Przygotowanie bakterii kompetentnych E. coli przy zastosowaniu chlorku wapnia 

 
 
1.  Niewielką  objętość  (5  -  20  ml)  bulionu  LB  inokulować  bakteriami  z  pojedynczej  kolonii 
wybranego  szczepu  E.  coli  (np.  DH10B).  Hodowlę  prowadzić  przez  noc  w  temp.  37°C  z 
intensywnym wytrząsaniem. 
 
2.  200  -  300  ml  bulionu  LB  inokulować  1  ml  całonocnej  hodowli  (p.  wyżej).  Hodować  do 
osiągnięcia przez kulturę OD = 0,3 - 0,5 (maks. 0,7). 
 
3. Rozporcjować hodowlę do probówek wirowniczych, zbalansować wypełnione probówki. 
 
4. Wychłodzić probówki z hodowlą w lodzie przez 20 min. 
 
5. Zwirować hodowlę przy 6000 rpm przez 10 min. w temp. 0 - 2°C. 
 
6. Po wirowaniu nadsącz odrzucić a osad komórek zawiesić w 1/2 obj. r-ru chlorku wapnia. 
 
7. Zbalansować wypełnione probówki wirownicze, po czym zwirować jak wyżej. 
 
8. Nadsącz odrzucić a osad komórek zawiesić w 1/15 obj. r-ru chlorek wapnia + glicerol. 
 
9. Zawiesinę komórek rozporcjować po 100 μl do umieszczonych w lodzie probówek o poj. 1,5 
ml. 
 
10.  Probówki  z  bakteriami  zamrozić  w  suchym  ludzie  lub  ciekłym  azocie  i  przechowywać  w 
temp. - 80°C. 
 
 
Roztwory 
 
chlorek wapnia – 50 mM CaCl

2

 

 
chlorek wapnia + glicerol – 50 mM CaCl

2

, 10 % glicerol 

 
 
 

 

 

Transformacja chemicznie kompetentnych bakterii E. coli plazmidowym DNA 

 
 
1. Przygotować szalki z agarem LB i amplicyliną w stężeniu 100 μg/ml. 
 
2. Wyjąć bakterie kompetentne z zamrażarki na - 80°C i umieścić w lodzie. 
 
3.  Po  rozmrożeniu  zawiesiny  bakterii  (100  μl)  dodać  do  niej  1  μl  plazmidowego  DNA  (1  -  50 
ng/μl), całość delikatnie zamieszać poprzez stukanie palcem w probówkę. 
 
4. Bakterie z dodanym pDNA inkubować przez 20 min. w lodzie, co kilka minut mieszając j.w. 
 
5. Probówki z bakteriami i pDNA zanurzyć na 1 min. w łaźni wodnej o temp. 42°C. 
 
6. Probówki przełożyć do lodu na 2 min., po czym do każdej dodać 1 ml bulionu LB. 
 
7. Probówki inkubować przez 1 h w 37°C zapewniając przy tym mieszanie zawiesiny bakterii. 
 
8. 100 μl zawiesiny bakterii wysiać na szalkę z agarem LB i ampicyliną. 
 
9. Szalki inkubować przez noc w temp. 37°C. Po pojawieniu się kolonii bakterii szalki przełożyć 
do lodówki. 
 
 
Pożywki i roztwory 
 
 
bulion LB (1 litr) – Bacto-tryptone 10 g, ekstrakt drożdżowy 5 g, NaCl 10 g 
 
agar LB – bulion LB z dodatkiem 1,5 % agaru 
 
ampicylina – 50 mg/ml