Ćwiczenie 1
Fizjologia i morfologia komórki bakteryjnej – przypomnienie
materiału.
Znaczenie mikroflory jamy ustnej w stanie zdrowia i choroby
Ćwiczenie 1
Fizjologia i morfologia komórki bakteryjnej – przypomnienie
materiału.
Znaczenie mikroflory jamy ustnej w stanie zdrowia i choroby
Kształty bakterii
I.
Formy kuliste i owalne
ziarniaki - cocci
1.
gronkowce - Staphylococcus
2.
paciorkowce - Streptococcus
3.
dwoinki - Diplococcus
4.
czworaczki – Micrococcus tetragenes
5.
sześcianki – Sarcina
II.
Formy cylindryczne
:
1.
pałki – Bacterium
2.
laseczki – Bacillus, Clostridium
3.
maczugowce – Corynebacterium
4.
prątki – Mycobacterium
5.
wrzecionowce – Fusobacterium
6.
formy nitkowate – Actinomyces, Nocardia
III.
Formy spiralne
:
1.
przecinkowce – Vibrio
2.
śrubowce – Spirillum
3.
krętki – Treponema, Borrelia, Cristispira,
Leptospira
Pleomorfizm = różnokształtność:
populacja bakterii składająca się z komórek o
różnych kształtach w skutek działania
(najczęściej) czynników fizycznych i
chemicznych
Atypia
odchylenia w kształtach bakterii leżące jeszcze
w granicach normy
Inwolucja lub degeneracja
odchylenia w kształtach bakterii odbiegającą
znacznie od norm fizjologicznych
Budowa bakterii
1.
cytoplazma
2.
nukleoid
3.
rybosomy
4.
mezosomy
5.
błona komórkowa składajaca się ze:
ściany komórkowej
błony komórkowej (błona wewnętrzna)
6.
elementy dodatkowe
otoczka, rzęski, fimbrie, przetrwalniki, wtręty
cytoplazmatyczne (ziarnistości), specjalne struktury
(plazmidy, transpozomy)
Ściana komórkowa
Peptydoglikan = mureina
1.
główny składnik ściany komórkowej
2.
występuje zarówno u bakterii Gram(+), jak i Gram(-)
3.
cząsteczka duża, zbudowana z długich łańcuchów
polisacharydowych, które połączone są w sieci za pomocą
mostków peptydowych. Każdy łańcuch polisacharydowy
składa się z dwucukrów zbudowanych z
N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego
Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej bakterie
można podzielić na 2 grupy
bakterie Gram(+) - barwią się na kolor granatowy
bakterie Gram(-) – barwią się na kolor czerwony
Ściana komórkowa
Bakterie Gram(+):
•
gruba
•
60-100% peptydoglikanu
•
u większości występują
kwasy tejchojowe :
rybitolowy i glecerolowy
•
u niektórych mogą
występować specjalne
kategorie kwasów
tłuszczowych, tzw. kwasy
mykolowe
•
polisacharydy
•
biłka np. białko M mogą być
antygenami i warunkować
właściwości chorobotwórcze
bakterii
Bakterie Gram(-):
•
ok. 5-10% peptydoglikanu
(nie zawiera kwasów
tejchojowych)
•
posiada charakterystyczną,
dodatkową strukturę zwaną
błoną zewnętrzną
(fosfolipidów, białek,
lipopolisacharydu)
Metody barwienia bakterii
Barwienie
•
jest to
: proces fizyko-chemiczny polegający na wniknięciu barwnika do
wnętrza komórki mikroorganizmu i utworzeniu barwnego kompleksu z
cytoplazmą lub wewnątrz-komórkowymi strukturami komórki
•
cel
: ułatwienie obserwacji cech morfologicznych, anatomicznych i
diagnostycznych komórek mikroorganizmów np.
kształtu
wielkości
ułożenia komórek
zdolności ruchu
występowania i rozmieszczenia wici i rzęsek
obecności otoczek
sposobu rozmnażania przez podział
pączkowanie (wytwarzanie i ułożenie pączków)
zarodnikowanie (ułożenie zarodników)
tworzenia i rozmieszczenia form przetrwanych w komórce
również zastosowane do liczenia komórek żywych i martwych, czyli do
badania przeżywalności mikroorganizmów.
Podział metod barwienia
I. Ze względu na sposób
wstępnego przygotowania
preparatu
:
1.
barwienie przyżyciowe
2.
barwienie preparatów utrwalonych
II. Ze względu na złożoność
technik barwienia preparatów
:
3.
proste
4.
złożone
III. Ze względu
co podlega barwieniu
:
5.
pozytywne
6.
negatywne
7.
pozytywno-negatywne
Barwienie przyżyciowe
•
gdy na żywe komórki mikroorganizmów naniesione na szkiełko
podstawowe działamy barwnikiem np. oznaczanie
przeżywalności drożdży
•
zabarwieniu ulegają jedynie komórki martwe - barwnik łatwiej
przenika przez ścianę
•
żywe komórki - pozostają bezbarwne
Barwienie preparatów utrwalonych
•
gdy barwieniu poddaje się utrwalone (martwe) komórki
drobnoustrojów
•
utrwalanie polega na termicznym lub chemicznym zabiciu
mikroorganizmów i przytwierdzeniu ich do powierzchni
szkiełka podstawowego
•
celem utrwalania jest ułatwienie barwnikom penetracji przez
ścianę komórkową i ich wniknięcie do wnętrza komórki oraz
odsłonięcie w ścianach komórkowych mikroorganizmów
związków, z którymi wiążą się barwniki
Barwienie proste = monochromatyczne = jednobarwne
•
polega na zastosowaniu jednego barwnika
•
do wizualizacji komórek mikroorganizmów -
barwienie
pozytywne
(zasadowe barwniki anilinowe: błękit metylenowy, zieleń
malachitowa, zieleń brylantowa, fuksyna zasadowa, czerwień
obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy)
•
do zabarwienia tła preparatu -
barwienie negatywne
(kwaśne lub gruboziarniste barwniki: fuksyna kwaśna,
eozyna, erytrozyna, czerwień Kongo, nigrozyna, Kolargol, tusz
chiński)
Barwienie złożone = polichromatyczne = wielobarwne
polega na zastosowaniu dwóch lub więcej barwników w ściśle
określonej kolejności
Mechanizm barwienia:
1. Komórki bakteryjne, zarówno Gram(+) jak i Gram(-), zabarwiają się fioletem krystalicznym
2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem - tworzą się stosunkowo duże
kompleksy złożone z barwnika i jodu. Obydwa typy komórek mają zabarwienie
fioletowe/granatowe
3. Naniesienie odbarwiacza (alkohol). W wyniku jego działania u bakterii Gram(-) zniszczeniu
ulega zewnętrzna błona lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny. Kompleks
barwnika z jodem zostaje uwięziony pod zwartą i grubą warstwą mureiny w komórkach
bakterii Gram(+), natomiast z komórek bakterii Gram(-) jest on łatwo wymywany
odbarwiaczem. Na tym etapie następuje zróżnicowanie komórek - komórki Gram(+) są
granatowe, zaś Gram(-) – bezbarwne
4. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram(-),
nie zmieniając barwy komórek Gram(+)
Metoda Grama
barwienie złożone pozytywne
Gram-zmienność
•
komórki Gram(+) barwią się metodą Grama jak komórki
Gram(-)
•
głównie bakterie z rodzajów Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium i Propionibacterium
•
spowodowana
wiekiem hodowli (późne fazy wzrostu)
brakiem w podłożu składników odżywczych niezbędnych
do syntezy ściany komórkowej (są to dla bakterii
warunki stresowe)
zbyt długie utrwalanie preparatu w płomieniu palnika
za długi etap odbarwiania
Efekt barwienia Grama
1.
bakterie barwią się na kolor fioletowy
(granatowy)
Gram (+)
2.
bakterie barwią się na kolor czerwony
(różowy)
Gram (-)
3.
bakterie nie barwią się w ogóle metodą
Grama (prątki)
Barwienie
Ziehla-Neelsena
•
do odróżniania bakterii kwasoopornych i niekwasoopornych
(diagnostyka gruźlicy - prątki są oporne na barwienie Grama)
•
mechanizm barwienia:
1. na utrwalony rozmaz bakterii nanosimy barwnik podstawowy - fuksynę
2. odbarwiamy preparat w 3% roztworze HCl w etanolu (kwaśny alkohol)
3. nanosimy barwnik kontrastowy, np. błękit metylenowy
4. suszymy preparat na pasku bibuły i przeprowadzamy obserwacje w
mikroskopie świetlnym z zastosowaniem imersji
•
wyniki:
bakterie kwasooporne przybierają kolor czerwony pochodzący od
fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym alkoholu)
bakterie niekwasooporne są wrażliwe na działanie kwaśnego alkoholu,
odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski od błękitu
metylenowego
Barwienie metoda
pozytywno-negatywną
1. Kroplę zawiesiny z hodowli bakterii mieszamy na
szkiełku podstawowym z kroplą czarnego tuszu.
2. Preparat pokrywamy roztworem fuksyny
fenolowej.
3. Po 1-2 minutach spłukujemy barwnik wodą.
Preparat po wysuszeniu oglądamy pod imersją.
4. Widzimy ciemne tło (tusz), a bakterie są
zabarwione na czerwono (fuksyna). Otoczki - nie
wchłonęły żadnego barwnika i są widoczne jako
przeźroczysta warstwa pomiędzy bakterią a tłem
Inne metody barwienia
Barwienie metodą Giemsy
Barwienie metodą Burri-Ginsa
Barwienie metodą Dornera
Metoda barwienia Schaeffera-Fultona
Barwienie hematoksyliną i eozyną H+
Metoda Bielschowsky'ego
Barwienie proste negatywne z
zastosowaniem nigrozyny
Podłoża
Podłożami bakteriologicznymi = pożywkami
mieszaniny różnych związków chemicznych,
których skład zapewnia rozwój i rozmnażanie
się określonych gatunków bakterii i ich
identyfikację w oparciu o obserwację cech
morfologicznych, biochemicznych i
serologicznych poszczególnych drobnoustrojów
I. Ze względu na
skład
podłoża dzielimy na:
1.
naturalne – skład jest nam znany tylko w
przybliżeniu
2.
syntetyczne – skład jakościowy i ilościowy
jest ściśle określony
3.
półsyntetyczne – zawierają związki
nieorganiczne w określonej ilości i składniki
naturalne
II. Ze względu na
konsystencję
:
1.
płynne – umożliwiają szybkie namnażanie flory
bakteryjnej
2.
stałe – zastosowanie przy izolacji
poszczególnych kolonii bakteryjnych oraz
dostarczają informacji dotyczących
morfologicznych i biochemicznych cech
drobnoustrojów
3.
półpłynne – zastosowanie np. przy obserwacji
ruchu niektórych gatunków bakterii
III. Ze względu na
ilość i jakość
składników:
1.
proste
- agar zwykły, żelatyna, bulion zwykły, woda peptonowa
2.
wzbogacone
– dodatkowo zawierają składniki niezbędne do wzrostu
niektórych bakterii
- bulion cukrowy, agar z krwią
3.
wybiórczo-namnażające
– przyspieszają wzrost jednych bakterii,
równocześnie hamując rozwój innych bakterii
- bulion z żółcią, podłoże SF, podłoże Loewensteina-Jensena (L-J)
4.
wybiórczo-różnicujące
– służą do badania cech metabolizmu danego
gatunku bakterii
- podłoże Levine'a, agar SS, podłoże Chapmana, podłoże
MacConkeya, podłoże Wilsona-Blaira, pożywka Endo, podłoże
Kliglera
5.
podłoża specjalne
– do hodowli bakterii o specjalnie wysokich
wymaganiach odżywczych, wysokowartościowe substancje
odżywcze
- podłoże Löfflera, podłoże Tarroziego-Wrzoska, agar czekoladowy,
pożywka Clauberga, podłoże Löwensteina-Jensena.
Podłoże Chapmana
•
dla gronkowców, stałe, kolor-
amarantowego
•
zawartość:
czynnik wybiórczy- 7,5% NaCl
czynnik różnicujący – mannitol
wskaźnik - czerwień fenolowa
•
fermentacja mannitolu – zakwaszenie
środowiska, zmiana barwy na żłótą
•
brak fermentacji mannitolu – brak zmiany
podłoża
Podłoże McConkeya
•
dla pałeczek Gram (-) z rodziny
Enterobacteriaceae, stałe, koloru
cielistego/beżowego
•
zawartość:
czynnik wybiórczy – fiolet krystaliczny,
dezoksycholan sodu
czynnik różnicujący – laktoza
wskaźnik – czerwień obojętna
•
fermentacja laktozy – kolonie różowe
•
brak fermentacji – kolonie szare/beżowe
Podłoże SS
•
podłoże do izolacji pałeczek Salmonella i
Shigella
•
zawartość: sole kwasów żółciowych, sole
cytrynianu – hamują wzrost bakterii
Gram(+) i Gram(-); laktoza- odróżnienie
pałeczek laktozo(+), tiosiarczan sodowy-
wykrywanie szczepów wytwarzających H
2
S
•
wytwarzanie H
2
S – bezbarwne kolonie
z zaczernieniem środka
Inne podłoża
•
Podłoże Loewensteina-Jensena (L-J)
– podłoże
n-w dla prątków, modyfikacje: podłoże Ogawy
lub pożywka Stonebrinka
•
Podłoże Löfflera
– podłoże do hodowli
maczugowców błonnicy
•
Podłoże Clauberga
- wybiórcza pożywka do
hodowli maczugowca błonicy
•
Podłoże Tinsdale’a
– podłoże do izolacji i
różnicowania maczugowców
•
Podłoże z mannitolem i NaCl
– podłoże do
izolacji gronkowców
•
Podłoże z żółcią i eskuliną
– podłoże do izolacji
i identyfikacji paciorkowców
•
Podłoże agar czekoladowy
– podłoże wzrostowe
dla Heamophilus czy Neisseria gonorrhoeae, z
batytracyną – podłoże wybiórcze dla pałeczek
Haemophilus
•
Podłoże Wrzoska
– podłoże do hodowli i
wykrywania bakterii beztlenowych, szczególnie z
rodzaju Clostridium
•
Podłoże tioglikolanowe
- podłoże służy do kontroli
jałowości i hodowli bakterii beztlenowych
•
Podłoże z cetrimidem
– podłoże do izolacji
pałeczek z rodzaju Pseudomonas
•
Bulion cukrowy
– płynne podłoże namnażające
Agar krwawy
•
stałe, koloru czerwonego
•
podłoże zawiera 5% jałowej, odwłóknionej
krwi baraniej
•
podłoże bogate przeznaczone dla
drobnoustrojów o wysokich wymaganiach
wzrostowych i odżywczych
•
umożliwia wykrywanie
drobnoustrojów
hemolizujących i rozróżnienie rodzaju
hemolizy
Typy hemolizy
•
liza erytrocytów może być wywołana przez wiele czynników, w tym
także przez działanie enzymów bakteryjnych – hemolizyn
•
typy hemolizy wywoływanej przez bakterie z rodzaju Streptococcus
na podłożu z krwią
hemoliza
alfa(α)
beta (β)
gamma (γ)
charakterysty
ka
niecałkowity rozkład
erytrocytów
całkowity rozkład
erytrocytów
brak hemolizy
bakterie
wywołujące
paciorkowce
α- hemolizujące np.
Streptococcus pneumoniae
paciorkowce
β-hemolizujące np.
Streptococcus
pyogenes
Streptolizyna
paciorkowce
γ-hemolizujące
(właściwie
niehemolizujące)
np. Streptococcus
mutans
wzrost na
podłożu
agarowym
uzupełnionym
krwią
strefa hemolizy mało
przejrzysta i słabo
ograniczona, w obrębie strefy
hemolizy pod mikroskopem
widoczne są erytrocyty,
charakterystyczne
zazielenienie podłoża –
przekształcenie hemoglobiny
w methemoglobinę
strefa wyraźnego
przejaśnienia wokół
kolonii, brak
erytrocytów w
obrębie strefy
hemolizy – całkowite
rozpuszczenie
krwinek
brak zmian
Podłoże Muellera-Hinton
•
podłoże rutynowo stosowane do oznaczania
lekowrażliwości i identyfikacji bakterii
metodą krążkowo-dyfuzyjną
Szereg biochemiczny do
identyfikacji pałeczek Gram(-)z
rodziny Enterobacteriaceae
1.
podłoże Kliglera
2.
woda peptonowa z 10% laktozą pod
parafiną
3.
woda peptonowa z mannitolem i rurką
Durhama
4.
woda peptonowa z tryptofanem
5.
podłoże Christensena z mocznikiem
Podłoże Kliglera
•
do określania rozkładu glukozy, laktozy,
wytwarzania gazu i H
2
S
•
Interpretacja wyników:
1.
Skos i słupek bez zmian – brak
fermentacji glukozy i laktozy
2.
Żółty skos i słupek – fermentacja
glukozy i laktozy
3.
Rozerwanie lub bańki powietrza w
podłożu – wytwarzanie gazu
(H
2
/CO
2
)w trakcie fermentacji glukozy
i/lub laktozy
4.
Czerwony skos i żółty słupek –
fermentacja glukozy, brak fermentacji
laktozy
5.
Zaczernienie podłoża – wytwarzanie
H
2
S
Woda peptonowa z
laktozą pod parafiną
•
do określania zdolności fermentacji laktozy w
warunkach beztlenowych
•
interpretacja:
reakcja ujemna (-) – brak zmian w
zabarwieniu
reakcja dodatnia (+) - zmiana zabarwienia
podłoża z fioletowego na żółte
Woda peptonowa z tryptofanem
•
do określania zdolności bakterii do
wytwarzania indolu z tryptofanu
•
interpretacja:
reakcja ujemna (-) – brak czerwonego
pierścienia po dodaniu odczynnika Ehrlicha
reakcja dodatnia (+) – po dodaniu odczynniki
Ehrlicha pojawia się na powierzchni podłoża
czerwony pierścień
Woda peptonowa z mannitolem i
rurka Durhama
•
do określania zdolności fermentacji przez
bakterie mannitolu z wytworzeniem gazu
•
interpretacja:
reakcja ujemna (-) – brak gazu w rurce i brak
zmian w zabarwieniu podłoża (zielone)
reakcja dodatnia (+) – pojawienie się
banieczki gazu w rurce i zmiana zabarwienia
podłoża z zielonego na żółte
Podłoże Christensena
•
=woda peptonowa z mocznikiem
•
do wykrywania enzymu ureazy, mającego
zdolność hydrolizy mocznika do amoniaku
(NH
3
) i CO
2
•
interpretacja:
reakcja ujemna (-) – brak zman w
zabarwieniu podłoża (żółte)
reakcja dodatnia (+) – alkalizacja podłoża,
zmiana zabarwienia z żółtego na czerwone
Podłoże Sabouraud
•
służy do namnażania i
oznaczania ilościowego
chorobotwórczych grzybów
•
podłoże zawiera pepton sojowy,
ekstrakt drożdżowy i słodowy,
które dostarczają składników
odżywczych ułatwiających
rozwój drożdży
Mikroflora jamy ustnej
•
ma charakterystyczny skład
•
zasiedlana przez ok. 700 różnorodnych gatunków
mikroorganizmów
•
do organizmów zasiedlających j.ustną zaliczamy :
bakterie, grzyby, mykoplazmy, pierwotniaki, od czasu
do czasu występują również wirusy
•
naturalna flora jamy ustnej stabilizuje się w
dzieciństwie i stopniowo zmienia się wraz z wiekiem
pod wpływem czynników środowiskowych oraz
behawioralnych
•
interakcja pomiędzy drobnoustrojami j.ustnej z innymi
drobnoustrojami oraz z gospodarzem/żywicielem
Flora fizjologiczna=stała= osiadła
•
flora współwystępująca u gospodarza w stanie równowagi
•
nie wywołująca chorób
•
utrzymuje się do końca życia gospodarza
•
ma skład prawie nie zmienny
•
zachwianie równowagi w składzie stałej mikroflory powoduje stany
chorobowe w j.ustnej np.: próchnicę zębów czy choroby przyzębia
Flora przejściowa
•
flora pojawiająca się przez krótki okres
•
ma zmienny stosunek ilościowy
•
w jej skład wchodzą gatunki saprofityczne, jak i potencjalnie
chorobotwórcze
•
nie odgrywa zasadniczego znaczenia tak długo, jak długo skład
flory stałej się nie zmienia
Ekosystem jamy ustnej
Składa się z :
1.
flory jamy ustnej
2.
środowiska różne miejsca w jamie ustnej, w
których się drobnoustroje rozmnażają
3.
związanego z nimi otoczenia
Drobnoustroje autochtoniczne
•
gatunki występujące w określonym środowisku
•
mnożą się one i pozostają na miejscu
•
biorą udział w metabolizmie zbiorowiska
bakteryjnego
•
organizm systematycznie izolowany z siedliska
Drobnoustroje alochtoniczne
•
namnożyły się one w innych środowiskach
•
nie mają zdolności do zasiedlania do czasu, gdy nie
wystąpią zaburzenia w ekosystemie
Amfibiont
zakres miejsc pomiędzy symbiozą, a patogennością
Patogeny oportunistyczne
•
drobnoustroje mające możliwość wywołania choroby w
wyjątkowych okolicznościach np.:
zaburzenia w środowisku:
egzogennego (po zastosowaniu antybiotyku)
endogennego (zmiany w integracji układów obronnych
żywiciela)
występowanie w miejscach zazwyczaj dla nich nie
dostępnych
•
można je odróżnić od
jawnych patogenów
, które są związane
stale z jedną określoną chorobą