Untitled

Kultury in vitro roślin

Wyposażenie laboratorium

Kultury in vitro

4. Trochę historii

Totipotencja - jest to zdolność komórek zachowujących w organizmie dojrzałym charakter embrionalny do różnicowania się w różnego rodzaju komórki wyspecjalizowane w zależności od potrzeb organizmu albo też zdolność komórek dojrzałego organizmu do odróżnicowania się.

Trochę historii

1839 rok - Schwan i Schleiden sformułowali teorię totipotencji komórek roślinnych, czyli zdolności odtwarzania całej rośliny z pojedynczej komórki.

Trochę historii

Myśl tę podjął Gottlieb Haberlandt, austriacki botanik, którego zwykle uważa się za właściwego "ojca" roślinnych hodowli tkankowych.
W 1898 r założył hodowle komórek izolowanych z miękiszu palisadowego, skórki i włosków epidermalnych kilku roślin (jasnoty purpurowej - Lamium purpureum i hiacynta wodnego - Eichornia crassipes, śniedka - Ornithogalum, miodunki - Pullmonaria mollissima).

Trochę historii

Inkubował je na pożywce Knopa wzbogaconej sacharozą, asparaginą i peptonem.
Obserwował wydłużanie się komórek palisadowych, zmiany ich kształtu, grubienie ścian komórkowych, pojawianie się skrobi w chloroplastach.
Komórki pozostawały żywe przez kilka miesięcy, nie udało się jednak Haberlandtowi zmusić ich do podziałów.
Wyniki tych pionierskich doświadczeń były więc niezbyt zachęcające, mimo to niezrażony badacz sformułował kilka hipotez - niezwykle śmiałych, inspirujących, a z dzisiejszej perspektywy wręcz proroczych.

Trochę historii

Gottlieb Haberlandt zakładał że:
izolowane komórki roślinne można będzie kiedyś utrzymywać w czystych hodowlach przez dowolnie długi czas;
nawet komórki somatyczne (niegeneratywne) można będzie pobudzić do tworzenia zarodków i odtwarzania całych roślin;
substancje pobudzające podziały zostaną otrzymane z tkanek merystematycznych i rozrodczych;
hodowle komórkowe staną się ważnym narzędziem w badaniach rozwoju roślin.

Trochę historii

Minęło sporo lat zanim zdołano doświadczalnie wykazać słuszność wszystkich tych założeń Gottlieba Haberlandta.
Do 1939 r otrzymano stale rosnące, wieloletnie hodowle roślinnych komórek i korzeni.
Prowadzono też hodowle in vitro niedojrzałych zarodków.
Ogromny postęp w roślinnych kulturach in vitro nastąpił po drugiej wojnie światowej, w dużej mierze dzięki wyizolowaniu i scharakteryzowaniu fitohormonów.

Trochę historii

Wtedy też stało się możliwe doświadczalne zademonstrowanie totipotencji pojedynczych komórek somatycznych, tj. ich zdolności do odtworzenia całego organizmu.
Ta nadzwyczajna właściwość komórek, świadczy o tym, że każda (w zasadzie) komórka zawiera pełną informację genetyczną niezbędną do działania całego wielokomórkowego organizmu. Wykorzystuje się to praktycznie w metodach masowego rozmnażania roślin.

Trochę historii

1902 rok - doświadczenia Haberlandta na izolowanych fragmentach roślin (włoski) i ich próba utrzymania przy życiu bez pozytywnych rezultatów.
1922 rok - badania Knudsona nad asymbiotycznym kiełkowaniem nasion storczyków w kulturach in vitro.

Trochę historii

1929 rok - hodowla zarodków lnu jako metoda ominięcia problemów wynikających z międzygatunkowego krzyżowania (Laibach)
1934 rok - badania Whitea nad wzrostem korzeni pomidora w kulturach in vitro (pożywka zawierała glukozę i wyciąg z drożdży, eksplantaty przeszczepiano co pewien okres czasu utrzymując je w hodowli).
1939 rok - badania Whitea, Gauthereta i Nobecourta na kulturach kalusa. Udało się utrzymać przy życiu ciągle rosnącą, niezorganizowaną masę komórek. Zastosowano auksynę w pożywce.

Trochę historii

1941 rok - zastosowanie przez van Overbecka mleka kokosowego w pożywkach do hodowli Datura
1946 rok - eksperymenty Balla na łubinie i nasturcji, w których po raz pierwszy udało się przeprowadzić regenerację całych roślin z wierzchołków pędów w kulturach in vitro.
1948 rok - badania Skooga i Tsui nad ustaleniem odpowiedniego stosunku auksyn do adeniny co pozwoliło na ukształtowanie pędu i korzenia z kalusa tytoniu.
1950 rok - otrzymanie przez Balla organów w kulturach kalusa Sequoia sempervirens.
1952 rok - otrzymanie przez Morela i Martina bezwirusowych dalii z kultur merystemów wierzchołkowych

Trochę historii

1954 rok - eksperymenty Muira i współpracowników, w których udało się zregenerować roślinę z pojedynczej komórki.
1957 rok - badania Skooga i Millera nad kinetyną i jej rolą w procesach formowania pędu i korzenia w zależności od jej stosunku do auksyn.
1958 rok - uzyskanie przez Stewarda prazarodków w kulturach zawiesinowych kalusa
1959 roku - pierwszy podręcznik o kulturach in vitro tkanek roślinnych Gauthereta.

Trochę historii

1960 rok - opracowanie prze Morela metody otrzymywania storczyków z kultur merystemów
1965 rok - indukowanie kwitnienia w kulturach in vitro tytoniu pochodzącego z wycinków kwiatów (Aghion- Pratt).
1966 rok - pierwsza roślina haploidalna otrzymana z ziaren pyłku (Guka i Mekeswari).
1967 rok - Pierik indukuje zawiązywanie kwiatów w kalusie Lunaria annua (miesiącznica roczna) po przetrzymywaniu roślin macierzystych w niskiej temperaturze a Bourgin i Nitsch otrzymują haploidalne rośliny z ziarn pyłku.
1969 rok - pierwsza izolacja protoplastów z kultur zawiesinowych (Erikson i Jonassek).
1970 rok - pierwsza fuzja dwóch protoplastów przeprowadzona przez Powera i innych.
1972 rok - krzyżowanie międzygatunkowe w wyniku fuzji protoplastów przeprowadzone przez Carlsona.

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych.

Powinno ono się składać z następujących części:
A) Pożywkarnia
B) Pokój wagowy
C) Myjnia
D) Komora do szczepień
E) Pokój lub komora hodowlana.

Schemat rozmieszczenia pomieszczeń

Wyposażenie laboratorium kultur in vitro

1. Pożywkarnia
2. Pokój zaplecza technicznego i wagowy
3. Myjnia
4. Pokój szczepień
5. Pokój hodowlany
6. Pokój hodowlany
7. Szklarnia
8. Tunel foliowy lub szklarnia

Wyposażenie pracowni kultur tkankowych

Pożywkarnia
miejsce gdzie przygotowuje się pożywki i naczynia.

Pożywkarnia

Pożywkarnia - jest to miejsce, gdzie przygotowuje się pożywki i naczynia.
Potrzebne są więc tutaj duże stoły , szafki z półkami na szkło laboratoryjne, szufladami na korki, kapsle, watę, narzędzia , recepturki, i inne drobne przedmioty.
Na stole powinien być ustawiony pHmetr , mieszadło magnetyczne, łaźnia wodna i maszynka elektryczna.
W tym pomieszczeniu powinna być także ustawiona lodówka w której przechowuje się odczynniki chemiczne, wymagające obniżonej temperatury oraz roztwory macierzyste do pożywek.

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

Pokój wagowy - miejsce gdzie powinna się znajdować dokładna waga laboratoryjna na stabilnym stole.

Pokój wagowy.

Pokój wagowy - obok pożywkarni powinien się znajdować pokój wagowy.
Ważenie poszczególnych substancji wymaga dużej dokładności i powinno odbywać się w cichym , nie narażonym na wstrząsy pomieszczeniu.
Jeżeli brak jest odrębnego pokoju wagi można ustawić w pożywkarni w najbardziej stabilnym miejscu, gdzie nie ma wahań temperatury i przeciągów.

Pokój wagowy.

Waga laboratoryjna i waga techniczna powinny być ustawione na stole wagowym lub na innym stabilnym wypoziomowanym blacie.
Obok powinno być miejsce na odstawianie odczynników i naczyń, które po skończonym ważeniu chowa się do podręcznej szafki, lodówki lub eksykatora zgodnie z instrukcją na opakowaniu.
W pomieszczeniu tym można także ustawić pHmetr.

Pokój wagowy

Wagi

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

Myjnia - miejsce gdzie odbywa się składowanie i mycie wykorzystanego szkła laboratoryjnego.

Myjnia

Myjnia - powinno się tu odbywać mycie szkła laboratoryjnego i likwidacja niepotrzebnych kultur.
Tu może być także zlokalizowany autoklaw - urządzenie służące do sterylizacji pożywek pod ciśnieniem w parze o odpowiedniej temperaturze.
Obok zlewu z jednej strony powinno być miejsce na brudne naczynia i szkło a drugiej strony powinna być umocowana tablica z kołkami do ociekania lub stół ociekowy.
Jeżeli pomieszczenie to jest dostatecznie duże powinna być tutaj także suszarka z wyłącznikiem czasowym co usprawnia pracę ponieważ można ją wykorzystywać wtedy po godzinach pracy.

Myjnia

Można wyposażyć myjnie w maszynę do zmywania naczyń lub myjnię laboratoryjną.
Można wtedy zaprogramować mycie w zależności od stopnia zabrudzenia i uzyskiwać pożądany stopień ich czystości po umyciu.
Dobrze jest jednak najpierw ręcznie umyć szkło w zlewach lub miednicach a dopiero potem włożyć do maszyny do zmywania.

Myjnia

Zakażone kultury najlepiej wysterylizować przed otwarciem naczyń aby nie rozsiewać mikroorganizmów w laboratorium a więc po raz kolejny niezbędny jest autoklaw.
Przestrzeganie czystości jest niezbędnym warunkiem przy pracy z kulturami in vitro.
Tu może być także zlokalizowana destylarka.
Woda destylowana jest niezbędna do przygotowania pożywek i innych roztworów a także do płukania szkła laboratoryjnego.
Niektórzy zalecają także użycie dejonizatora wody.
Do przechowywania wody destylowanej powinny służyć specjalne , czyste, zamykane pojemniki.

Zmywarki

Sterylizacja

Sterylizacja to proces technologiczny polegający na zniszczeniu wszystkich, zarówno wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych form mikroorganizmów.
Prawidłowo wysterylizowany materiał jest jałowy - nie zawiera żadnych żywych drobnoustrojów oraz ich form przetrwalnikowych czy toksyn.
Jedynie kontrolowany i powtarzalny proces sterylizacji jest procesem bezpiecznym.

Sterylizacja

Sterylizacja w autoklawach jest zalecana przez wszystkie organy służby zdrowia, w tym przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) oraz Centrum Kontroli Chorób (CDS-USA).
Polega ona na poddaniu materiałów wysokiej temperaturze pary wodnej o wysokim ciśnieniu w określonym czasie.
Istnieją ustalone wartości tych parametrów, odpowiednie dla danego rodzaju narzędzi / materiałów.
Zwykle stosuje się cykle o następujących minimalnych wartościach: 134^oC przy ciśnieniu 2 bar w czasie 4 min. oraz 121^oC przy 1,2 bar w czasie 15 minut.

Sterylizacja

Norma Europejska EN 13060 dzieli autoklawy na trzy klasy sterylizacyjne:
"B" - z frakcyjną próżnią wstępną , czyli kilkukrotnym odpompowaniem powietrza z komory autoklawu do wartości ciśnienia ok. -0,85 bar (względem atmosferycznego) i wtłoczeniem pary wodnej oraz z próżnią końcową zalecane przy sterylizacji materiałów porowatych, z zagłębieniami i pakietowanych.
"S" - z jednorazową próżnią wstępną polegającą na wytworzeniu na chwilę przed cyklem podciśnienia o wartości -0,7 bar;
"N" - autoklawy bez próżni lub bez suszenia.

Autoklaw

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

Komora do szczepień - jest to komora w której powietrze przepływa przez filtr, oczyszcza się z drobnoustrojów i jest kierowane w stronę osoby pracującej.
Może to być miejsce wyjałowione lampami bakteriobójczymi.

Komora do szczepień

Komora do szczepień. - komora do szczepień z laminarnym przepływem sterylnego powietrza jest urządzeniem dość drogim ale niezbędnym przy tego typu pracach.
Powietrze oczyszcza się z zarodników, bakterii i pyłów przepływając przez system filtrów po czym jest kierowane w stronę osoby pracującej w komorze.
W takiej komorze łatwiej jest zachować warunki aseptyczne.
Przed przystąpieniem do pracy należy dokładnie spryskać komorę, jej blat i narzędzia 70% etanolem.

Komora do szczepień

Następnie narzędzia płucze się w wodzie destylowanej i osusza między złożonymi arkuszami bibuły.
Również po każdym wszczepieniu należy odkazić narzędzia przetrzeć blat stołu.
Narzędzia podczas pracy należy opalać nad palnikiem gazowym lub spirytusowym albo sterylizować w specjalnym opiekaczu.
Także osoba przystępująca do pracy w komorze powinna wysterylizować ręce do łokci alkoholem, zmienić wierzchnie odzienie na czyste , założyć rękawiczki lateksowe ewentualnie zakryć usta maseczką.

Komora do szczepień

Jeżeli do pracy potrzebny jest mikroskop stereoskopowy to powinny obok niego stać zlewki z alkoholem i sterylna wodą oraz arkusze bibuły do osuszań.
Sterylność zakładanych kultur zależy w dużej mierze od osoby pracującej w komorze do szczepień.
Spokojne ruchy, szybkie wykonywanie wszystkich zabiegów i unikanie zbytniego nachylania się nad blatem komory chroni kultury przed zakażeniem.
Opalenie brzegów probówek i naczyń hodowlanych podobnie jak w pracy mikrobiologicznej zwiększa prawdopodobieństwo zachowania jałowych warunków podczas pracy.
W pracach związanych z przygotowaniem pożywki a następnie wszczepianiem eksplantatów na pożywkę przydatne są różne narzędzia typu pincety, skalpele, nożyczki, łopatki, łyżeczki.
Skompletowanie i wykorzystanie tych narzędzi zależy od inwencji twórczej samego pracownika.

Komora laminarna

Narzędzia w komorze

Praca narzędziami

Komory do szczepień

Komora do szczepień

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

Pokój lub komora hodowlana - jest to miejsce z urządzeniami klimatyzacyjnymi zapewniające odpowiednie warunki wzrostu eksplantatów w kulturach in vitro.

Pokój lub komora hodowlana

Pokój lub komora hodowlana. - jest to miejsce w którym dzięki urządzeniom klimatyzacyjnym zapewnione są odpowiednie warunki wzrostu eksplantatów w kulturach in vitro.
Dzięki wprowadzeniu sterowania czasem oświetlenia, temperaturą i wilgotnością zapewnione są optymalne warunki do wzrostu i rozwoju eksplantatów.
Sposób zainstalowania oświetlenia wpływa istotnie na równomierność natężenia światła na całych półkach.
Oświetlenie jest realizowane za pomocą świetlówek o odpowiednim spektrum światła.

Pokój lub komora hodowlana

Do prowadzenia niektórych kultur in vitro należy zainstalować wytrząsarki lub rotory.
Chodzi o tego typu kultury gdzie mamy do czynienia z pożywką ciekłą, która musi być mieszana w trakcie wzrostu kultur.
Przy prowadzeniu kultur w warunkach sterylnych później ich likwidacji ważny jest także sposób zamykania probówek lub pojemników z pożywką .
Można do tego celu stosować termoodporne kapsle, które można wyjaławiać w autoklawie, korki z waty, parafiom, folię plastikową lub aluminiową.
W przypadku folii plastykowej i parafilmu wadą jest to , że nie wytrzymują one wysokich temperatur.

Pokój hodowlany

Kultura in vitro Prunus

Kultura in vitro Amarylisa

Kultura in vitro buraka

Kultura in vitro cebuli

Kultura in vitro kaktusa

Kultura in vitro pomidora

Kultury in vitro tulipana

Kultura in vitro ziemniaka

Kultury in vitro w pokoju hodowlanym na wstrząsarkach

Kultury in vitro ziemniaka na regale hodowlanym

Bioreaktory

Bioreaktor
Jest to urządzenie do prowadzenia kultury żywych komórek w warunkach kontrolowanych zarówno pod względem wartości parametrów technologicznych procesu jak i jego sterylności.

Jak funkcjonują bioreaktor

Zasada działania bioreaktora
zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórkom somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko - chemicznych.

Bioreaktory

Głównym zadaniem bioreaktora jest stworzenie możliwie najlepszego kontaktu i transferu masy między komórkami roślinnymi a fazą abiotyczną.
Fazę abiotyczną stanowią: pożywka, nośnik i gazy.

Kontrolowanie parametrów bioreaktora

Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry:
dozowanie świeżej pożywki,
kontrola ilości namnażanych komórek,
temperatura (z dokładnością do 0,1◦C),
szybkość rotacji pożywki (przemieszczania się suspensji w bioreaktorze) zwykle 50 rpm, ponizej komórki sedymentuja i zamierają,
pH - sygnał aktywowania pompy perystaltycznej wtłaczającej sterylny roztwór kwasu lub zasady,
poziom tlenu regulowany drogą dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki (poziom tlenu mierzy elektroda tlenowa),
potencjał redox,
stężenie CO2

Bioreaktory

Wyposażenie techniczne typowego bioreaktora obejmuje następujące elementy:
1. naczynie hodowlane
2. układ mieszania
3. układ napowietrzania
4. układ chłodzenia
5. urządzenie do gaszenia piany
6. urządzenie do pobierania prób
7. urządzenia pomiarowo-kontrolne.

Bioreaktory

Każdy bioreaktor pracuje w otoczeniu urządzeń towarzyszących obejmujących tzw. linie:
1. przygotowania pożywki
2. przygotowania powietrza
3. wyprowadzania inokulum
4. wydzielania i oczyszczania produktów.

Bioreaktory

Mieszanie pożywek ciekłych w bioreaktorze odbywa się jednym z trzech wymienionych niżej sposobów:
1. mieszanie mechaniczne z użyciem mieszadła
2. mieszanie pneumatyczne z wykorzystaniem strumienia gazu
3. mieszania hydrauliczne z wykorzystaniem strumienia cieczy
Wybór rodzaju mieszadła zależy od wielkości bioreaktora, gęstości pożywki, wrażliwości obiektów na niszczenie mechaniczne i wymagań tlenowych.

Bioreaktory - podział

Podział bioreaktorów ze względu na system napowietrzania pożywki:
bioreaktory zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry,
bioreaktory w których powietrze jest wtłaczane często pod
ciśnieniem poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urządzenia,
bioreaktory ze zwykłym napowietrzaniem,
bioreaktory z dodatkowymi kolumnami (bąbelkowe napowietrzanie),
bioreaktory napowietrzane poprzez systemy sylikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i mikropory,
bioreaktory z równomiernym rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania zawartości pożywki,
bioreaktory z podświetlanymi przewodami rozprowadzającymi tlen

Problemy w bioreaktorze

Problemy związane z powiększaniem skali kultur
- przygotowanie inokultur
- metoda inkubacji, transfer do bioreaktora i odbiór namnożonego
materiału
- stres mechaniczny związany z mieszaniem pożywki
- wprowadzenie światła do bioreaktora
- problem zachowania podobieństw o charakterze fizycznym i biologicznym

Somatyczna embriogeneza w bioreaktorze na przykładzie poinsencji

Modelowy system indukowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorze - na przykładzie poinsecji (Gwiazda betlejemska- Euphorbia pucherina).
Etapy:
* Faza proembriogenna (inicjacja embriogenezy)
* Kultury w bioreaktorach
*Konwersja embrionów w rośliny

Somatyczna embriogeneza w bioreaktorze na przykładzie poinsencji

* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)
-kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie.
Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce
-pasażowanie- po kolejnych 3 tygodniach agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego
-pozyskiwanie inokulum wyjściowego - po 2 tygodniach szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora

Somatyczna embriogeneza w bioreaktorze na przykładzie poinsencji

* Kultury w bioreaktorach - pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne).
Zarodki stopniowo osiągają stadium globuli i dalej stadium serca.
Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową

Somatyczna embriogeneza w bioreaktorze na przykładzie poinsencji

Konwersja embrionów w rośliny
-zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn- MS
+0,05 mg BAP
-po 3 tygodniach normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących
-prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tygodniach zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji
-po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi się do szklarni (przeżywalność około 90 %)

Somatyczna embriogeneza w bioreaktorze na przykładzie poinsencji

Efektywność stymulowania embriogenezy somatycznej w
bioreaktorach dla poinsecji.
Wydajność- teoretycznie można otrzymać 100 tysięcy zarodków z 1 litra suspensji w czasie około 3 miesięcy

Kultura in vitro Modrzewia (Larix Mill.)

Bioreaktory

Co jeszcze możemy wykonać w ramach kultur in vitro?

1. Organogeneza
2. Embriogeneza
3. Somatyczna embriogeneza
4. Sztuczne nasiona
5. Haploidy i dihaploidy
6. Zapylenie in vitro
7. Krioprezerwacja

Organogeneza

Organogeneza [gr. órganon `narząd', génesis `powstawanie'], jest to tworzenie się organów, u roślin z merystematycznych zawiązków (merystemy) oraz tworzenie się i rozwój narządów zwierząt w czasie rozwoju zarodkowego i larwalnego; zachodzi w wyniku stopniowego różnicowania się i przegrupowania komórek i tkanek.
Organogeneza in vitro może być:
bezpośrednia - jeśli na fragmencie rośliny umieszczonym w pożywce tworzą się korzenie, pędy i zarodki,
pośrednia - jeśli poprzedza ją powstanie kalusa, w którym tworzą się następnie centra komórek merystematycznych.

Organogeneza bezpośrednia i pośrednia

Embriogeneza roślin

Embriogeneza to proces w którym z zapłodnionej komórki jajowej w wyniku kolejnych podziałów powstaje zarodek, z którego rozwija się osobnik dorosły.
Podczas tego procesu ekspresji ulega wiele genów, jednak tak naprawdę wciąż nie wiadomo, ile z nich działa specyficznie w rozwoju zarodka.

Somatyczna embriogeneza

Embriogeneza somatyczna jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych.
Przebiega on w warunkach in vitro i jest forma rozmnażania wegetatywnego.
Zarodki somatyczne są to struktury o wyraźnej biegunowości, która w wyniku ich dalszego rozwoju odpowiada polaryzacji pęd-korzeń.
Stosowana powszechnie w warunkach in vitro metoda pobudzania do rozwoju pąków pachwinowych lub indukcji pąków przybyszowych polega na namnażaniu pąków i pędów, czyli struktur jednobiegunowych.

Zarodki somatyczne

Somatyczna embriogeneza

Embriogeneza somatyczna jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych.
Przebiega on w warunkach in vitro i jest forma rozmnażania wegetatywnego.
Odtworzenie korzeni przybyszowych zachodzi w kolejnym etapie rozmnażania klonalnego w laboratorium lub w mnożarkach szklarniowych.
Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z wykształconym jednym liścieniem (u jednoliściennych) lub dwoma liścieniami (u dwuliściennych, a także epikotylem i korzonkiem zarodkowym).
Embriogeneza somatyczna, może znaleźć istotne zastosowanie w szkółkarstwie i nasiennictwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania.

Sztuczne nasiona

Sztuczne nasiona
Sztuczne nasiona jest to produkt nowoczesnej biotechnologii służące kontrolowanemu rozmnażaniu i przechowywaniu.
Wykorzystuje się w tym procesie somatyczną embriogenezę czyli proces wytwarzania somatycznych zarodków z komórek wegetatywnych.
Somatyczne zarodki nie posiadają materiałów zapasowych w formie endospermu oraz okrywy nasiennej.
Dlatego też somatyczne zarodki wyposaża się w sztuczny endosperm zawierający białka i lipidy, fungicydy ewentualnie bakterie Rhizobium oraz syntetyczną okrywę zabezpieczająca przed mechanicznymi uszkodzeniami i regulującą rehydratacje.
Istnieje możliwość produkcji zarodków somatycznych na skalę laboratoryjną a następnie ich dedykację i przechowywanie

Sztuczne nasiona

Wytwarzanie sztucznych nasion:
-pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia
-otoczkowanie zarodków poddane desykacji
-uwodnione zarodki (merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z
żelu
- uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu

Sztuczne nasiona

Otoczkowanie nasion ma na celu:
-unieruchomienie fragmentu tkanki
-zminimalizowanie funkcji życiowych
-ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska
-ochrona przed utlenieniem i desykacją (odwodnienie)
-ochrona przed uszkodzeniem mechanicznym podczas siewu i transportu
-wprowadzenie regulatorów, mikroflory, pestycydów
- możliwość wprowadzenia do otoczek hydrofilnych dodatkowych otoczek hydrofobowych

Sztuczne nasiona

Etapy wytwarzania sztucznych nasion:
-roślina macierzysta
-eksplantat
-indukcja i proliferacja kalusa embriogennego
-namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej.
-synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków.
-filtrowanie
-suszenie
-otoczkowanie
-wysiew nasion in-vivo lub in-vitro

Sztuczne nasiona

Rodzaje hydrożeli:
-otoczki polisocharydowe-najważniejsze ze wszystkich
-organiczne żele (poliakryloamidowe)
-żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy)

Sztuczne nasiona

Pochodzenie chemiczne wiązań żelifikujących.
-żele powstają poprzez krzyżowe wiązanie jonowe odpowiednio naładowanych polimerów np. alginian, chitozan, karaginian
-żele powstałe z zimnej lub gorącej polimeryzacji (agar, agaroza,
karaginian).
-żele powstałe drogą chemicznej reakcji (poliakrylamian, formaldehyd).

Sztuczne nasiona

Otoczki agarowe
Agar- polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków czerwonych wodorostów
Procedura pozyskiwania:
- 2-4% agar rozpuszcza się w soli fizjologicznej w temperaturze 100^oC, a następnie schładza do 50^oC
- dodaje się materiał roślinny (zarodki lub merystemy) zawieszone w soli fizjologicznej
- po zestaleniu tnie się żel lub otacza fazą hydrofobową np. olejem
- można ciepły agar wraz z komórkami wkraplać do oleju silikonowego lub sojowego, umieścić na mieszadle magnetycznym i po stężeniu oddziela się kuleczki (zawierające materiał roślinny)
droga wirowania

Sztuczne nasiona

Otoczki agarozowe
Agaroza- naturalny czynnik żelifikujący otrzymany z agaru pozbawionego grup estrowo-siarczanowych
Procedura pozyskiwania:
-agaroza 2-4% w temperaturze 35^oC dobrze się rozpuszcza a jednocześnie żelifikuje
-przygotowany już roztwór wraz z komórkami dodajemy wkraplając do oleju roślinnego umieszczonego na mieszadle, całość oziębiamy i wirujemy

Sztuczne nasiona

Otoczki alginianowe
* Alginiany otrzymywane są z olbrzymich brązowych alg morskich Macrocystis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową.
Otrzymywany kwas alginianowy składa się z jednostki M (kwas manuroniowy) oraz jednostki G (kwas gulurioniowy)
* Kiedy jony Na+ zastąpimy jonami dwuwartościowymi np. Ca2+ ,Ba2+ , Si2+, Zn2+ lub Al3+ tworzy się sieć polimerowa pomiędzy jonami.
Powstają wiązania krzyżowe pomiędzy grupami karboksylowymi, a molekułami polisacharodowymi.
Proces jest termo niezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń.

Sztuczne nasiona

Procedura pozyskania
-suspensje komórek miesza się w temperaturze pokojowej ze sterylnym roztworem alginianu sodu 2-3%
-następnie mieszaninę tę wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl₂)
-perełki o określonej średnicy (0,5-5 mm) utwardzają się przez kilkanaście minut do kilku godzin
- powleka się je dodatkową warstwą hydrofobową
- na etapie kiełkowania zarodków, otoczki rozpuszcza się w EDTA lub buforze cytrynianowym ( fosforanowym )

Sztuczne nasiona

Kiełkowanie i konwersja
Kiełkowanie- zdolność do formowania korzonka zarodkowego
Konwersja- równoczesny rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu, z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego gatunku

Sztuczne nasiona

Otoczki karaginianowe
Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigartina.
Procedura pozyskiwania
- 2-5% roztwór karaginianu ogrzewa się do temp. 45°C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensją komórek
- następnie wkrapla się zawiesinę w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca)
perełki (2-4 mm) otrzymuje się w KCl przez 1-5 godzin.

Sztuczne nasiona

Inne
-celuloza i jej pochodne
-chitozan
-żelifikujące gumy
-pektyny
-podwójne otoczkowanie np. alginiany/ pektyniany, karaginian/
chitozan lub algininian/ chitozan
-najnowsze otoczki hydrofobowe
-Tulanox, Elwox
-Bio- kapsuły (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego
imitujące okrywę nasienną z kutikulą.

Sztuczne nasiona

Efektywność maszyny do otoczkowania
-500 000 sztucznych nasion o średnicy 80 ul dziennie
maszyna otoczkuje zarodki somatyczne: pomidorów, bawełny, petunii,
ogórka, sałaty, papryki, tytoniu, melona, zbóż.
-Stopień konwersji 8-90% i zależy od gatunku rośliny i warunków kiełkowania.
W warunkach polowych dla sztucznych nasion Lucerna siewna (Medicago sativa), Seler zwyczajny (Apium graveolens), czy Daucus carota (marchew) wynosi 50-80%

Sztuczne nasiona

Problemy technologii sztucznych nasion
-indukcja zarodków somatycznych (dodatek różnych substancji m. in. aminokwasów)
-faza dojrzewania zarodków i konwersji
-problem O2
-wysychanie otoczek
-stopniowe uwodnienie nasion!
-koszty produkcji
próby tworzenia Bio- kapsuł
Ze względu na fazę wdrożeniową na dzień dzisiejszy namnaża się przez sztuczne nasiona: hybrydy ryżu, geranium, europejskie odm. ogórka , gerberę, kawę, lucernę.

Sztuczne nasiona

Potencjalne korzyści
-szybkie namnażanie pożądanej linii
-gwarancja genetycznej jednorodności roślin
-bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby
-dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów, takich
jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej
-dostarczenie sterylnych linii
-redukcja kosztów związanych z wegetatywnym namnażaniem linii elitarnych
-możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z komórek poddanych inżynierii genetycznej

Haploidy i dihaploidy

Haploidy i dihaploidy
Od ponad trzydziestu lat haploidy oraz linie podwojonych haploidów (ang. doubled haploids, DH) są znane i wykorzystywane w hodowli roślin oraz w badaniach genetycznych.
Wykorzystanie stadium haploidalnego umożliwia w ciągu jednego pokolenia uzyskać linie całkowicie homozygotyczne z heterozygotycznego materiału, w wyniku czego skraca się znacznie cykl hodowlany.
Szybkie otrzymanie linii o dużej homozygotyczności ma wielkie znaczenie dla roślin obcopylnych, u których w wielu przypadkach samozapylenie i homozygotyzacja są bardzo utrudnione ze względu na mechanizm samoniezgodności oraz depresję wsobną.
Poprzez kultury in vitro wieloletni chów wsobny można zastąpić wyprowadzaniem linii DH.
Przyspieszenie cyklu hodowlanego w ten sposób może dawać niebagatelne oszczędności.

Haploidy i dihaploidy

Haploidy i dihaploidy
Aby wyprowadzanie linii DH było efektywne, ważne jest opracowanie stabilnych i prostych metod umożliwiających produkcję haploidów, a następnie podwojonych haploidów.
Haploidy otrzymuje się na drodze indukowanej gynogenezy, czyli z niezapłodnionych zalążków lub metodą androgenezy (z pylników), co jest metodą znacznie prostszą i mniej kosztowną.
Następnym ważnym etapem jest regeneracja haploidów z niezapłodnionych zalążków, poliploidyzacja ich poprzez kolchicynę i namnażanie podwojonych haploidów.
Wykorzystanie tej metody w pracach hodowlanych jest limitowane przez skuteczność wyprowadzania haploidów w kulturach in vitro.

Zapylenie

Zapylanie
Zapylenie - jest to zjawisko występujące u roślin kwiatowych, polegające na przeniesieniu ziarna pyłku na znamię słupka. Kwiaty posiadają specjalne przystosowania do tego celu. Znamiona ich słupków są kleiste, a pyłek jest zwykle bardzo niewielkich rozmiarów.
Rodzaje zapylenia
samozapylenie (autogamia) - gdy pyłek pochodzi z tego samego kwiatu, lub innego kwiatu, ale tej samej rośliny
Zapylenie krzyżowe (ksenogamia, allogamia) - gdy pyłek pochodzi z kwiatu innej rośliny (tego samego gatunku)

Zapylenie w kulturach in vitro

Zapylanie
Samoniezgodność albo samosterylność jest to niezdolność roślin do samozapłodnienia, do wydania nasion w wyniku samozapylenia, występuje u wielu roślin okrytozalążkowych;
Najbardziej skuteczną barierą, chroniącą kwiaty przed samozapyleniem jest genetyczna niezgodność pyłku i słupka powodująca, że pyłek nie kiełkuje na znamionach słupków tej samej rośliny (lub rośliny genetycznie podobnej) lub też wzrost łagiewek pyłkowych zostaje wcześnie zahamowany.
Ominąć możemy barierę samoniezgodności występujące w znamieniu i szyjce słupka stosując zapylenie in vitro.
Pozwala to także na otrzymywanie w pełni wykształconych zarodków i w konsekwencji w pełni wykształconych roślin z oddalonych krzyżówek.
Do zapylenia w warunkach in vitro wykorzystuje się pojedyncze izolowane zalążki lub rzadziej zalążki wszczepione z łożyskiem i częścią zalążni wraz z okwiatem.

Banki genów