Ćwiczenie 1

Fizjologia i morfologia komórki bakteryjnej – przypomnienie
materiału.
Znaczenie mikroflory jamy ustnej w stanie zdrowia i choroby

Kształty bakterii

I.

Formy kuliste i owalne

ziarniaki - cocci

1.

gronkowce - Staphylococcus

2.

paciorkowce - Streptococcus

3.

dwoinki - Diplococcus

4.

czworaczki – Micrococcus tetragenes

5.

sześcianki – Sarcina

II.

Formy cylindryczne

:

1.

pałki – Bacterium

2.

laseczki – Bacillus, Clostridium

3.

maczugowce – Corynebacterium

4.

prątki – Mycobacterium

5.

wrzecionowce – Fusobacterium

6.

formy nitkowate – Actinomyces, Nocardia

III.

Formy spiralne

:

1.

przecinkowce – Vibrio

2.

śrubowce – Spirillum

3.

krętki – Treponema, Borrelia, Cristispira,
Leptospira

Pleomorfizm = różnokształtność:

populacja bakterii składająca się z komórek o
różnych kształtach w skutek działania
(najczęściej) czynników fizycznych i
chemicznych

Atypia

odchylenia w kształtach bakterii leżące jeszcze
w granicach normy

Inwolucja lub degeneracja

odchylenia w kształtach bakterii odbiegającą
znacznie od norm fizjologicznych

Budowa bakterii

1.

cytoplazma

2.

nukleoid

3.

rybosomy

4.

mezosomy

5.

błona komórkowa składajaca się ze:
ściany komórkowej
błony komórkowej (błona wewnętrzna)

6.

elementy dodatkowe
otoczka, rzęski, fimbrie, przetrwalniki, wtręty
cytoplazmatyczne (ziarnistości), specjalne struktury
(plazmidy, transpozomy)

Ściana komórkowa

Peptydoglikan = mureina

1.

główny składnik ściany komórkowej

2.

występuje zarówno u bakterii Gram(+), jak i Gram(-)

3.

cząsteczka duża, zbudowana z długich łańcuchów
polisacharydowych, które połączone są w sieci za pomocą
mostków peptydowych. Każdy łańcuch polisacharydowy
składa się z dwucukrów zbudowanych z
N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego

Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej bakterie
można podzielić na 2 grupy



bakterie Gram(+) - barwią się na kolor granatowy



bakterie Gram(-) – barwią się na kolor czerwony

Ściana komórkowa

Bakterie Gram(+):

•

gruba

•

60-100% peptydoglikanu

•

u większości występują
kwasy tejchojowe :
rybitolowy i glecerolowy

•

u niektórych mogą
występować specjalne
kategorie kwasów
tłuszczowych, tzw. kwasy
mykolowe

•

polisacharydy

•

biłka np. białko M mogą być
antygenami i warunkować
właściwości chorobotwórcze
bakterii

Bakterie Gram(-):

•

ok. 5-10% peptydoglikanu
(nie zawiera kwasów
tejchojowych)

•

posiada charakterystyczną,
dodatkową strukturę zwaną
błoną zewnętrzną
(fosfolipidów, białek,
lipopolisacharydu)

Metody barwienia bakterii

Barwienie

•

jest to

: proces fizyko-chemiczny polegający na wniknięciu barwnika do

wnętrza komórki mikroorganizmu i utworzeniu barwnego kompleksu z
cytoplazmą lub wewnątrz-komórkowymi strukturami komórki

•

cel

: ułatwienie obserwacji cech morfologicznych, anatomicznych i

diagnostycznych komórek mikroorganizmów np.



kształtu



wielkości



ułożenia komórek



zdolności ruchu



występowania i rozmieszczenia wici i rzęsek



obecności otoczek



sposobu rozmnażania przez podział



pączkowanie (wytwarzanie i ułożenie pączków)



zarodnikowanie (ułożenie zarodników)



tworzenia i rozmieszczenia form przetrwanych w komórce



również zastosowane do liczenia komórek żywych i martwych, czyli do
badania przeżywalności mikroorganizmów.

Podział metod barwienia

I. Ze względu na sposób

wstępnego przygotowania

preparatu

:

1.

barwienie przyżyciowe

2.

barwienie preparatów utrwalonych

II. Ze względu na złożoność

technik barwienia preparatów

:

3.

proste

4.

złożone

III. Ze względu

co podlega barwieniu

:

5.

pozytywne

6.

negatywne

7.

pozytywno-negatywne

Barwienie przyżyciowe

•

gdy na żywe komórki mikroorganizmów naniesione na szkiełko

podstawowe działamy barwnikiem np. oznaczanie

przeżywalności drożdży

•

zabarwieniu ulegają jedynie komórki martwe - barwnik łatwiej

przenika przez ścianę

•

żywe komórki - pozostają bezbarwne

Barwienie preparatów utrwalonych

•

gdy barwieniu poddaje się utrwalone (martwe) komórki
drobnoustrojów

•

utrwalanie polega na termicznym lub chemicznym zabiciu
mikroorganizmów i przytwierdzeniu ich do powierzchni
szkiełka podstawowego

•

celem utrwalania jest ułatwienie barwnikom penetracji przez
ścianę komórkową i ich wniknięcie do wnętrza komórki oraz
odsłonięcie w ścianach komórkowych mikroorganizmów
związków, z którymi wiążą się barwniki

Barwienie proste = monochromatyczne = jednobarwne

•

polega na zastosowaniu jednego barwnika

•

do wizualizacji komórek mikroorganizmów -

barwienie

pozytywne

(zasadowe barwniki anilinowe: błękit metylenowy, zieleń
malachitowa, zieleń brylantowa, fuksyna zasadowa, czerwień
obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy)

•

do zabarwienia tła preparatu -

barwienie negatywne

(kwaśne lub gruboziarniste barwniki: fuksyna kwaśna,
eozyna, erytrozyna, czerwień Kongo, nigrozyna, Kolargol, tusz
chiński)

Barwienie złożone = polichromatyczne = wielobarwne

polega na zastosowaniu dwóch lub więcej barwników w ściśle
określonej kolejności

Mechanizm barwienia:
1. Komórki bakteryjne, zarówno Gram(+) jak i Gram(-), zabarwiają się fioletem krystalicznym
2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem - tworzą się stosunkowo duże
kompleksy złożone z barwnika i jodu. Obydwa typy komórek mają zabarwienie
fioletowe/granatowe
3. Naniesienie odbarwiacza (alkohol). W wyniku jego działania u bakterii Gram(-) zniszczeniu
ulega zewnętrzna błona lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny. Kompleks
barwnika z jodem zostaje uwięziony pod zwartą i grubą warstwą mureiny w komórkach
bakterii Gram(+), natomiast z komórek bakterii Gram(-) jest on łatwo wymywany
odbarwiaczem. Na tym etapie następuje zróżnicowanie komórek - komórki Gram(+) są
granatowe, zaś Gram(-) – bezbarwne
4. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram(-),
nie zmieniając barwy komórek Gram(+)

Metoda Grama

barwienie złożone pozytywne

Gram-zmienność

•

komórki Gram(+) barwią się metodą Grama jak komórki
Gram(-)

•

głównie bakterie z rodzajów Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium i Propionibacterium

•

spowodowana



wiekiem hodowli (późne fazy wzrostu)



brakiem w podłożu składników odżywczych niezbędnych
do syntezy ściany komórkowej (są to dla bakterii
warunki stresowe)



zbyt długie utrwalanie preparatu w płomieniu palnika



za długi etap odbarwiania

Efekt barwienia Grama

1.

bakterie barwią się na kolor fioletowy
(granatowy)
Gram (+)

2.

bakterie barwią się na kolor czerwony
(różowy)
Gram (-)

3.

bakterie nie barwią się w ogóle metodą
Grama (prątki)

Barwienie

Ziehla-Neelsena

•

do odróżniania bakterii kwasoopornych i niekwasoopornych
(diagnostyka gruźlicy - prątki są oporne na barwienie Grama)

•

mechanizm barwienia:

1. na utrwalony rozmaz bakterii nanosimy barwnik podstawowy - fuksynę
2. odbarwiamy preparat w 3% roztworze HCl w etanolu (kwaśny alkohol)
3. nanosimy barwnik kontrastowy, np. błękit metylenowy
4. suszymy preparat na pasku bibuły i przeprowadzamy obserwacje w
mikroskopie świetlnym z zastosowaniem imersji

•

wyniki:



bakterie kwasooporne przybierają kolor czerwony pochodzący od
fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym alkoholu)



bakterie niekwasooporne są wrażliwe na działanie kwaśnego alkoholu,
odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski od błękitu
metylenowego

Barwienie metoda

pozytywno-negatywną

1. Kroplę zawiesiny z hodowli bakterii mieszamy na
szkiełku podstawowym z kroplą czarnego tuszu.
2. Preparat pokrywamy roztworem fuksyny
fenolowej.
3. Po 1-2 minutach spłukujemy barwnik wodą.
Preparat po wysuszeniu oglądamy pod imersją.
4. Widzimy ciemne tło (tusz), a bakterie są
zabarwione na czerwono (fuksyna). Otoczki - nie
wchłonęły żadnego barwnika i są widoczne jako
przeźroczysta warstwa pomiędzy bakterią a tłem

Inne metody barwienia



Barwienie metodą Giemsy



Barwienie metodą Burri-Ginsa



Barwienie metodą Dornera



Metoda barwienia Schaeffera-Fultona



Barwienie hematoksyliną i eozyną H+



Metoda Bielschowsky'ego



Barwienie proste negatywne z
zastosowaniem nigrozyny

Podłoża

Podłożami bakteriologicznymi = pożywkami

mieszaniny różnych związków chemicznych,
których skład zapewnia rozwój i rozmnażanie
się określonych gatunków bakterii i ich
identyfikację w oparciu o obserwację cech
morfologicznych, biochemicznych i
serologicznych poszczególnych drobnoustrojów

I. Ze względu na

skład

podłoża dzielimy na:

1.

naturalne – skład jest nam znany tylko w
przybliżeniu

2.

syntetyczne – skład jakościowy i ilościowy
jest ściśle określony

3.

półsyntetyczne – zawierają związki
nieorganiczne w określonej ilości i składniki
naturalne

II. Ze względu na

konsystencję

:

1.

płynne – umożliwiają szybkie namnażanie flory
bakteryjnej

2.

stałe – zastosowanie przy izolacji
poszczególnych kolonii bakteryjnych oraz
dostarczają informacji dotyczących
morfologicznych i biochemicznych cech
drobnoustrojów

3.

półpłynne – zastosowanie np. przy obserwacji
ruchu niektórych gatunków bakterii

III. Ze względu na

ilość i jakość

składników:

1.

proste

- agar zwykły, żelatyna, bulion zwykły, woda peptonowa

2.

wzbogacone

– dodatkowo zawierają składniki niezbędne do wzrostu

niektórych bakterii
- bulion cukrowy, agar z krwią

3.

wybiórczo-namnażające

– przyspieszają wzrost jednych bakterii,

równocześnie hamując rozwój innych bakterii
- bulion z żółcią, podłoże SF, podłoże Loewensteina-Jensena (L-J)

4.

wybiórczo-różnicujące

– służą do badania cech metabolizmu danego

gatunku bakterii
- podłoże Levine'a, agar SS, podłoże Chapmana, podłoże
MacConkeya, podłoże Wilsona-Blaira, pożywka Endo, podłoże
Kliglera

5.

podłoża specjalne

– do hodowli bakterii o specjalnie wysokich

wymaganiach odżywczych, wysokowartościowe substancje
odżywcze
- podłoże Löfflera, podłoże Tarroziego-Wrzoska, agar czekoladowy,
pożywka Clauberga, podłoże Löwensteina-Jensena.

Podłoże Chapmana

•

dla gronkowców, stałe, kolor-
amarantowego

•

zawartość:



czynnik wybiórczy- 7,5% NaCl



czynnik różnicujący – mannitol



wskaźnik - czerwień fenolowa

•

fermentacja mannitolu – zakwaszenie
środowiska, zmiana barwy na żłótą

•

brak fermentacji mannitolu – brak zmiany
podłoża

Podłoże McConkeya

•

dla pałeczek Gram (-) z rodziny
Enterobacteriaceae, stałe, koloru
cielistego/beżowego

•

zawartość:



czynnik wybiórczy – fiolet krystaliczny,
dezoksycholan sodu



czynnik różnicujący – laktoza



wskaźnik – czerwień obojętna

•

fermentacja laktozy – kolonie różowe

•

brak fermentacji – kolonie szare/beżowe

Podłoże SS

•

podłoże do izolacji pałeczek Salmonella i
Shigella

•

zawartość: sole kwasów żółciowych, sole
cytrynianu – hamują wzrost bakterii
Gram(+) i Gram(-); laktoza- odróżnienie
pałeczek laktozo(+), tiosiarczan sodowy-
wykrywanie szczepów wytwarzających H

2

S

•

wytwarzanie H

2

S – bezbarwne kolonie

z zaczernieniem środka

Inne podłoża

•

Podłoże Loewensteina-Jensena (L-J)

– podłoże

n-w dla prątków, modyfikacje: podłoże Ogawy
lub pożywka Stonebrinka

•

Podłoże Löfflera

– podłoże do hodowli

maczugowców błonnicy

•

Podłoże Clauberga

- wybiórcza pożywka do

hodowli maczugowca błonicy

•

Podłoże Tinsdale’a

– podłoże do izolacji i

różnicowania maczugowców

•

Podłoże z mannitolem i NaCl

– podłoże do

izolacji gronkowców

•

Podłoże z żółcią i eskuliną

– podłoże do izolacji

i identyfikacji paciorkowców

•

Podłoże agar czekoladowy

– podłoże wzrostowe

dla Heamophilus czy Neisseria gonorrhoeae, z
batytracyną – podłoże wybiórcze dla pałeczek
Haemophilus

•

Podłoże Wrzoska

– podłoże do hodowli i

wykrywania bakterii beztlenowych, szczególnie z
rodzaju Clostridium

•

Podłoże tioglikolanowe

- podłoże służy do kontroli

jałowości i hodowli bakterii beztlenowych

•

Podłoże z cetrimidem

– podłoże do izolacji

pałeczek z rodzaju Pseudomonas

•

Bulion cukrowy

– płynne podłoże namnażające

Agar krwawy

•

stałe, koloru czerwonego

•

podłoże zawiera 5% jałowej, odwłóknionej
krwi baraniej

•

podłoże bogate przeznaczone dla
drobnoustrojów o wysokich wymaganiach
wzrostowych i odżywczych

•

umożliwia wykrywanie

drobnoustrojów

hemolizujących i rozróżnienie rodzaju
hemolizy

Typy hemolizy

•

liza erytrocytów może być wywołana przez wiele czynników, w tym
także przez działanie enzymów bakteryjnych – hemolizyn

•

typy hemolizy wywoływanej przez bakterie z rodzaju Streptococcus
na podłożu z krwią

hemoliza

alfa(α)

beta (β)

gamma (γ)

charakterysty

ka

niecałkowity rozkład

erytrocytów

całkowity rozkład

erytrocytów

brak hemolizy

bakterie

wywołujące

paciorkowce

α- hemolizujące np.

Streptococcus pneumoniae

paciorkowce

β-hemolizujące np.

Streptococcus

pyogenes

Streptolizyna

paciorkowce

γ-hemolizujące

(właściwie

niehemolizujące)

np. Streptococcus

mutans

wzrost na

podłożu

agarowym

uzupełnionym

krwią

strefa hemolizy mało

przejrzysta i słabo

ograniczona, w obrębie strefy

hemolizy pod mikroskopem

widoczne są erytrocyty,

charakterystyczne

zazielenienie podłoża –

przekształcenie hemoglobiny

w methemoglobinę

strefa wyraźnego

przejaśnienia wokół

kolonii, brak

erytrocytów w

obrębie strefy

hemolizy – całkowite

rozpuszczenie

krwinek

brak zmian

Podłoże Muellera-Hinton

•

podłoże rutynowo stosowane do oznaczania
lekowrażliwości i identyfikacji bakterii
metodą krążkowo-dyfuzyjną

Szereg biochemiczny do

identyfikacji pałeczek Gram(-)z

rodziny Enterobacteriaceae

1.

podłoże Kliglera

2.

woda peptonowa z 10% laktozą pod
parafiną

3.

woda peptonowa z mannitolem i rurką
Durhama

4.

woda peptonowa z tryptofanem

5.

podłoże Christensena z mocznikiem

Podłoże Kliglera

•

do określania rozkładu glukozy, laktozy,
wytwarzania gazu i H

2

S

•

Interpretacja wyników:

1.

Skos i słupek bez zmian – brak
fermentacji glukozy i laktozy

2.

Żółty skos i słupek – fermentacja
glukozy i laktozy

3.

Rozerwanie lub bańki powietrza w
podłożu – wytwarzanie gazu
(H

2

/CO

2

)w trakcie fermentacji glukozy

i/lub laktozy

4.

Czerwony skos i żółty słupek –
fermentacja glukozy, brak fermentacji
laktozy

5.

Zaczernienie podłoża – wytwarzanie
H

2

S

Woda peptonowa z

laktozą pod parafiną

•

do określania zdolności fermentacji laktozy w
warunkach beztlenowych

•

interpretacja:



reakcja ujemna (-) – brak zmian w
zabarwieniu



reakcja dodatnia (+) - zmiana zabarwienia
podłoża z fioletowego na żółte

Woda peptonowa z tryptofanem

•

do określania zdolności bakterii do
wytwarzania indolu z tryptofanu

•

interpretacja:



reakcja ujemna (-) – brak czerwonego
pierścienia po dodaniu odczynnika Ehrlicha



reakcja dodatnia (+) – po dodaniu odczynniki
Ehrlicha pojawia się na powierzchni podłoża
czerwony pierścień

Woda peptonowa z mannitolem i

rurka Durhama

•

do określania zdolności fermentacji przez
bakterie mannitolu z wytworzeniem gazu

•

interpretacja:



reakcja ujemna (-) – brak gazu w rurce i brak
zmian w zabarwieniu podłoża (zielone)



reakcja dodatnia (+) – pojawienie się
banieczki gazu w rurce i zmiana zabarwienia
podłoża z zielonego na żółte

Podłoże Christensena

•

=woda peptonowa z mocznikiem

•

do wykrywania enzymu ureazy, mającego
zdolność hydrolizy mocznika do amoniaku
(NH

3

) i CO

2

•

interpretacja:



reakcja ujemna (-) – brak zman w
zabarwieniu podłoża (żółte)



reakcja dodatnia (+) – alkalizacja podłoża,
zmiana zabarwienia z żółtego na czerwone

Podłoże Sabouraud

•

służy do namnażania i
oznaczania ilościowego
chorobotwórczych grzybów

•

podłoże zawiera pepton sojowy,
ekstrakt drożdżowy i słodowy,
które dostarczają składników
odżywczych ułatwiających
rozwój drożdży

Mikroflora jamy ustnej

•

ma charakterystyczny skład

•

zasiedlana przez ok. 700 różnorodnych gatunków
mikroorganizmów

•

do organizmów zasiedlających j.ustną zaliczamy :
bakterie, grzyby, mykoplazmy, pierwotniaki, od czasu
do czasu występują również wirusy

•

naturalna flora jamy ustnej stabilizuje się w
dzieciństwie i stopniowo zmienia się wraz z wiekiem
pod wpływem czynników środowiskowych oraz
behawioralnych

•

interakcja pomiędzy drobnoustrojami j.ustnej z innymi
drobnoustrojami oraz z gospodarzem/żywicielem

Flora fizjologiczna=stała= osiadła

•

flora współwystępująca u gospodarza w stanie równowagi

•

nie wywołująca chorób

•

utrzymuje się do końca życia gospodarza

•

ma skład prawie nie zmienny

•

zachwianie równowagi w składzie stałej mikroflory powoduje stany
chorobowe w j.ustnej np.: próchnicę zębów czy choroby przyzębia

Flora przejściowa

•

flora pojawiająca się przez krótki okres

•

ma zmienny stosunek ilościowy

•

w jej skład wchodzą gatunki saprofityczne, jak i potencjalnie
chorobotwórcze

•

nie odgrywa zasadniczego znaczenia tak długo, jak długo skład
flory stałej się nie zmienia

Ekosystem jamy ustnej

Składa się z :

1.

flory jamy ustnej

2.

środowiska różne miejsca w jamie ustnej, w
których się drobnoustroje rozmnażają

3.

związanego z nimi otoczenia

Drobnoustroje autochtoniczne

•

gatunki występujące w określonym środowisku

•

mnożą się one i pozostają na miejscu

•

biorą udział w metabolizmie zbiorowiska
bakteryjnego

•

organizm systematycznie izolowany z siedliska

Drobnoustroje alochtoniczne

•

namnożyły się one w innych środowiskach

•

nie mają zdolności do zasiedlania do czasu, gdy nie
wystąpią zaburzenia w ekosystemie

Amfibiont

zakres miejsc pomiędzy symbiozą, a patogennością

Patogeny oportunistyczne

•

drobnoustroje mające możliwość wywołania choroby w
wyjątkowych okolicznościach np.:



zaburzenia w środowisku:



egzogennego (po zastosowaniu antybiotyku)



endogennego (zmiany w integracji układów obronnych
żywiciela)



występowanie w miejscach zazwyczaj dla nich nie
dostępnych

•

można je odróżnić od

jawnych patogenów

, które są związane

stale z jedną określoną chorobą