Podstawy
genomiki strukturalnej
Wykład z biologii
molekularnej nr 2 i
1. Informacje wstępne
-omiki – dziedziny biologii molekularnej rozpatrujące kompleksowe działanie określonego typu cząsteczek w komórce np. :
Genomika jest narzędziem do
poznania zmienności organizmu. Zajmuje się poznaniem sekwencji
materiału genetycznego , mapowaniem genomu , zależnościami i
interakcjami materiału genetycznego.
Wyróżniamy genomikę :
Strukturalną ( sekwencjonowanie i opis materiału genetycznego )
Funkcjonalną ( opis funkcji wszystkich genów )
Teoretyczną ( opis wszystkich praw rządzących materiałem genetycznym )
Porównawczą ( zajmuje się ewolucją genomu )
Indywidualnych różnic ( zmienność genetyczna między osobnikami )
2.DNA
DNA
jest biopolimerem deoksyrbonukleotydów. Jest cząsteczką liniową ,
nierozgałęzioną. Nukleotyd zbudowany jest z jednej z czterech
zasad azotowych , 5- węglowego węgla ( β-D-2-deoksyrybozy ) oraz
grupy fosforanowej. Zasada azotowa wraz z cukrem tworzą nukleozyd.
Pomiędzy zasadą azotową a cukrem tworzy się wiązanie
β-n-glikozydowe, natomiast pomiędzy pentozą a resztą fosforanową
wiązanie fosfodiestrowe.
3.Genom
ludzki
Składa się z ok. 30 tys. genów ,
które koduje ok. 400 tys. białek. Obala to tym samym teorię , iż
jeden gen koduje jedno białko. Powodem takiego stanu rzeczy są :
-
alternatywny splicing
-redagowanie RNA
-modyfikacje
potranskrypcyjne
4.Alternatywny splicing :
intron1------
ekson1------ intron2------- ekson2-------intron3------- ekson3
wycięcie intronów
ekson1------ekson2------- ekson3 lub ekson2------
ekson1-----ekson3 it
Decydują o tym białka regulatorowe.
Pozwala to na otrzymanie z jednego genu całego zestawu
funkcjonalnych białek.
5.Redagowanie
RNA
To zmiana , usunięcie lub dodanie pojedynczych
nukleotydów do łańcucha. Przykładem może być apolipoproteina B.
Z jednego genu w wątrobie powstaje apolipoproteina B100 natomiast w
jelicie cienkim w wyniku redagowania powstaje apolipoproteina B48.
Dochodzi tam do zmiany kodonu kodującego glicynę a kodon
terminacyjny UAA. Apo B100 i apo B48 moją odmienne funkcje.
6. Pozyskiwanie materiału genetycznego do badań
a) Pobieranie materiału :
Źródłem materiału do badań genetycznych mogą być :
Limfocyty z krwi obwodowej
Hodowle fibroblastów skóry
Komórki nabłonka
Cebulki włosowe
Komórki szpiku kostnego
Fragmenty dowolnej tkanki ( guzy , bioptaty, wycinki )
Dowolny materiał biologiczny ( surowica , mocz, kał, płyny z jam ciała )
1 lub 2 blastomery pobrane z 8-komórkowego zarodka
Komórki płynu owodniowego
Erytroblasty płodu obecne we krwi matki
komórki trofoblastu
Zasady pobierania materiału genetycznego z różnych materiałów :
Krew:
pobieramy 1ml krwi pełnej w sposób jałowy
dodajemy koagulant EDTA ( stężenie końcowe 0,1 % ) lub cytrynian sodu
nie należy używać heparyny która hamuje aktywność polimerazy DNA już w stężeniu 0,05 IU/ mieszaninę reakcyjną oraz inhibituje niektóre enzymy restrykcyjne
DNA izoluje się w dniu pobrania lub po odpowiednim zabezpieczeniu
Przechowywanie : do 48 h w temp 4 oC , powyżej 48 h w temp -20oC lub – 80oC
Szpik kostny :
Pobieramy 1-5 ml szpiku
Dodajemy EDTA lub cytrynian sodu
Transport do 24h w temperaturze 4oC
Guzy , biotaty, wycinki :
Natychmiastowa homogenizacja i izolacja
Pobranie do sterylnych probówek i natychmiastowe zamrożenie w -20oC lub – 80oC
Umieszczenie pobranych tkanek w buforze do lizy i zamrożenie
Materiał suchy :
Przechowywać w kopertach w temperaturze pokojowej
Materiał biologiczny możemy
przechowywać w postaci zamrożonych tkanek , lizatu umieszczonego w
buforze ( bufor 100mM Tris- HCl, 40 mM EDTA, 0,2 % SDS, pH 8.0),
wyizolowanego preparatu DNA
Wydajność izolacji oraz jakość
DNA obniżają się wraz z czasem przechowywania materiału
b) Izolacja DNA
Celem izolacji
DNA jest uzyskanie DNA o wysokiej jakości i czystości. W wyniku
wielu procesów otrzymujemy DNA biologicznie aktywne , stabilne
chemicznie oraz wolne od RNA i białek .
DNA może ulegać
uszkodzeniom mechanicznym dlatego w trakcie oczyszczania go przemywa
się buforami stabilizującymi .
Dezintegrację i lizę Komorek
można przeprowadzic na kilka sposobów :
Homogenizacja ( miękkie tkanki zwierzęce )
sonifikacja – działanie ultradźwiękami ( zawiesina komórek )
rozcieranie ( komórki roślinne, bakteryjne )
liza detergentami ( komórki z hodowli )
liza enzymatyczna ( komórki bakterii , drożdży)
Po uwolnieniu DNA i innych
komponentów dodajemy roztwór soli NaCl z Tris-HCl i EDTA.
Tris-HCl
utrzymuje stałe lekko zasadowe pH roztworu co zmniejsza
oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi
białkami.
EDTA wiąże jony Cd2+, Mg 2+,
Mn 2+ które mogłyby tworzyć sole z aminowymi grupami
fosforanowymi DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz
Kolejnym etapem jest oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałości innych substancji :
dysocjacja kompleksów DNA-białko za pomocą soli sodowej siarczanu dodycelu SDS, który wiąże się z białkami nadając im Ilnie anionowy charakter
denaturacja deoksyrybonukleaz i innych białek za pomocą soli NaCl oraz NaClO4 w wysokim stężeniu.
Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych substancji
Całkowite odbiałczanie roztworu następuje po dodaniu do roztworu mieszaniny fenolu, chloroformu oraz alkoholu izoamylowego oraz odwirowaniu. Po odwirowaniu tworzą się nam 3 warstwy : górna faza wodna w której znajdują się kwasy nukleinowe , dolna warstwa to faza organiczna natomiast na granicy tych 2 faz znajduje się wąskie pasmo denaturowanego białka . Chloroform doprowadza do powierzchownej denaturacji białek , alkohol stabilizuje granice faz
Zagęszczenie preparatu DNA dodając alkohol etylowy lub izopropylowy, który zmniejsza rozpuszczalność DNA. DNA tworzy nitkowate osady które można zebrać . Po wytrąceniu przemyć 70 % etanolem i wysuszyć a następnie przechowywać w buforze TE w temp 4oC lub -20oC
Przedstawiona wyżej metoda to metoda chloroformowo- fenolowa
Istnieją również komercyjne zestawy do oczyszczania kwasów nukleinowych tzw, izolacja na kolumnach. Kolumny do izolacji DNA i RNA oparte na złożach krzemionkowych wiążących DNA i RNA w obecności soli choatropowych ( chlorowodorek guanidyny ) powodujących rozpad błon komórkowych i denaturacje białek. Metoda ta obejmuje :
Przygotowanie wstępne czyli homogenizację tkanek w buforze zawierającym stężone sol e
Nałożenie preparatu na mikrokolumny ( roztwór przepływa przez membranę zawierajacą złoże krzemionkowe w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce . Kzremionka wyłapuje selektywnie kwasy nukleinowe. Pozostała część roztworu zostaje przelana do zlewki a my zajmujemy się tylko złożem kolumny ). Preparat możemy nałożyć również na duże kolumny , tam jednak przepływ odbywa się nie za pomocą wirówek a grawitacyjnie.
Przepłukanie DNA roztworem soli lub buforem z etanolem w celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń
Wymywanie kwasów z kolumny wodą lub buforem TE, całość wirujemy , to co przechodzi przez kolumnę i znajdzie się w probówce odbierającej to nasze DNA
Zaletami
komercyjnej metody pozyskiwania DNA jest krótki czas izolacji,
lepsza wydajność i czystość , brak kontaktu ze szkodliwymi
substancjami , wysoka powtarzalność wyników
c) Ocena czystości , stężenia oraz jakości DNA
Ocena czystości :
wykorzystuje
spektrofotometrię absorpcyjną , która mierzy pochłanianie
promieniowania przez
badaną substancję w celu jej
identyfikacji
Absorbalność fali :
Λmax
dla DNA = 260nm
Λmax dla białka = 280 nm
Badamy zależność:
Która dla czystego DNA powinna wynosić 1,8- 2,0. Wartość poniżej 1,8 świadczy o zanieczyszczeniu białkami
d) Amplifikacja – powielenie fragmentu DNA
Uzyskany w wyniku izolacji DNA
możemy powielić. Powielamy fragment genu który nas interesuje w
celu potwierdzenia jego obecności lub w celu wykrycia zmiany w
obrębie genu .
W 1983 została opracowana metoda PCR –
reakcja łańcuchowa polimerazy , która umożliwia powielenie w
ciągu 2-3 h określonego odcinka DNA w milionach kopii.
Substratami
w reakcji PCR są : matryce DNA, enzymy , startery , dNTP, Mg2+,
bufor, wzmacniacz reakcji.
Enzymy :
Helikaza-
rozplatająca podwójną nić DNA
Topoizomeraza- znosi
naprężenia w rozplatanych niciach
Białka wiążące
jednoniciowe DNA SSB – zapobiegające połączeniu się nici
Polimeraza DNA
Polimeraza RNA – rozpoczyna replikację
ligaza- skleja fragmenty okazaki powstałe na nici opóźnione
a takrze fragmenty powstałe po usunięciu starterów.
Startery i matryca :
Należy
znać przynajmniej częściowo sekwencję nukleotydów obu końców
powielanego fragmentu aby dobrać odpowiednio polimerazę i
startery.
Matryca powstaje podczas termicznej denaturacji
dwuniciowego DNA w czasie którego pękają wiązania
wodorowe
Startery zapewniają specyficzność reakcji , ich
optymalne stężenie 0,1-0,5 µM, ich nadmiar powoduje powstawanie
niespecyficznych produktów reakcji i tworzenie się dimerów
starterów
Polimeraza DNA:
-
Zużywająca się podczas reakcja nie stabilna termicznie polimeraza
pobierana od E.coli lub
-Termostablina polimeraza Taq z
bakterii Termophilius aquaticus
dNTP-
deoksyrybonukleozydotrifosforany
roztwór podstawowy dNTP
10mM, optymalne stężenie w mieszaninie PCR to 200 µM dla każdego
dNTP
nierówne ilości dNTP obniżają wydajność amplifikacji
Mg2+
Wpływają
na aktywność polimerazy DNA, optymalne stężenie MgCl2
to 1,5-2,0 mM, zbyt wysokie doprowadzi do powstania niespecyficznych
produktów reakcji , zbyt niskie do obniżenia wydajności.
Wzmacniacze reakcji:
-to
termo stabilne białka SSB stabilizujące rozplatane nici DNA,
-zwiększają wydajność amplifikacji ,
-skracają cza
elongacji
- białko TaqSSB wykorzystywane w PCR multiplex (
reakcja z użyciem wielu par starterów )zapobiega powstawaniu
drugorzędowych struktur pomiędzy starterami i zwiększa efektywność
procesu
Na koniec w probówce na 20µl
roztworu mamy :
10-100 ng matrycy
1µM starterów
200µM
każdego dNTP
1,5- 2,0 mM MgCl2
1- 2 jednostek
polimerazy
Etapy reakcji PCR :
-termiczna
denaturacja dwuniciowego DNA
-hybrydyzacja czyli łączenie
starterów z matrycą
-elongacja ( wydłużanie łańcucha DNA
)
Proces
ten powtórzony zostaje ok. 25 – 40 razy po czym całość
inkubowana jest ok. 10 min w temperaturze 72 oC. Liczba
cykli nie może przekroczyć 40 ponieważ prowadzi to do powstania
niespecyficznych produktów , za mało cykli zmniejsza wydajność
procesu.
y = (2n-2n) x gdzie :
y – liczba powstających fragmentów DNA
n – liczba
cykli
x- początkowa liczba matryc dwuniciowych
Do reakcji PCR wystarczają
pikogramowe ilości DNA. Zaletą tego procesu jest możliwość
użycia DNA w znacznym stopniu zdegradowanego pod warunkiem że
degradacja nie obejmuje amplifikowanych sekwencji.
PCR
przeprowadza się w mikroprobówkach a proces amplifikacji w
termocyklerze.
Czynniki wpływające na efektywność PCR:
Temperatura
Liczba cykli
Czas trwania cykli
Aktywność enzymów
Jakość enzymów i buforu reakcyjnego
Stężenie dNTP i Mg2+
Długość starterów i ich stężenie
Objętość próbki reakcyjnej
ilość i czystość DNA
typ termocyklera
Niewielka zmiana 1 czynnika ma wpływ , do najbardziej czułych parametrów należą stężenie dNTP i Mg2+, aktywność polimerazy Taq oraz zmiana profili temperaturowych cykli a szczególnie zmiana temperatury dołączania starterów
Wydajność PCR :
W
wyniku tego proce ecu uzyskujemy 0,2-2 µg co wystarcza do
uwidocznienia produktu na żelu , analizy mutacji i polimorfizmów a
także sekwencjonowania. .
Odmiany techniki PCR :
wewnętrzna ( gniazdowa ) PCR
/ nested PCR
wykorzystuje 2 pary starterów wewnętrzne i
zewnętrzne co zwiększa specyficzność a także czułość
reakcji. Stosowany w celach diagnostycznych.
Multipex PCR
Polega na
jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów Dna różniących się
wielkością przy użyciu kilku par starterów w jedne mieszaninie
reakcyjnej lub jednoczesnej amplifikacji kilku regionów jednego lub
kilku genów.
W PCR multiplex fragmenty powinny różnić się
wielkością.
Metoda to obniża koszty i czas procesu ,
zmniejsza ryzyko kontaminacji . Służy do wykrywania czynników
zakaźnych , mutacji oraz diagnostyki chorób uwarunkowanych
genetycznie
Zastosowanie PCR :
Powielenie fragmentu genu przed dalsza analizą
Znalezienie mutacji w genie
Diagnostyka chorób infekcyjnych i inwazyjnych przez znalezienie fragmentu genu czynnika chorobotwórczego
Pozwala na wykorzystywanie bardzo starych i niewielkich śladów materiału biologicznego np. w kryminalistyce
e) detekcja produktu amplifikacji
Elektroforeza
Czyli
rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie
jednorodne frakcje przez wymuszenie wędrówki ich cząsteczek w
polu elektrycznym . Ruchliwość cząsteczek w żelu jest wprost
proporcjonalna do ładunku cząsteczki oraz przyłożonego napięcia
oraz odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki , zależy
również od jej kształtu. Elektroforeza może odbywać się w żelu
agarozowym .Jest to frakcja agaru uzyskiwana z krasnorostów ,
występuje w postaci białego lub żółtawego proszku , bardzo łatwo
rozpuszcza się w gotującej się wodzie i pozostaje w stanie płynnym
do temperatury 40 o C poniżej tej temperatury zestala się
w postaci porowatego żelu. Rozmiary powstałych porów zależą od
stężenia im większe tym bogatsze usieciowanie. Zwykle stosuje się
żel o stężeniu 0,4- 4,0 %. Zaletą żelu agarozowego jest łatwość
i szybkość przygotowania oraz możliwość separacji dużych
makromolekuł np. DNA i RNA. Ich wadę stanowi słaba wytrzymałość
mechaniczna żeli więc wyniki elektroforezy przechowuje się w
postaci zdjęć.
Elektroforeza w żelu agarozowym odbywa się
w aparatach ustawionych poziomo a rozdział elektroforetyczny
prowadzony jest w buforze kwasu borowego .
W środowisku o pH
obojętnym lub lekko alkalicznym DNA naniesione na żel przy katodzie
przemieszcza się w polu elektrycznym w kierunku anody.
Szybkość
przemieszczania się cząsteczek jest prawie niezależna od sekwencji
i składu zasad. Decyduje o tym jednak różnica w konformacji
przestrzennej cząstek.
Do uwidocznienia DNA w polu stosuje się
bromek etydyny ( EtBr). Pod wpływem promieniowania UV λ= 312 nm
fluoryzuje w kolorze różowo- pomarańczowym . intensywność ok.
20- krotnie po połączeniu z DNA gdzy cząsteczki EtBr wsuwają się
między zasady.
f) Wykrywanie mutacji lub polimorfizmów
Polimorfizm – wielopostaciowość
genów. Zmiana w materiale genetycznym występująca u więcej niż 1
% populacji
Mutacja - zmiana w materiale genetycznym
występująca u mniej niż 1 % populacji
Wykrywanie mutacji odbywa się za pomocą dwóch metod SSCP lub RFLR