plik

Analiza biochemiczna

Dr Marcin Grąz, pok. 337

Ocena końcowa:



Egzamin (70%)



Wykłady + konwersatoria + praca semestralna (30%)

Organizmy modelowe w biochemii:



E. coli



S. cervisiae



B. subtilis



N. crassa



Ch. Pyrenoidosa

Projektowanie badań biochemicznych:

1.  Identyfikacja przedmiotu badań
2.  Krytyczna ocena stanu wiedzy, poznanie metodologii
3.  Postawienie hipotezy badawczej
4.  Wybór systemu badań (in vitro/in vivo)
5.  Identyfikacja badanej  zmiennej,  ocean wpływu, kontrola czynników  wpływających na wynik

doświadczenia (temperatura, pH, inhibitory proteaz)

6.  Zaprojektowanie eksperymentu
7.  Przeprowadzenie eksperymentu
8.  Dokumentacja otrzymanych wyników
9.  Powtórzenie eksperymentu
10. Analiza otrzymanych wyników
11. Przedstawienie wniosków na podstawie wyników
12. Przedstawienie nowych hipotez

Wszystkie doświadczenia naukowe dają wyniki, które można przedstawić statystycznie – pozwalają
one dotrzeć do zależności występujących między cząsteczkami badanych substancji.

Bazy komputerowe:



EBSCO



ELSEVIER



SPRINGER



SCOPUS



NATURE



SCIENCE AAAS



PUBMED



WE OF SCIENCE



ICM



Bazy na stronach czasopism

Wskaźniki bibliometryczne:



Bibliometria – zbiór metod służących do oceny danego zbioru czasopism, autorów,
uczelni



Indeks cytowań (Science Citation Index) znajdujący się na Web of Science na platformie
Web of Knowledge opisujący ilość cytowań danego autora



Miara oddziaływania (Impact Factor) – wskaźnik prestiżu czasopisma obliczany
na podstawie indeksów cytowań



Lista filadelfijska (ISI Master Journal List) zawiera czasopisma spełniające odpowiednie
kryteria jakości



Indeks Hirsha – wskaźnik odzwierciedla dystrybucję cytowań publikacji określonego
naukowca i liczbę jego najlepszych publikacji.

Struktura pracy naukowej:

Gatunek pracy

Zakres tematyczny
(definicja gatunku)

Szkielet

Zakres bibliografii
(redakcja może zastrzec
maksymalną
liczbę pozycji)

Naukowo-
badawcza

przebieg i wyniki
określonych badań z
zakresu medycznych nauk
podstawowych,
biomedycznych,
biotechnicznych; zwykle
tylko jeden typ badań, jeden
wynalazek albo jedno
odkrycie; każde następne
opisuje się w osobnej pracy;
wyniki badań lub odkryć
cząstkowych (etapowych)
można opisywać osobno w
kolejnych pracach wraz z
przyrostem materiału
wynikowego; wyniki
zakończonego ciągu takich
badań przedstawia się
zwykle w osobnej pracy
poglądowej jako
podsumowanie; wyniki
badania pojedynczego
podaje się wraz z opisem
badań w tym samym tekście

1. tytuł
2. nazwiska autorów (wraz z

jednostkami badawczymi)

3.  słowa kluczowe
4.  streszczenie
5.  wstęp

a. ogólny opis przedmiotu
badań na tle
dotychczasowej wiedzy w
danej dziedzinie
b. cel badań (hipotezy,
które badacz chce
potwierdzić)
c. warunki, w jakich
wykonywano badania (w
tym miejsce, ew.
współautorzy, sponsorzy),
także trudności i
przeszkody
d. omówienie
podstawowych pojęć i
definicji i ew. objaśnienie
znaczenia tych, które w
różnych pracach są różnie
rozumiane
e. zestawienie używanych
w pracy skrótów i
skrótowców

6. metoda - szczegółowy opis

wywodu logicznego, metod
stosowanych w czasie
badań, opis modeli
eksperymentalnych,
użytych aparatów,

piśmiennictwo możliwie
najszerzej reprezentujące
tematykę

substancji, także sposobów
oceny statystycznej i
zgodności z EBM

7. materiał (opis doboru i

zrównoważenia badanych
prób, ich
reprezentatywności
względem populacji albo
innych zbiorów)

8. opis przebiegu badań,

umożliwiający innym
badaczom powtórzenie
procedur

9.  wyniki badań
10.  omówienie wyników
11.  wnioski

Kliniczna

obserwacje statystycznie
istotnej grupy zdrowych lub
chorych w zakresie
określonego typu zjawisk
fizjologicznych lub
patologicznych, w tym
stosowane metody i
procedury diagnostyczne,
terapeutyczne,
rehabilitacyjne,
profilaktyczne,
pielęgnacyjne,
psychologiczne

1. tytuł
2. nazwiska autorów (wraz z

jednostkami badawczymi)

3.  słowa kluczowe
4.  streszczenie
5.  wstęp

6. metoda (szczegółowy opis

wywodu logicznego, metod
stosowanych w czasie
badań, opis modeli
eksperymentalnych,
użytych aparatów,
substancji, także sposobów
oceny statystycznej,
zgodności z EBM

)

7. materiał (opis doboru i

zrównoważenia badanych
prób, ich
reprezentatywności
względem populacji albo
innych zbiorów)

8. opis przebiegu badań,

umożliwiający innym
badaczom powtórzenie
procedur

piśmiennictwo możliwie
najszerzej reprezentujące
tematykę

9.  wyniki badań
10.  omówienie wyników
11.  wnioski

Poglądowa

najczęściej spotykane,
powszechnie przyjęte,
oficjalne albo oparte na
ciągu własnych badań
poglądy na określony temat
albo na logicznie powiązaną
grupę zagadnień
medycznych, w tym z
zakresu nauk
podstawowych i
humanistyki lekarskiej; duże
podobieństwo do rozdziału
podręcznika, ale opis
wzbogacony rozważaniami i
komentarzami autorskimi
lub zaproszonych
specjalistów

struktura zależna od dziedziny,
najczęściej:

1. tytuł
2. autorzy (wraz z

jednostkami badawczymi)

3.  słowa kluczowe
4.  streszczenie
5.  wprowadzenie (wstęp),
6.  działy tekstu głównego

rozbudowane
piśmiennictwo dotyczące
każdego wyrażonego
poglądu i zagadnień
szczegółowych, o których
mowa w tekście, w tym
źródła cytatów lub
opisów badań, cudzych
wniosków itp.; dbałość o
uwzględnianie
pierwszeństwa w
odkryciach (o ile to
możliwe)

Skrypt

szkic podręcznika
akademickiego,
podyplomowego,
kursowego lub do
korzystania w innym
systemie edukacji;
podręcznik niekompletny,
ale zawierający materiał
wykładany (lub potrzebny
studentom do rozumienia
wykładów) autora

struktura zależna od dziedziny,
najczęściej:

1. tytuł
2. autor (autorzy), jeśli

podręcznik ma wielu
autorów

3.  streszczenie (rzadko)
4.  wprowadzenie (wstęp),
5.  działy tekstu głównego

piśmiennictwo
zawierające tytuły
najważniejszych
podręczników z danej
dziedziny; rzadko
szczegółowe

Monografia

duża praca (zwykle w
postaci książki lub
monotematycznego serwisu
internetowego),
omawiająca jedno
zagadnienie osiowe wraz z
jego odgałęzieniami
tematycznymi i ze
wskazówkami
interdyscyplinarnymi lub
intertekstualnymi; może
mieć charakter
dokumentarny (zestawianie
materiałów, danych,
faktów), teoretyczny
(twierdzenia, hipotezy),
eseistyczny (omawianie,
rozważania, heurystyka)
albo mieszany

struktura zależna od dziedziny,
najczęściej:

1. tytuł
2. autor (autorzy), jeśli

podręcznik ma wielu
autorów

3.  wprowadzenie (wstęp)
4.  działy tekstu głównego
5.  zakończenie z wnioskami

rozbudowane
piśmiennictwo dotyczące
każdego wyrażonego
poglądu i zagadnień
szczegółowych, o których
mowa w tekście, w tym
źródła cytatów lub
opisów badań, cudzych
wniosków, w tym
podlegających dyskusji;
dbałość o uwzględnianie
pierwszeństwa w
odkryciach (o ile to
możliwe)

Podręcznik
(rozdział
podręcznika)

najczęściej spotykane,
powszechnie przyjęte,
oficjalne albo oparte na
ciągu własnych badań
poglądy medyczne i z
zakresu nauk pokrewnych,
w tym spychologiczne i
filozoficzne, na określony
temat albo na logicznie
powiązaną grupę zagadnień
medycznych, także z
zakresu nauk
podstawowych;
najważniejsze problemy
spotykane w praktyce i
sposoby ich rozwiązywania;
nawiązanie do dziedzin
pokrewnych; także historia
zagadnienia; pewne
podobieństwo do pracy
poglądowej, ale bez
rozważań i rozwiniętych
komentarzy odautorskich

struktura zależna od dziedziny,
najczęściej:

1. układ rytmiczny, tj. każdy

typ części podręcznika
powinien mieć te same
elementy naprowadzające
czytelnika, informujące w
jakiej części dzieła się
znajduje i jakiego rodzaju
treści (wprowadzenie,
teoria, fakty, zalecenia
praktyczne itd.) może po
niej się spodziewać (stąd
także częste stosowanie
żywych pagin, sterujących
poruszanie się po książce,
lub lotnych spisów treści w
e-booku)

2. tytuł
3. autor (autorzy), jeśli

podręcznik ma wielu
autorów

4.  streszczenie (rzadko)
5.  wprowadzenie (wstęp),
6.  działy tekstu głównego

piśmiennictwo
podstawowe i (lub)
uzupełniające albo
dokumentujące fakty
uznane za nowe (w
następnych wydaniach
takiej pozycji
piśmiennictwa może już
nie być);
bardzo rzadko
piśmiennictwo
dokumentujące
szczegółowe poglądy
(tylko w podręcznikach o
niewielkiej objętości)

Referat naukowy praca przygotowana do

wygłoszenia na konferencji
naukowej i jednocześnie do
druku w pamiętniku
konferencji; zakres
tematyczny dowolny

1. tytuł
2. autorzy (wraz z

jednostkami badawczymi)

3. krótkie wprowadzenie

(wstęp)

4. omówienie istoty

zagadnienia (bez dygresji)

5. wnioski (zwykle w formie

wykazu twierdzeń lub
postulatów)

piśmiennictwo
odpowiednie do typu
tematycznego, zwykle
ograniczone do 10-15
pozycji

Plakat naukowy

streszczenie w postaci grafu
lub listy zdań na dużym
arkuszu, przedstawiane
alternatywnie do referatu
na konferencji naukowej;
zakres tematyczny dowolny

1.  tytuł
2.  autorzy
3.  graficzne, tabelaryczne lub

w formie wykazu
przedstawienie istoty
zagadnienia

bez piśmiennictwa,
rzadko do 5 pozycji

Podstawowe procedury i wyposażenie laboratoryjne:



umożliwiają wykonywanie doświadczenia



ustalają warunki doświadczenia



umożliwiają komputerowe opracowanie danych



oczyszczają i dezynfekują sprzęty oraz sale labolaotryjne

Normy czystości odczynników chemicznych:



odczynniki techniczne



odczynniki czyste



odczynniki chemicznie czyste



odczynniki czyste do analizy



odczynniki spektralnie czyste do specjalnych zastosowań

Stopnie jakości wody laboratoryjnej:



typ 1 (ultraczysta, MiliQ) – R > 18



typ 2 (czysta) – R > 1



typ 3 – R > 0,05

Roztwory buforowe – mieszaniny roztworów słabych kwasów lub zasad i ich soli lub mieszaniny
roztworów dwóch soli kwasu wielowodorowego o kilku stopniach dysocjacji.

Efektywny zakres buforowania wynosi pH = pK ± 1

Pojemność  buforowa  –  zdolność  przeciwstawiania  się  zmianom  pH  po  wprowadzeniu  kwasu
lub zasady.  Wzrasta  wraz  ze  wzrostem  stężenia  buforu  i  maleje  z  rozcieńczaniem.  Bufory  maja
największą  pojemność  buforową  w  zakresie  pH  zbliżonym  do  pK,  czyli  gdy  stosunek  stężeń
składników  buforu  jest  zbliżony  do  jedności.  Miarą  pojemności  buforowej  jest stosunek  liczby  moli
kwasu  lub  zasady,  która  musi  być  dodana  do  1  litra  roztworu,  aby  spowodować  zmianę  pH
o jednostkę.

Bufory lotne (mrówczan amonu, octan amonu) – umożliwiają szybkie odparowanie substancji.

Typowe bufory stosowane w biochemii:

Efektywny zakres pH

Bufory

pK (25 C)

2,5 – 7,0

Cytrynianowe

3,13

3,0 – 4,5

Mrówczanowe

3,75

3,5 – 6,5

Bursztynianowe

4,21

4,0 – 5,5

Octanowe

4,76

6,0 – 7,0

Fosforanowe

7,20

7,5 – 9,0

Tris

8,06

8,5 – 10,0

Boranowe

9,23

9,0 – 10,5

Glicynowe

9,78

[więcej w broszurze Biological Buffer lub Stoll, V.S., Blanchard, J.S. et al. (1990) Methods Enzymol.
182, 24-38]

Dodatki do buforów:



azydek sodu



EDTA



DTT



DTE



2-merkaptoetanol



Detergenty

o Jonowe:

 Kationowe (CTAB)
 Anionowe (SDS)

o Niejonowe (Triton X-100)
o Obojniaczo-jonowe (CHAPS)

Usunięcie detergentu:



Wytrącanie białka



Dializa



Metody chromatograficzne



Rozcieńczenie próby

[więcej w broszurze EMD Biosciences „Guide for solubilization of membrane proteins and selecting
tools for detergent removal”]

Rodzaje elektrod:



Elektrody I rodzaju – odwracalne względem kationu (np. wodorowa)



Elektrody II rodzaju – odwracalne względem anionu (np. kalomelowa, chlorosrebrowa)



Elektrody III rodzaju – odwracalne względem kationu (np. wapniowa)



Elektrody utleniająco-redukujące (np. ninhydrynowa)

Ogniwo elektrochemiczne – układ elektroda wskaźnikowa (reagują na zmiany potencjału na obecność
jonu) – elektroda odniesienia (porównawcza, o stałym potencjale) zanurzone we wspólnym
elektrolicie.

Przygotowanie próbki:

1. Dezintegracja komórek

a. W

celu

izolacji

białek,

kwasów

nukleinowych

lub

innych

związków

niskocząsteczkowych

b. Wybór odpowiedniego materiału biologicznego i jego ochrona przed degradacją



Inhibitory proteaz

o  PMSF (proteazy serynowe – 1 mM)
o  Pepstein (proteazy aspartylowe – 0,1 mg/ml)
o  PCMB (proteazy cysteinowe – 1 mM)
o  EDTA (metaloproteazy – 5 mM)

2. Homogenizacja mechaniczna:

a.  Dodatek antyspieniaczy – kontrola temperatury
b.  Sonifikacja
c.  Wysokie ciśnienie (prasa French’a)
d.  Cykliczne zamrażanie i odmrażanie
e.  Hipotoniczne bufory
f.  Liza enzymatyczna komórek

3. Proces solubilizacji białek błonowych z błon komórkowych:

a. Detergenty

Wytrącanie białek i kwasów nukleinowych zależy od ich rozpuszczalności, którą warunkują m.in. pH,
temperatura, siła jonowa, czy dodatek soli. Strącanie białek może być przeprowadzane na dwa
sposoby:



Nieodwracalną agregację białek (rozfałdowanie -> denaturacja)



Odwracalna agregacja białek (strącanie białek z roztworu)

o Wysalanie białek za pomocą TCA, PEG lub siarczanu amonu

Do usunięcia soli można użycz metod:



Odsalanie SEC – chromatografia sita molekularnego, w której nanosi się na kolumnę 20-30%
jej objętości.



Dializa – metoda oczyszczania roztworów przy użyciu błony półprzepuszczalnej.



Ultrafiltracja – proces filtracji z użyciem sit molekularnych, membran i wszelkich materiałów
porowatych,  o  porach,  których  rozmiary  są  zbliżone  do  wielkości  pojedynczych  cząsteczek
(zwykle  kilka–kilkadziesiąt  nanometrów).  Wielkość  cząsteczek  oddzielanych  substancji  musi
znacznie  przekraczać  wielkość  cząsteczek  rozpuszczalnika.  Siłą  napędową  procesu  jest
wysokie ciśnienie hydrauliczne roztworu rozdzielanego.

Liofilizacja – proces pozwalający na zagęszczenie próbki, ale zagęszcza także sole. Polega na suszeniu
zamrożonych substancji przez sublimację.

Chromatografia  –  fizykochemiczna  metoda  rozdzielania,  w  której  składniki  rozdzielane  ulegają
podziałowi między dwie fazy: stacjonarną (nieruchomą) oraz ruchomą (poruszającą się w określonym
kierunku).  Oddziaływania  występują  zarówno  pomiędzy  substancją  rozdzielaną,  a  fazami  ruchomą
i stacjonarną, jak też między oboma fazami. Równowaga podziału ma dynamiczny charakter zależny
od  właściwości  rozdzielanej  substancji  oraz  rodzajów  faz  ruchomej  i  stacjonarnej,  co  określa
współczynnik retencji (k).

Sprawność  układu  chromatograficznego  –  zdolność  kolumny  do  wytwarzania  wąskich  pików
(wyrażana  liczbą  półek  teoretycznych).  Na  sprawność  wpływają  m.in.  modyfikacje  substancji
rozdzielanej, temperatura, prędkość przepływu fazy ruchomej, wielkość i kształt  ziarem absorbentu
oraz  jakość  upakowania.  Aby  zwiększyć  sprawność  układu  stosujemy  ziarna  absorbentu  o  małej
średnicy (np. 5 um) o płytkich porach oraz brak wolnych przestrzeni (tzw. dead volume) w kolumnie.

Rodzaje chromatografii [więcej w Witkiewicz Z., Klasyfikacja technik chromatograficznych]:

W zależności od rodzaju eluentu:



chromatografia cieczowa – w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina
rozpuszczalników;



chromatografia gazowa – w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem
azot);



chromatografia nadkrytyczna – w której eluentem jest substancja w stanie nadkrytycznym.

W zależności od rodzaju fazy stacjonarnej i sposobu jej przygotowania:



Chromatografia planarna

chromatografia  cienkowarstwowa  TLC  (ang.  thin  layer  chromatography)  –  w  której
fazę  rozdzielczą  stanowi  cienka  warstwa  fazy  stałej  naniesiona  na  sztywną  płytkę.
Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania
sił  kapilarnych,  grawitacji  lub  pola  elektrycznego  następuje  przepływ  i  rozdział
mieszaniny;

chromatografia bibułowa – w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły
filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;



chromatografia  kolumnowa  –  w  której  faza  rozdzielcza  jest  umieszczona  w  specjalnej
kolumnie,  przez  którą  przepuszcza  się  następnie  roztwór  badanej  mieszaniny.  Przepływ
roztworu  przez  kolumnę  można  wymuszać  grawitacyjnie  lub  stosując  różnicę  ciśnień
na wlocie i wylocie kolumny;



chromatografia powinowactwa – w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest
zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych
substancji;



chromatografia jonowymienna – w której substancje oddziałują ze złożem za pomocą
oddziaływań jonowych.

W zależności od parametrów procesu:



HPLC

(ang.

high

performance/pressure

liquid

chromatography)

wysokosprawna/wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa – odmiana cieczowej
chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem;



FPLC

(ang.

fast

protein/performance

liquid

chromatography)

szybka,

białkowa/szybkosprawna  chromatografia  cieczowa  –  odmiana  HPLC  działająca  na  niższych
ciśnieniach,  stosująca  prócz  złóż  sorpcyjnych,  także  zwykłe  złoża  typu  sit  molekularnych,
służąca  głównie  do  rozdziału  białek  i  polipeptydów.  Opatentowana  i  wyłączna  nazwa
dla firmy Pharmacia;



UPLC (ang. ultra performance liquid chromatography) ultrasprawna chromatografia cieczowa
– odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej. Działa na wyższych ciśnieniach
i mniejszych przepływach, a kolumny mają mniejsze ziarno (1,7 – 1,8 μm). Pozwala uzyskiwać
krótsze czasy retencji i wyższe rozdzielczości. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy
Waters;



GPC (ang. Gel Permeation Chromatography) chromatografia żelowa – odmiana kolumnowej
chromatografii cieczowej. Polega na rozdziale składników mieszaniny na żelu lub sitach
molekularnych w zależności od rozmiarów cząsteczek. Stosowana m.in. do określania
średnich mas cząsteczkowych polimerów.

Chromatografia adsorpcyjna:



W normalnym układzie faz – faza stacjonarna jest zawsze bardziej polarna niż faza ruchoma



W odwróconym układzie faz – faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna
(pokryta „szczotką” łańcuchów alkilowych C8 lub C18)

Rodzaje chromatografii:



Sita molekularnego (ang. Size Exlusion Chromatography/ Gel Filtration)



Jonowymienna (ang. Ion Exchange Chromatography)



Chromatoogniskowanie (ang. Chromatofocusing)



Oddziaływań hydrofobowych (ang. Hydrophobic Interaction Chromatography)



Odwróconej fazy (ang. Reverse Phase Chromatography)



Powinowactwa (ang. Affinity Chromatography)

Szeregi eluotropowe – uszeregowanie rozpuszczalników według wzrastającej siły elucyjnej:

Rozpuszczalnik - Wskaźnik polarności wg Snydera (J. of Chrom. 92. 233, 1974)

n-heksan - 0,0

cykloheksan - 0,0

tetrachlorek węgla - 1,7

toluen - 2,3

dichlorometan - 3,4

butan-1-ol - 3,9

octan etylu - 4,3

chloroform - 4,4

aceton - 5,4

etanol - 5,2

metanol - 6,6

woda - 9,0

Elucja izokratyczna – niezmienny skład fazy ruchomej w trakcie całego rozdziału chromatograficznego

Elucja gradientowa – skład fazy ruchomej zmienia się systematycznie w trakcie analiz

Etapy rozdziału chromatograficznego:

1.  Równoważenie kolumny (5-10 CV)
2.  Aplikacja badanej próby (3-5% CV) i odpłukanie złoża
3.  Elucja (wymywanie) (10-20 CV)

4. Regeneracja złoża (5-10 CV)

Budowa chromatografu HPLC:



Pompa



Dozownik



Kolumna chromatograficzna + nośnik



Detektor



Rejestrator (komputer)



Sprzęt kontrolujący warunki

Faza  stacjonarna  wpływa  na  retencje,  selektywność  i  efektywność  rozdzielania  mieszanin  RP  HPLC.
Reaktywność  żelu  krzemionkowego  pozwala  na  otrzymanie  różnego  rodzaju  faz  stacjonarnych
z różnymi  grupami  funkcyjnymi.  Fazy  stacjonarne  o  charakterze  monomerowym  są  mniej  trwałe,
ale zapewniają bardziej powtarzalne wyniki poprzez większą sprawność i odtwarzalność parametrów.
Fazy  stacjonarne  o  charakterze  polimerowym  mają  mniej  zdefiniowaną  strukturę,  ale  są  bardziej
odporne  i  trwałe  na  wpływ  eluentu.  Typowymi  rozpuszczalnikami  RP  HPLC  są metanol,  acetonitryl,
tetrahydrofuran (związki polarne!).

Sito molekularne (SEC / GF) zwykle wykorzystuje elucję izokratyczną. Pierwsze wypływają cząsteczki
większe (migrujące między ziarnami), a ostatnie najmniejsze (których droga migracji jest dłuższa, gdyż
te wchodzą do ziaren żelu). Idealna matryca powinna być:



Hydrofilowym polimerem



Obojętna chemicznie



Nienaładowana



O jednolitym rozmiarze ziaren

Matryce w chromatografii SEC:



Sephadex – usieciowany przez epichlorhydrynę dekstran

o G-10, -15, -20, -50 (odsalanie i izolacja peptydów)
o G-75, -100, -150 (dla białek i makromolekuł)

Coarse
(10 – 400 um)

Medium
(50 – 150 um)

Fine
(20 – 80 um)

Superfine
(10 – 40 um)

Rozdzielczość Szybkość

(broszura „Properties of Sephadex” – tabela „Fractionation range”)



Sepharose – polimer agarozy

o 6B, 4B (45 – 165 um), 2B (60 – 200 um) (frakcjonowanie dużych cząsteczek)



Sephacryl HR – usieciowany przez bis-akrylamid dekstran



Superose – matryca agarozowa o dużej stabilności i ujednoliconych rozmiarach ziaren



Superdex – wysoce usieciowana agaroza kowalencyjnie przyłączona do dekstranu

SEC wykorzystuje się do zastosowań preparatywnych (odsalania, wymian buforu, frakcjonowania)
oraz analitycznych (określania masy cząsteczkowej natywnego białka, kształtu białka o znanej masie

cząsteczkowej oraz badania oddziaływań międzycząsteczkowych). Technika ta jest łatwa
do zastosowania i interpretacji wyników, prosta elucja, można stosować do wszystkich rodzajów
cząsteczek, a separacja jest niezależna od składu solwentu. Ograniczeniem jest objętość nanoszonej
próbki oraz gorsza rozdzielczość w porównaniu z metodami adsorpcyjnymi.

[więcej informacji o chromatografii w broszurach GE Healthcare: „ Strategies for Protein
Purification”,

„Size

Exclusion

Chromatography”,

„Ion

Exchange

Chromatography

Chromatofocusing”, „Hydrophobic Interaction Chromatography”]

Elektroforeza – zjawisko elektrokinetyczne, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego
przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym.
Prędkość rozdziału zależy od kształtu, ładunku, rozmiaru oraz oporów ruchu środowiska.

Wysokosprawna elektroforeza kapilarna (HPCE) dzieli się na techniki:



Elektroforezę strefową – umożliwia rozdzielenie naładowanych cząstek, na podstawie różnicy
w ich ruchliwościach w wolnym roztworze. Poszczególne składniki mieszaniny ustawiają się
w oddzielnych strefach.



Elektroforezę żelową – stosowaną do rozdzielania makrocząsteczek biologicznych,
rozdzielenia mieszaniny dokonuje się na podstawie różnicy w ich wielkościach,
na odpowiednim polimerze, pełniącym rolę sita molekularnego.



Izoelektroogniskowanie  –  wykorzystywana  jest  do  rozdzielania  białek  i  peptydów
na podstawie  ich  punktu  izoelektrycznego.  Gradient  pH  w  kapilarze  powstaje  dzięki
wprowadzeniu  do  buforu  amfolitów  (substancji  obojnakich  posiadających  w  swojej
cząsteczce zarówno ugrupowania o charakterze zasadowym i kwasowym).



Izotachoforeza – próbkę umieszcza się między dwoma buforami: wiodącym i zakańczającym.
Bufory  dobiera  się  tak,  aby  ich  efektywne  ruchliwości  obejmowały  efektywne  ruchliwości
jonów  w  próbce. Po przyłożeniu pola elektrycznego następuje  przepływ  buforu w  kapilarze
i dochodzi  do  uszeregowania  jonów  zgodnie  z  ich  ruchliwościami  w  przylegające  do  siebie
strefy, które migrują ze stałą szybkością.



Micelarna  elektrokinetyczna  chromatografia  –  umożliwia  rozdzielanie  cząstek  obojętnych,
dzięki  wprowadzeniu  do  roztworu  buforowego  związku  powierzchniowo  czynnego,
po przekroczeniu  tzw.  krytycznego  stężenia  micelarnego  monomery  surfaktanta  tworzą
micele.  Rozdzielanie  składników  mieszaniny  dokonuje  się  na  podstawie  różnicy  w  stopniu
ich powinowactwa do miceli.

Elektroosmoza  –  przemieszczanie  się  całej  masy  elektrolitu  wypełniającego  kapilarę  w  kierunku
jednej  z  elektrod.  Redukuje  to  czas  analizy.  Do  detektora  poruszają  się  więc  wszystkie  obecne
w roztworze  jony.  Podziałem  tym  rządzą  siły  wędrówki  elektroforetycznej  i  przepływu
elektroosmotycznego.

Właściwości  otoczki  hydratacyjnej  zależą  od  ładunku  substancji,  jej  rozmiaru,  a  także  warunków
(pH, temperatura,  ciśnienie).  W  punkcie  izoelektrycznym  (pI)  cząsteczka  białka  posiada  wypadkowy
ładunek elektryczny równy zero. W związku z elektrolizą (powstanie jonów wodorowych na katodzie
i hydroksylowych  na  anodzie)  stosuje  się  buforowany  elektrolit.  Nośniki  elektryczne  stabilizują

elektrolit, „zatrzymują” białko do momentu wybarwienia, warunkują lepszą separację
makrocząsteczek (sito molekularne).

Żele agarozowe używane w elektroforezie poziomej służą do separacji białek > 500 kDa
i immunoelektorforezy.

Żele  poliakrylamidowe  pełnią  rolę  sita  molekularnego.  Poprzez  stężenie  akryl  amidu  i  proporcji
akrylamid:bisakrylamid  można  zmieniać  wielkość  porów.  W  detekcji  można  stosować  światło
o długości  fali  >250  nm.  W  reakcji  polimeryzacja  może  być  inicjowana  chemicznie  (nadsiarczanem
amonu + TEMED) lub fotochemicznie (ryboflawina + TEMED).

Żele gradientowe charakteryzują się wraz z dystansem migracji wzrostem gęstości usieciowania,
co zwiększa dokładność żelu.

System separacji polipepytów opiera się na użyciu buforu rycynowego (a nie glicynowego).

Polimeryzacja żelu hamowana jest w pH > 6 i przez tlen cząsteczkowy.

W systemie ciągłym ten sam bufor o stałym pH znajduje się w żelu, próbie i przy elektrodach.
W systemie nieciągłym jest różnica w składzie jonów w żelu i roztworach elektrodowych, pozwala
na „zagęszczenie” próbek w początkowej fazie rozdziału. Bufor warunkuje przepływ prądu, stabilizuje
pH i odprowadza ciepło Joule’a.

Rodzaje systemów elektroforetycznych:



System Laemmeli – 5% (v/v) 2-merkaptoetanol + 2% (v/v) SDS



System Weber & Osborn’s – system ciągły z buforem fosforanowm



System Neville’a – system buforu Tris-siarczan/Tris-boran



System Ornstein-Davisa – przykład systemu nieciągłego

Bufor McLellana – do elektroforezy natywnej, pH 3,8 - 10,2 wykorzystywany do systemu ciągłego

Barwienie żelu:



Naturalne barwniki (błękit kumazyny, srebro, czerń amidowa)



Barwienie fluorochromami (bromek etydyny, barwniki fluorescencyjne)



Barwienie radioizotopowe



Barwienie enzymatyczne (substratowe)



Immunobarwienie

[więcej w broszuszach BioRad „Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis Systems” oraz „A Guide
to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection”]

Elektroforeza 2D – separacja białek w dwóch różnych kierunkach według punktu izoelektrycznego
oraz masy cząsteczkowej.

Genomika (DNA) -> Transkryptomika (mRNA) -> Proteomika (białka) –> Metabolomika

Fundamentalnym krokiem do poznania struktury białka jest enzymatyczna lub chemiczna degradacja
białkowej makromolekuły do mniejszych fragmentów, które mogą być dokładnie scharakteryzowane
w kontekście ich składu aminokwasowego i sekwencji. Obydwa sposoby fragmentacji białek muszą
spełniać kryteria stosunkowo wysokiej selektywności, powtarzalności i wydajności.

Zrealizowanie  projektu  dotyczącego  poznania  ludzkiego  genomu  umożliwiło  naukowcom
zsekwencjonowanie  wszystkich  genów  występujących  w DNA.  Zamierzeniem  tych  badań  było
zrozumienie  funkcjonowania  organizmu  ludzkiego.  Poznanie  genomu  umożliwiło  zdobycie  wiedzy
o białkach  kodowanych  przez  DNA,  jednak  nadal  nie  zostały  wyjaśnione  mechanizmy  działania
komórek, organów  oraz całego organizmu. Ocenia się, że  w genomie ludzkim jest zapisanych około
35  tysięcy  genów  kodujących  200-300  tysięcy  białek.  Poznano  strukturę  oraz  funkcje  jedynie
nieznacznej ich części.

Przed

rozdziałem

podstawie

techniki

ogniskowania

izoelektrycznego

potrzebne

jest oddysocjowanie od agregatów powstałych z pasków amfolitów i denaturowanie białek.

Analiza preparatyki:
Związek niskocząsteczkowy

Sposób usunięcia

Sole, jony

Dializa, ultrafiltracja, wytrącanie, GF

Jonowe detergenty

Wytrącanie acetonem

Kwasy nukleinowe

DNAzy, RNAzy

Lipidy

Detergenty, wytrącanie acetonem

Polisacharydy

TCA, siarczan amonu

Związki fenolowe

DTT, 2-merkaptoetanol

Amfolit – związek amfoteryczny ułożony w gradientowym układzie umożliwiającym rozdział białek
na podstawie punktu izoelektrycznego. Obecnie stosuje się im mobilizowany gradient pH na paskach
(IPG strips) dostępny w różnych długościach i różnym zakresie pH.

W  badaniach  proteomicznych  łączy  się  metody  biochemiczne,  fizykochemiczne  i bioinformatyczne.
W badaniach  tym  możliwe  jest  jednoczesne  analizowanie  tysięcy  białek  z danego  typu  komórek
lub tkanek.  Do  lat  70-tych XX  w.  masy  białek określano  za  pomocą  takich  metod  jak  elektroforeza,
ultrawirowanie  czy  chromatografia.  Metody  te  były  jednak  niedokładne,  błąd  wynosił  10-100%.
Dopiero  wprowadzenie  w latach  90-tych  techniki  spektrometrii  mas  (ang.  Mass  Spectrometry  MS)
przyczyniło  się  do  szybkiego  postępu  w tej  dziedzinie,  dzięki  wdrożeniu  nowych  technik  jonizacji.
MS jest  zdecydowanie  konkurencyjna  w stosunku  do  innych  metod  na  ogół  stosowanych
w proteomice,  przede  wszystkim  z uwagi  na  możliwość  analizy  białek  będących  w bardzo  małych
stężeniach,  a także  w skomplikowanych  mieszaninach.  Spektrometria  masowa  jest  techniką
analityczną pozwalającą na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, gdzie
przy znanym ładunku jonu daje możliwość obliczenia masy z dokładnością do pojedynczych atomów.
Typowy  spektrometr  masowy  składa  się  z komory  jonizacyjnej,  analizatora  różnicującego  jony  pod
względem  stosunku  ich  masy  do  ładunku  i detektora  zliczającego  liczbę  jonów,  które  są  sprzężone
z komputerowym systemem rejestracji i analizy danych.

Spektrometria masowa znalazła zastosowanie w badaniach budowy strukturalnej cząsteczek, składu
chemicznego,  czystości  danej  substancji  oraz  identyfikacji  zanieczyszczeń.  Głównymi  zaletami
spektrometrii  masowej  są  dokładność  wyznaczenia  masy,  rozdzielczość  do  kilku  jednostek  masy
atomowej  oraz  szeroki  zakres  stosowania,  od  peptydów  do  dużych  białek  (>200  kDa).  Ponadto
MS umożliwia  detekcję  strukturalnych  wariantów  białek  (białka  zmodyfikowane  posttranslacyjnie,
mutanty).  Znaczenie  spektrometrii  mas  polega  na  rozdzielaniu  w polu  elektromagnetycznym
ze względu na wartość stosunku masy m do ładunku z (m/z) zjonizowanych cząstek, jakie  znajdują się
w analizatorze  w wysokiej  próżni.  Zależnie  od  rodzaju  analizowanych  substancji,  używa  się  różnych
technik  jonizacji  i rozdziału  jonów.  W MS  do  analiz  białek  wykorzystywane  są  niskorozdzielcze
analizatory (kwadrupolowe, pułapki jonowe), bądź wysokorozdzielcze (mierzące czas przelotu jonów,
cyklotronowy rezonans jądrowy z transformacją Furiera). Najbardziej rozpowszechnionymi metodami
jonizacji  są  desorpcja  laserem  w stałej  matrycy  MALDI  (ang.  matrix-assisted  laser-desorption
ionization) oraz elektrorozpylanie (ESI, ang. Electrospray).

Technika  ESI  polega  na  rozpylaniu  cieczy,  która  zawiera  badaną  substancję,  w polu  elektrycznym
o wysokim  napięciu  (około  1-5  kV).  Na  ogół  metoda  ta  nie  powoduje  fragmentacji  badanych
cząsteczek.  Podczas   wykorzystania  tej  techniki  wzbudzania,  powstające   jony  często  mają  ładunek
wielokrotny,  natomiast  liczba  przyłączonych  protonów  zależna  jest  od  liczby  zasadowych
aminokwasów  jakie  występują  w badanych  cząsteczkach.  Cząsteczka  białka  ma  możliwość
przyłączenia  kilkunastu,  a nawet  kilkudziesięciu  protonów  dlatego  można  analizować  białka
o wysokich  masach  cząsteczkowych,  które  mogą  wynosić  kilkaset  tysięcy  daltonów  (Da).  Głównymi
zaletami  tej  metody  są:  wysoka  czułość  oznaczeń,  możliwość  analizy  dużych  cząsteczek  do  około
80 000  Da,  minimalna  fragmentacja  próbki  w czasie  jonizacji,  a także  kompatybilność  z technikami
chromatograficznymi  i elektroforetycznymi.  Dzięki  sprzężeniu  ESI,  a w  późniejszym  czasie  także
MALDI, z chromatografią cieczową uzyskano dalsze zwiększenie czułości analiz w MS.

Inną  metodą  jonizacji  stosowaną  w spektrometrach  służących  do  analizy  peptydów  i białek  jest
desorbcja  laserowa  w stałej  matrycy  -  MALDI.  W  technice  tej  stosuje  się  jonizację  wiązką  laserową
o odpowiednio  dobranej  energii,  by  nie  doprowadzać  do  fragmentacji  cząsteczek,  a tylko  do  ich
„wybijania”  z właściwie  przygotowanej  matrycy.  Matryca  pochłania  energię  lasera,  która  z kolei
przekazywana jest do analizowanych cząsteczek. Spektrometry MALDI stosowane są do analizy białek
o masach  od  ~1000  Da  do  nawet  kilkuset  tysięcy  Da.  Technika  MALDI  polega  na  kokrystalizacji
cząstek  substancji  badanej  z cząsteczkami  matrycy  absorbującej  światło,  zwykle  kwasów
aromatycznych.  Zazwyczaj   jako  matryce  wykorzystuje  się  pochodne  kwasu  cynamonowego
(np. kwas  synapinowy,  kwas  α-cyjano-4-hydroksycynamonowy).  Cząsteczki  białka  w matrycy
wzbudza się za pomocą światła lasera. W wyniku tego z kryształów desorbowane są uprotonowane
cząsteczki próbki, a powstałe kationy, mające na ogół pojedynczy ładunek ([M + H]

), które nazywane

są jonami molekularnymi. W normalnych warunkach nie obserwuje się ich fragmentacji. W podobny
sposób  działają  spektrometry  typu  SELDI  (ang.  surface-enhanced  laser  desorption  ionization).
Wykorzystują  one  desorbcję  zjonizowanych  światłem  laserowym  cząsteczek  białek  następujących
z odmiennego  typu  powierzchni  swoiście  wiążących  białka.  Takie  powierzchnie  są  pokryte
substancjami  będącymi  odpowiednikami  złóż  chromatograficznych.  SELDI  stosowane  są  przede
wszystkim  w proteomice  klinicznej  w badaniach  przesiewowych.  Powszechne  zastosowanie
proteomiczne  mają typy  analizatorów  m/z -  czasu  przelotu  jonów  –  ToF  (ang.  time  of  flight),  które
rejestrują  czas  przelotu  zjonizowanych  cząsteczek  (zazwyczaj  0,01-1  ms)  i są  odwrotnie

proporcjonalne  do  wartości  m/z  analizowanych  jonów.  Z widma  masowego  można  odczytać  jaka
liczba jonów o precyzyjnie określonej masie została zliczona przez detektor.

Spektrometria  mas  wykorzystywana  jest  także  do  badań  strukturalnych  białek,  a szczególnie
do ich identyfikacji.  W tym  celu  oczyszczone  białko  początkowo  poddaje  się  trawieniu  na  mniejsze
fragmenty  przy  pomocy  enzymu  (zastosowanie  znajdują  tu  proteazy,  jak:  chymotrypsyna,  trypsyna
oraz  kolagenoza).  Uzyskane  peptydy  wymywa  się  z żelu,  a następnie  poddaje  analizie.
Na spektrometrze MALDI-TOF otrzymuje się widmo, które ukazuje masy poszczególnych peptydów.
Jest to mapa peptydowa, typowa dla każdego białka, co jest skutkiem specyfiki substratowej enzymu.
Jako  przykład  można  podać  trypsynę,  która  zrywa  wiązania  w białku  zawsze  po  resztach
aminokwasowych  lizyny  i argininy,  natomiast  masy  uzyskanych  fragmentów  zależne  są  od  pozycji
tych  dwóch  aminokwasów  w sekwencji  białkowej.  W wyniku  trawienia  otrzymane  masy  peptydów
są porównywane z masami peptydów wynikającymi z trawienia in silico sekwencji aminokwasowych,
które są obecne w białkowych bazach danych. Metoda ta umożliwia jedynie identyfikację poznanych
wcześniej białek.
[więcej o MS w Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa
1996]

Proteom – zbiór wszystkich białek kodowanych przez genom i produkowanych przez pojedynczą
komórkę, tkankę lub organ. Analizą proteomu zajmuje się proteomika – nauka gromadząca
informacje dotyczące identyfikacji struktur białkowych oraz zajmująca się rozpoznawaniem sekwencji
białek oraz ich funkcji.

Genom jest modelem statystycznym (niezmiennym w pewnym obszarze czasu), zaś proteom ukazuje
co dzieje się obecnie w komórce (a więc jest modelem dynamicznym). W badaniach genomiki,
transkryptomiki i proteomiki niezbędne jest korzystanie z bioinformatycznego opracowania danych.
Rozpatrywanie funkcji białka w oderwaniu od jego otoczenia może prowadzić do błędnych wniosków.

Mieszaniny białek poddawane są trawieniu proteazą (trypsyną), a następnie mogą być analizowane
w spektrometrze (metoda bottom up) lub po rozdziale MS niestrawionych proteolitycznie białek
lub peptydów o masie nieprzekraczającej 50 kDa (metoda top down).

Strategie analizy proteomu:

1.  Zebranie i przechowywanie materiału
2.  Rozdział białek w próbce
3.  Analiza MS
4.  Bioinformatyka
5.  Badanie funkcji lub struktur wyższych

HPLC/MS gwarantuje wysoką czułość oraz wysoką rozdzielczość rozdziału, zapewnia ilość danych
wystarczającą do pełnej identyfikacji, jednak zastosowanie takiej techniki powoduje utratę
wprowadzonej próbki, wrażliwość na wybrane zanieczyszczenia oraz trudności w jonizacji niektórych
substancji.

Analiza mapy peptydów z udziałem systemu LC/MS:

1.  Białko trawione proteazą o określonych właściwościach
2.  Otrzymujemy fingerprint białka
3.  Trypsyna  hydrolizuje  wiązanie  peptydowe  po  C-końcowej  stronie  L-argininy  i  L-lizyny

(z wyjątkiem sytuacji, gdy kolejnym aminokwasem jest prolina)

4. Chemiczna fragmentacja (bromocyjanian, chlorowodór)

Sekwencjonowanie z udziałem tandemowej spektrometrii mas:

1. Kontrolowane rozerwanie wiązań kowalencyjnych analizowanej cząsteczki i uzyskaniu

informacji o jej strukturze na podstawie otrzymanego widma fragmentacyjnego

2. Otrzymanie etykiet peptydowych (peptide tags)
3. Uninterpreted MS serach

Bazy bioinformatyczne:



Mascot



Protein Prospector



Peptide Search



Seaquest



Protein Data Bank



KEGG



Brenda Enzyme

Działy proteomiki:



Proteomika strukturalna – poznanie struktury przestrzennej białek. Pozwala na
zlokalizowanie miejsca łączenia się leku z białkiem.



Proteomika ilościowa – charakterystyka ekspresji białek. Pozwala na weryfikowanie
markerów chorobowych (zrozumienie mechanizmów).



Proteomika funkcjonalna – ocena stanu aktywacji i wzajemnych oddziaływań między
białkami. Pozwala na nowych opracowanie technik białkowych.

Badanie funkcji białka polega na:



Identyfikacji białka



Szczegółowej charakterystyce



Próbie modyfikacji aktywności



Analizie rozmieszczenia w tkankach



Oddziaływaniu z innymi białkami

Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej (DPL / GLP) dostępne w handbook’u Good Laboratory Practice
prezentowanym przez WHO.

Walidacja metody analitycznej – proces ustalania charakterystyki technicznej (parametrów metody)
odpowiedniego celu analitycznego. Celem walidacji jest zapewnienie, że niepewność wyniku jest
możliwa do zaakceptowania przez odbiorcę, oszacowanie wpływu różnych czynników na niepewność
wyniku. Brak jest dokładnej metodyki przeprowadzania walidacji.

Walidowane parametry:



Specyficzność – zdolność jednoznacznego określenia substancji analizowanej w obecności
składników, które mogą być zawarte w próbce



Zakres – przedział między minimalną i maksymalną zawartością/stężeniem substancji
aktywnej w badanej próbie, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość,
dokładność i precyzję [%]



Granice wykrywalności (DL) – najmniejsze stężenie (ilość) badanej substancji w próbce, które
może być wykryte, lecz niekoniecznie oznaczone z odpowiednią dokładnością



Granice oznaczalności (QL) – najmniejsze stężenie (ilość) badanej substancji w próbce, jaka
może być ilościowo oznaczona z odpowiednią dokładnością i precyzją



Dokładność – zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością, stężeniem) a wartością
będącą wynikiem analizy [błąd systematyczny]



Zakres liniowości – zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost
proporcjonalnych do stężenia substancji w oznaczanej próbce, w określonym zakresie
[y = ax + b]



Precyzja – stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy (rozrzut wyników), gdy
dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezależnych oznaczeń
jednorodnej próbki [odchylenie standardowe]



Powtarzalność - wyraża precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie czasu, przez tego
samego analityka i w tych samych warunkach [współczynnik zmienności]



Czułość



Selektywność



Odzysk

[więcej informacji w projekcie rozporządzenia Ministra Zdrowia w sprawie wymagań Dobrej Praktyki
Wytwarzania z 8 lutego 2015 r.]