 

Klebsiella sp. 

 

 

 

Enterococcus sp. 

 

 

 

 

* 

bezwzględne tlenowce, bezwzględne beztlenowce, względne beztlenowce 

 

4 

 

1C. Cel: Różnicowanie i wstępna identyfikacja bakterii za pomocą podłoży wybiórczo-

różnicujących  

 

Wykonanie: w grupach 6-osobowych (grupa wykonuje posiew 1 mieszaniny na 3 podłożach) 

Materiał:  

  Mieszanina 2 rodzajów bakterii w fizjologicznym roztworze soli  

 

Płytki z podłożem wzbogaconym (agar krwawy)  

 

Płytki z podłożem wybiórczo-różnicującym (Mac Conkey’a) 

 

Płytki z podłożem wybiórczo-różnicującym (Chapmana) 

  cieplarka na temp. 37°C 

 

Różnicowanie i wstępna identyfikacja bakterii za pomocą podłoży  

wybiórczo-różnicujących 

 

1)  Wykonać posiew izolacyjny mieszaniny bakteryjnej na podłoże wzbogacone  

i 2 podłoża wybiórczo-różnicujące  

2)  Inkubować podłoża w 37°C przez 24-48 godzin 

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH! 

3)  Po inkubacji odczytać wynik i zapisać w tabeli 1C: 

 

ocenić intensywność wzrostu każdego rodzaju bakterii na podłożu wzbogaconym  

 

wykonać preparaty barwione metodą Grama: z obydwu rodzajów kolonii wyrosłych 

na podłożu krwawym i z kolonii wyrosłych na podłożach wybiórczo-różnicujących  

Wyniki: 

Tabela 1C 

Mieszanina 

Podłoża / (wzrost: -, +, ++, +++) 

Preparat Grama 

Bakteria 

Agar 

krwawy 

Mac  

Conke’y* 

Chapman’a** 

 

Barwa 

 

Kształt 

A 

1 

 

 

 

 

 

2 

 

 

 

 

 

B 

1 

 

 

 

 

 

2 

 

 

 

 

 

 

* 

barwa kolonii różowa lub barwa kolonii bez zmian  

** barwa kolonii i podłoża żółta, podłoże bez zmian,  z koloniami barwy białej  

 

5 

 

Zadanie 2

. Wykonanie posiewu bakterii na podłoże płynne 

Cel: Zapoznanie się z technikami hodowli drobnoustrojów w laboratoriach mikrobiologicznych 

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa posiewa 1 drobnoustrój na  podłoże 

płynne) 

Materiał:  

  24-48 godz. hodowle drobnoustrojów (z zadania 1B) 

 

podłoże płynne (bulion z glukozą) 

  cieplarka na temp. 37°C 

 

Wykonanie posiewu bakterii na podłoże płynne 

 

1)  Pobrać jałową ezą bakterie (1oczko ezy) 

2)  Trzymając ezę w jednej ręce, drugą pobrać ze statywu probówkę z podłożem płynnym 

3)  Piątym palcem ręki w której trzymamy ezę, wyjąć korek z probówki  

4)  Delikatnie opalić wlot probówki nad płomieniem palnika 

5)  Wprowadzić bakterie do probówki z podłożem, delikatnie rozcierając zawartość ezy na  

ściankach wnętrza probówki, tuż nad powierzchnią podłoża 

6)  Wymieszać podłoże, delikatnie opalić wlot probówki i po jej zamknięciu odstawić do 

statywu 

7)  Ezę wyżarzyć nad płomieniem palnika i włożyć do statywu 

8)  Inkubować podłoże w 37°C przez 24-48 godzin 

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH! 

9)  Odczytać wynik i zapisać w tabeli 2. 

 

Wyniki: 

Tabela 2 

Hodowla 

Wzrost (+, -) 

A 

 

B 

 

C 

 

D 

 

E 

 

F 

 

 

 

 

 

6 

 

Zadanie 3.

 Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama z hodowli na  

                   podłożu stałym i obserwacja morfologii komórek  

 

Cel: wstępna identyfikacja drobnoustroju 

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa wykonuje 1 preparat) 

Materiał:  

  24-48 godz. hodowle drobnoustrojów na podłożu krwawym (a-f): ziarniaki Gram (+); ziarniaki 

Gram (-); pałeczki; maczugowce; laseczki; drożdżaki 

 

odtłuszczone szkiełka podstawowe 

 

jałowy roztwór fizjologiczny soli (0, 85% NaCl) 

  dermatograf (ołówek świecowy lub pisak wodoodporny) 

 

zestaw barwników do barwienia metodą Grama 

  olejek immersyjny 

  mikroskop optyczny  

 

Drobnoustroje, z których wykonujemy preparat mikroskopowy, pobieramy jałową ezą (drucik 

z oczkiem wykonanym z platyny lub ze stopu platyno podobnego).  

Jałowienie  ezy  przez  wyżarzanie  (opalenie)  odbywa  się  przez  włożenie  drucika  ezy  do 

wnętrza  płomienia  palnika  na  kilka  sekund  w  celu  doprowadzenia  go  do  czerwoności,  a 

następnie  chłodzenie  (15-20  sekund).  Czynności  te  wykonuje  się  przed  i  po  każdym  użyciu 

ezy. 

Przeniesienie  hodowli  z  podłoża  płynnego  na  szkiełko  podstawowe  obejmuje  następujące 

czynności:  

 

włączyć palnik  

 

wyjałowić ezę przez wyżarzenie, a następnie schłodzić  

 

w drugiej ręce trzymać probówkę z hodowlą (wcześniej należy ją wymieszać) 

 

piątym palcem ręki,w której trzymamy ezę, odciągnąć korek probówki  

Nie należy kłaść korka na stole, ze względu na możliwość rozjałowienia!

 

 

opalić wylot probówki nad płomieniem palnika przez kilka sekund 

 

ostrożnie pobrać hodowlę bakteryjną (oczko ezy) 

 

opalić wylot probówki nad płomieniem przez kilka sekund 

 

włożyć korek do probówki z hodowlą 

 

odstawić probówkę z hodowlą do statywu 

 

nanieść ezą pobraną hodowlę na szkiełko podstawowe 

 

 

 

7 

 

Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama 

z hodowli polega na: - przygotowaniu rozmazu;  - zabarwieniu rozmazu 

 

Przygotowanie rozmazu z hodowli stałej 

 

1)  Umieścić na szkiełku podstawowym małą kroplę fizjologicznego roztworu soli (szkiełko 

powinno być odtłuszczone) 

2)  Pobrać kolonie bakterii z podłoża za pomocą jałowej ezy i wykonać kolistymi ruchami rozmaz o 

ø 10-20 mm (przy zbyt dużej ilości pobranych drobnoustrojów rozmaz jest za gruby; przy ich 

zbyt małej liczbie - rozmaz jest za cienki) 

3)  Wysuszyć rozmaz w temperaturze pokojowej  

4)  Utrwalić rozmaz przez 3-krotne, wolne, przeprowadzenie szkiełka nad płomieniem palnika 

Bezwzględnie unikać nadmiernego ogrzewania szkiełka! 

5)  Na odwrotnej stronie szkiełka, za pomocą dermatografu, oznaczyć miejsce naniesienia 

drobnoustrojów (umożliwia wygodne określenie miejsca rozmazu) i zabarwić rozmaz. 

 

Barwienie rozmazu  metodą Grama 

 

1)  Położyć szkiełko z rozmazem na statywie nad zlewem 

2)  Nanieść na rozmaz kilka kropli barwnika -  roztwór fioletu krystalicznego – tak, aby 

oznaczony markerem obszar został w całości pokryty  

Nie zalewać barwnikiem całego szkiełka – zbędne zużycie roztworu barwiącego! 

3)  Pozostawić barwnik na rozmazie przez 3 minuty 

4)  Usunąć barwnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową 

5)  Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody (z pojemnika oznaczonego H

2

O), 

przechylając szkiełko w pozycję pionową i kierując strumień wody tuż nad  rozmazem 

Unikać spłukiwania wodą bezpośrednio miejsca naniesienia rozmazu, gdyż grozi to 

wypłukaniem naniesionych drobnoustrojów! 

6)  Nanieść na rozmaz kilka kropli odczynnika - płyn Lugola – tak, aby oznaczony markerem 

obszar został w całości pokryty 

7)  Pozostawić odczynnik na rozmazie przez 1 minutę 

8)  Usunąć odczynnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową 

9)  Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody (pojemnik oznaczony H

2

O), 

przechylając szkiełko w pozycję pionową i kierując strumień wody tuż nad  rozmazem  

Unikać spłukiwania wodą bezpośrednio miejsca naniesienia rozmazu, gdyż grozi to 

wypłukaniem naniesionych drobnoustrojów! 

 

8 

 

10) Nanieść na rozmaz kilka kropli odczynnika – alkohol - tak, aby oznaczony markerem 

obszar został w całości pokryty 

11) Pozostawić odczynnik na 30 sekund 

12) Usunąć odczynnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową 

13) Spłukać delikatnie  rozmaz cienkim strumieniem wody, przechylając szkiełko w pozycję 

pionową i kierując strumień wody tuż nad  rozmazem 

Unikać spłukiwania wodą bezpośrednio miejsca naniesienia rozmazu, gdyż grozi to 

wypłukaniem naniesionych drobnoustrojów! 

14) Nanieść na rozmaz kilka kropli barwnika - fuksyna – tak, aby oznaczony markerem 

obszar został w całości pokryty 

15) Pozostawić barwnik na rozmazie przez 30 sekund 

16) Usunąć barwnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową 

17) Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody, przechylając szkiełko w pozycję 

pionową i kierując strumień wody tuż nad  rozmazem  

18) Suszyć preparat w temperaturze pokojowej umieszczając szkiełko na bibule i opierając o 

statyw w pozycji pionowej 

19) Oglądać preparat w mikroskopie optycznym (obiektyw 100x), z użyciem olejku 

immersyjnego. 

 

Wyniki: zapisać w tabeli 3. 

Tabela 3 

Hodowla 

Kształt 

komórki 

Barwliwość 

Układ 

Drobnoustrój 

(wstępna identyfikacja) 

A 

 

 

 

 

B 

 

 

 

 

C 

 

 

 

 

D 

 

 

 

 

E 

 

 

 

 

F 

 

 

 

 

 

Kształt: kulisty, cylindryczny, spiralny 

Barwliwość w metodzie Grama: fioletowe komórki – Gram (+); różowe komórki – Gram (-) 

Układ: dwoinki, pakiety, paciorki, grona, układ pisma klinowego  

Drobnoustrój: ziarniaki Gram (+); ziarniaki Gram (-); pałeczki, maczugowce, laseczki; drożdżaki 

 

Opis preparatu  

W preparacie z hodowli …………. wykryto ……………………………………………………………. 

 

9 

 

 

Zadanie 4.

 Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama z hodowli na podłożu  

                        płynnym i obserwacja morfologii komórek  

 

Cel: wstępna identyfikacja drobnoustroju 

 

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa wykonuje 1 preparat) 

Materiał:  

 

24 godz. hodowle drobnoustrojów na podłożu płynnym:  ziarniaki Gram (+); 

ziarniaki Gram (-); pałeczki;  maczugowce; laseczki; drożdżaki 

 

odtłuszczone szkiełka podstawowe 

  dermatograf (ołówek świecowy lub pisak wodoodporny) 

 

zestaw barwników do barwienia metodą Grama 

  olejek immersyjny 

  mikroskop optyczny  

 

Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą  Grama polega na  

przygotowaniu rozmazu oraz jego zabarwieniu 

 

Przygotowanie rozmazu z hodowli płynnej 

 

1)  Wymieszać hodowlę płynną przez kilka sekund 

2)  Pobrać 1-2 oczka płynnej hodowli drobnoustroju za pomocą jałowej ezy i umieścić na 

szkiełku podstawowym wykonując kolistymi ruchami rozmaz o ø 10-20 mm 

3)  Rozmaz wysuszyć w temperaturze pokojowej  

4)  Utrwalić rozmaz przez 3-krotne, wolne przeprowadzenie szkiełka nad płomieniem palnika 

Bezwzględnie unikać nadmiernego ogrzewania szkiełka! 

5)  Na odwrotnej stronie szkiełka oznaczyć miejsce naniesienia drobnoustrojów za pomocą 

dermatografu (umożliwia wygodne określenie miejsca rozmazu) i zabarwić rozmaz. 

 

Barwienie rozmazu  metodą Grama – patrz: Zadanie 3 

 

 

 

 

 

 

10 

 

 

Wyniki: zapisać w tabeli 3. 

 

Tabela 4 

Hodowla 

Kształt 

komórki 

Barwliwość 

Układ 

Drobnoustrój 

(wstępna identyfikacja) 

a 

 

 

 

 

b 

 

 

 

 

c 

 

 

 

 

d 

 

 

 

 

e 

 

 

 

 

f 

 

 

 

 

 

Kształt - kulisty, cylindryczny, spiralny 

Barwliwość w metodzie Grama - fioletowe komórki – Gram (+); różowe komórki – Gram (-) 

Układ - dwoinki, pakiety, paciorki, grona, układ pisma chińskiego  

Drobnoustrój - ziarniaki Gram (+); ziarniaki Gram (-); pałeczki, maczugowce, laseczki; drożdżaki 

 

Opis preparatu 

W preparacie z hodowli  …. …………… wykryto ……………………………………………………..