Podstawy genomiki strukturalnej

Podstawy genomiki strukturalnej
Wykład z biologii molekularnej nr 2 i

1. Informacje wstępne

-omiki – dziedziny biologii molekularnej rozpatrujące kompleksowe działanie określonego typu cząsteczek w komórce np. :

Genomika jest narzędziem do poznania zmienności organizmu. Zajmuje się poznaniem sekwencji materiału genetycznego , mapowaniem genomu , zależnościami i interakcjami materiału genetycznego.
Wyróżniamy genomikę :



2.DNA
DNA jest biopolimerem deoksyrbonukleotydów. Jest cząsteczką liniową , nierozgałęzioną. Nukleotyd zbudowany jest z jednej z czterech zasad azotowych , 5- węglowego węgla ( β-D-2-deoksyrybozy ) oraz grupy fosforanowej. Zasada azotowa wraz z cukrem tworzą nukleozyd. Pomiędzy zasadą azotową a cukrem tworzy się wiązanie β-n-glikozydowe, natomiast pomiędzy pentozą a resztą fosforanową wiązanie fosfodiestrowe.



3.Genom ludzki
Składa się z ok. 30 tys. genów , które koduje ok. 400 tys. białek. Obala to tym samym teorię , iż jeden gen koduje jedno białko. Powodem takiego stanu rzeczy są :
- alternatywny splicing
-redagowanie RNA
-modyfikacje potranskrypcyjne









4.Alternatywny splicing :


intron1------ ekson1------ intron2------- ekson2-------intron3------- ekson3




wycięcie intronów


ekson1------ekson2------- ekson3 lub ekson2------ ekson1-----ekson3 it
Decydują o tym białka regulatorowe.
Pozwala to na otrzymanie z jednego genu całego zestawu funkcjonalnych białek.

5.Redagowanie RNA
To zmiana , usunięcie lub dodanie pojedynczych nukleotydów do łańcucha. Przykładem może być apolipoproteina B. Z jednego genu w wątrobie powstaje apolipoproteina B100 natomiast w jelicie cienkim w wyniku redagowania powstaje apolipoproteina B48. Dochodzi tam do zmiany kodonu kodującego glicynę a kodon terminacyjny UAA. Apo B100 i apo B48 moją odmienne funkcje.

6. Pozyskiwanie materiału genetycznego do badań

a) Pobieranie materiału :

Źródłem materiału do badań genetycznych mogą być :

Zasady pobierania materiału genetycznego z różnych materiałów :

Krew:

Szpik kostny :

Guzy , biotaty, wycinki :

Materiał suchy :

Materiał biologiczny możemy przechowywać w postaci zamrożonych tkanek , lizatu umieszczonego w buforze ( bufor 100mM Tris- HCl, 40 mM EDTA, 0,2 % SDS, pH 8.0), wyizolowanego preparatu DNA
Wydajność izolacji oraz jakość DNA obniżają się wraz z czasem przechowywania materiału



b) Izolacja DNA

Celem izolacji DNA jest uzyskanie DNA o wysokiej jakości i czystości. W wyniku wielu procesów otrzymujemy DNA biologicznie aktywne , stabilne chemicznie oraz wolne od RNA i białek .
DNA może ulegać uszkodzeniom mechanicznym dlatego w trakcie oczyszczania go przemywa się buforami stabilizującymi .
Dezintegrację i lizę Komorek można przeprowadzic na kilka sposobów :


Po uwolnieniu DNA i innych komponentów dodajemy roztwór soli NaCl z Tris-HCl i EDTA.
Tris-HCl utrzymuje stałe lekko zasadowe pH roztworu co zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi białkami.
EDTA wiąże jony Cd2+, Mg 2+, Mn 2+ które mogłyby tworzyć sole z aminowymi grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz

Kolejnym etapem jest oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałości innych substancji :

Całkowite odbiałczanie roztworu następuje po dodaniu do roztworu mieszaniny fenolu, chloroformu oraz alkoholu izoamylowego oraz odwirowaniu. Po odwirowaniu tworzą się nam 3 warstwy : górna faza wodna w której znajdują się kwasy nukleinowe , dolna warstwa to faza organiczna natomiast na granicy tych 2 faz znajduje się wąskie pasmo denaturowanego białka . Chloroform doprowadza do powierzchownej denaturacji białek , alkohol stabilizuje granice faz

Przedstawiona wyżej metoda to metoda chloroformowo- fenolowa

Istnieją również komercyjne zestawy do oczyszczania kwasów nukleinowych tzw, izolacja na kolumnach. Kolumny do izolacji DNA i RNA oparte na złożach krzemionkowych wiążących DNA i RNA w obecności soli choatropowych ( chlorowodorek guanidyny ) powodujących rozpad błon komórkowych i denaturacje białek. Metoda ta obejmuje :


Zaletami komercyjnej metody pozyskiwania DNA jest krótki czas izolacji, lepsza wydajność i czystość , brak kontaktu ze szkodliwymi substancjami , wysoka powtarzalność wyników

c) Ocena czystości , stężenia oraz jakości DNA

Ocena czystości :
wykorzystuje spektrofotometrię absorpcyjną , która mierzy pochłanianie promieniowania przez
badaną substancję w celu jej identyfikacji

Absorbalność fali :
Λmax dla DNA = 260nm
Λmax dla białka = 280 nm




Badamy zależność:

Która dla czystego DNA powinna wynosić 1,8- 2,0. Wartość poniżej 1,8 świadczy o zanieczyszczeniu białkami





d) Amplifikacja – powielenie fragmentu DNA

Uzyskany w wyniku izolacji DNA możemy powielić. Powielamy fragment genu który nas interesuje w celu potwierdzenia jego obecności lub w celu wykrycia zmiany w obrębie genu .
W 1983 została opracowana metoda PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy , która umożliwia powielenie w ciągu 2-3 h określonego odcinka DNA w milionach kopii.
Substratami w reakcji PCR są : matryce DNA, enzymy , startery , dNTP, Mg2+, bufor, wzmacniacz reakcji.

Enzymy :
Helikaza- rozplatająca podwójną nić DNA
Topoizomeraza- znosi naprężenia w rozplatanych niciach
Białka wiążące jednoniciowe DNA SSB – zapobiegające połączeniu się nici
Polimeraza DNA
Polimeraza RNA – rozpoczyna replikację
ligaza- skleja fragmenty okazaki powstałe na nici opóźnione a takrze fragmenty powstałe po usunięciu starterów.

Startery i matryca :
Należy znać przynajmniej częściowo sekwencję nukleotydów obu końców powielanego fragmentu aby dobrać odpowiednio polimerazę i startery.
Matryca powstaje podczas termicznej denaturacji dwuniciowego DNA w czasie którego pękają wiązania wodorowe
Startery zapewniają specyficzność reakcji , ich optymalne stężenie 0,1-0,5 µM, ich nadmiar powoduje powstawanie niespecyficznych produktów reakcji i tworzenie się dimerów starterów

Polimeraza DNA:
- Zużywająca się podczas reakcja nie stabilna termicznie polimeraza pobierana od E.coli lub
-Termostablina polimeraza Taq z bakterii Termophilius aquaticus

dNTP- deoksyrybonukleozydotrifosforany
roztwór podstawowy dNTP 10mM, optymalne stężenie w mieszaninie PCR to 200 µM dla każdego dNTP
nierówne ilości dNTP obniżają wydajność amplifikacji

Mg2+
Wpływają na aktywność polimerazy DNA, optymalne stężenie MgCl2 to 1,5-2,0 mM, zbyt wysokie doprowadzi do powstania niespecyficznych produktów reakcji , zbyt niskie do obniżenia wydajności.

Wzmacniacze reakcji:
-to termo stabilne białka SSB stabilizujące rozplatane nici DNA,
-zwiększają wydajność amplifikacji ,
-skracają cza elongacji
- białko TaqSSB wykorzystywane w PCR multiplex ( reakcja z użyciem wielu par starterów )zapobiega powstawaniu drugorzędowych struktur pomiędzy starterami i zwiększa efektywność procesu


Na koniec w probówce na 20µl roztworu mamy :
10-100 ng matrycy
1µM starterów
200µM każdego dNTP
1,5- 2,0 mM MgCl2
1- 2 jednostek polimerazy

Etapy reakcji PCR :
-
termiczna denaturacja dwuniciowego DNA
-hybrydyzacja czyli łączenie starterów z matrycą
-elongacja ( wydłużanie łańcucha DNA )




Proces ten powtórzony zostaje ok. 25 – 40 razy po czym całość inkubowana jest ok. 10 min w temperaturze 72 oC. Liczba cykli nie może przekroczyć 40 ponieważ prowadzi to do powstania niespecyficznych produktów , za mało cykli zmniejsza wydajność procesu.





y = (2n-2n) x gdzie :
y – liczba powstających fragmentów DNA
n – liczba cykli
x- początkowa liczba matryc dwuniciowych

Do reakcji PCR wystarczają pikogramowe ilości DNA. Zaletą tego procesu jest możliwość użycia DNA w znacznym stopniu zdegradowanego pod warunkiem że degradacja nie obejmuje amplifikowanych sekwencji.
PCR przeprowadza się w mikroprobówkach a proces amplifikacji w termocyklerze.

Czynniki wpływające na efektywność PCR:

Niewielka zmiana 1 czynnika ma wpływ , do najbardziej czułych parametrów należą stężenie dNTP i Mg2+, aktywność polimerazy Taq oraz zmiana profili temperaturowych cykli a szczególnie zmiana temperatury dołączania starterów

Wydajność PCR :
W wyniku tego proce ecu uzyskujemy 0,2-2 µg co wystarcza do uwidocznienia produktu na żelu , analizy mutacji i polimorfizmów a także sekwencjonowania. .

Odmiany techniki PCR :

Polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów Dna różniących się wielkością przy użyciu kilku par starterów w jedne mieszaninie reakcyjnej lub jednoczesnej amplifikacji kilku regionów jednego lub kilku genów.
W PCR multiplex fragmenty powinny różnić się wielkością.
Metoda to obniża koszty i czas procesu , zmniejsza ryzyko kontaminacji . Służy do wykrywania czynników zakaźnych , mutacji oraz diagnostyki chorób uwarunkowanych genetycznie

Zastosowanie PCR :



e) detekcja produktu amplifikacji

Elektroforeza
Czyli rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszenie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym . Ruchliwość cząsteczek w żelu jest wprost proporcjonalna do ładunku cząsteczki oraz przyłożonego napięcia oraz odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki , zależy również od jej kształtu. Elektroforeza może odbywać się w żelu agarozowym .Jest to frakcja agaru uzyskiwana z krasnorostów , występuje w postaci białego lub żółtawego proszku , bardzo łatwo rozpuszcza się w gotującej się wodzie i pozostaje w stanie płynnym do temperatury 40 o C poniżej tej temperatury zestala się w postaci porowatego żelu. Rozmiary powstałych porów zależą od stężenia im większe tym bogatsze usieciowanie. Zwykle stosuje się żel o stężeniu 0,4- 4,0 %. Zaletą żelu agarozowego jest łatwość i szybkość przygotowania oraz możliwość separacji dużych makromolekuł np. DNA i RNA. Ich wadę stanowi słaba wytrzymałość mechaniczna żeli więc wyniki elektroforezy przechowuje się w postaci zdjęć.
Elektroforeza w żelu agarozowym odbywa się w aparatach ustawionych poziomo a rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze kwasu borowego .
W środowisku o pH obojętnym lub lekko alkalicznym DNA naniesione na żel przy katodzie przemieszcza się w polu elektrycznym w kierunku anody.
Szybkość przemieszczania się cząsteczek jest prawie niezależna od sekwencji i składu zasad. Decyduje o tym jednak różnica w konformacji przestrzennej cząstek.
Do uwidocznienia DNA w polu stosuje się bromek etydyny ( EtBr). Pod wpływem promieniowania UV λ= 312 nm fluoryzuje w kolorze różowo- pomarańczowym . intensywność ok. 20- krotnie po połączeniu z DNA gdzy cząsteczki EtBr wsuwają się między zasady.



f) Wykrywanie mutacji lub polimorfizmów

Polimorfizm – wielopostaciowość genów. Zmiana w materiale genetycznym występująca u więcej niż 1 % populacji
Mutacja - zmiana w materiale genetycznym występująca u mniej niż 1 % populacji

Wykrywanie mutacji odbywa się za pomocą dwóch metod SSCP lub RFLR














Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Podstawy genomiki strukturalnej wykład I z 3 10
Podstawy genomiki strukturalnej wykład I z 3 10
Parlament Europejski, Ekonomia UWr WPAIE 2010-2013, Semestr V, Podstawy prawa i struktury organizacy
podstawy zarządzania STRUKTURA ORGANIZACYJNA
ITIL Podstawy W1 Struktura standardu ITIL
Podstawowe elementy struktury gospodarki rynkowej rynek
Komórka jako podstawowa jednostka strukturalna i funkcjonalna organizmu, Ratownictwo Medyczne(1), bi
Uniwersytet Wrocławski skrót PUE, Ekonomia UWr WPAIE 2010-2013, Semestr V, Podstawy prawa i struktur
Neuron jako podstawowa jednostka strukturalna, AWF KATOWICE, FIZJOLOGIA
PODSTAWOWY ZAKRES STRUKTUR GRAMATYCZNYCH
Rada Unii Europejskiej, Ekonomia UWr WPAIE 2010-2013, Semestr V, Podstawy prawa i struktury organiza
Komórka jako podstawowa jednostka strukturalna i funkcjonalna organizmu 3, Matura
Podstawowe elementy strukturalne gospodarki rynkowej – towar
METALOZNAWCZE PODSTAWY KSZTALTOWANIA STRUKTURY I WLASCIWOSCI BLACH ZE STALI DP W PROCESIE CIAGLEGO W
Podstawy analizy strukturalnej Nieznany
tariov,podstawy transmicji?nych,Struktura i praca systemu transmisyjnego
Podstawowe elementy struktury gospodarki rynkowej pieniądz
PODSTAWOWE MODELE STRUKTUR RYNKOWYCH OD STRONY PODAŻY
METALOZNAWCZE PODSTAWY KSZTALTOWANIA STRUKTURY I WLASCIWOSCI BLACH ZE STALI DP W PROCESIE CIAGLEGO W

więcej podobnych podstron