Techniki kultur in vitro

Zastosowanie:

cele praktyczne:

-masowe rozmnożenie roślin,

-hodowla roślin:

--otrzymywanie roślin haploidalnych i linii DH,

--indukowanie zmienności somaklonalnej i tworzenie materiałów wyjściowych dla hodowli,

--selekcja genetypów odpornych na stresy biotyczne i abiotyczne,

--otrzymywanie mieszańców miedzygatunkowych przy występowaniu barier pre i postzygotycznych,

--zapłodnienia in vitro,

--transformacji genetycznej,

-pozyskiwanie cennych metabolitów (surowce do produkcji leków i kosmetyków),

cele naukowe:

-badania podstawowe (genetyka, fizjologia, biochemia, biologia molekularna).

KULTURY IN VITRO

Kultury organów, tkanek, pojedynczych komórek na sztucznych podłożach (płynnych lub zestalonych agarem), w naczyniach szklanych, przy zachowaniu pełnej sterylności w ściśle kontrolowanych warunkach świetlnych i termicznych.

Totipotencja

• Zdolność każdej komórki do odtworzenia całej rośliny, wynikająca z posiadania pełnej informacji genetycznej.

Kultury in vitro pozwalają na:

• nieograniczone w czasie prowadzenie doświadczeń

• ścisłą kontrolę warunków prowadzenia kultury

• a obiekty wyizolowane z rośliny macierzystej są pozbawione działania jakichkolwiek czynników korelacyjnych

Przygotowanie materiału roślinnego:

• zdrowotność materiału roślinnego

• termin pobierania fragmentu rośliny (istotne dla gatunków przechodzących okres spoczynku)

• wiek rośliny matecznej

• jej stan fizjologiczny (optymalne warunki wzrostu)

Wybór fragmentu roślin:

• Najczęściej :

- tkanki młode np. merystematyczne - genetycznie wyrównane

merystemy wierzchołkowe - produkcja roślin wolnych od patogenów

- cebule i bulwy (duża zdolność do regeneracji)

- szypułki kwiatostanowe

- kwiatostany (Asteraceae zawierają liczne merystemy)

- fragmenty liści

• Rzadziej używa się części podziemnych - trudności w odkażaniu

Pożywka

skład zależy od gatunku rośliny, rodzaju eksplantatu, szybkości wzrostu i indukcji organów

White (1943) Chu (1978) - N6

Murashige and Skooga (1962) - MS Gamborg (1968) - B5

Linsmaier and Skooga (1965) - LS Nitch and Nitsch (1969) - NN

SUBSTANCJE MINERALNE

• makroelementy (N, S, P, K, Na, Mg, Ca, Fe)

• mikroelementy (B, Cu, Mn, Mo, Zn, Co, I, Al, Ni, Ti)

SUBSTANCJE ORGANICZNE

• witaminy (tiamina /wit. B1/, kwas nikotynowy /wit. PP/, pirydoksyna /wit. B6/, biotyna /wit. H/, kwas: foliowy, askorbinowy, pantotenowy)

• aminokwasy (glicyna, glutamina, hydrolizat kazeiny)

• regulatory wzrostu auksyny (cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy (ABA), etylen, poliamidy, jasmonidy, brasinosteroidy)

• cukry

• substancje zestalające

Makroelementy

AZOT - podst. składnik białek, enzymów, aminokwasów, kw. nukleinowych

do pożywek w formie nieorganicznej (azotanowej i amonowej)

organicznej (aminokwasy, białka)

SIARKA - w skład aminokwasów, białek, witamin H, B1

do pożywek w formie siarczanów

FOSFOR - w cukrach, kw. nukleinowych, do pożywek fosforan amonu lub wapnia

POTAS - w syntezie białek i przemianach cukrowców (aktywator wielu enzymów), w

procesie fotosyntezy, do pożywek azotany, chlorki, fosforany

SÓD - uczestniczy w utrzymaniu ciśnienia osmotycznego, do pożywek molibdenian sodu

MAGNEZ - w chloroplastach, rybosomach, mitochondriach, udział w fotosyntezie i oddychaniu, aktywuje wiele enzymów, do pożywek siarczan magnezu

WAPŃ - do budowy ścian komórkowych i transportu substancji wzrostowych, utrzymuje prawidłową strukturę błon cytoplazmatycznych, do pożywek chlorek wapnia

ŻELAZO - w mitochondriach i chloroplastach, w procesach oksydacyjno-redukcyjnych, do pożywek związki chelatowe:

kompleks żelaza z kw. etylenodwuaminoczterooctowym (FeEDTA) lub

sól sodowo-żelazowa tego kwasu (NaFeEDTA)

Mikroelementy

BOR -w budowie ścian komórkowych, w metaboliźmie kwasów nukleinowych, w przemianach węglowodanów i ich transporcie, do pożywek kwas borowy

MIEDŹ - w wielu enzymach, w fotosyntezie i przemianach tłuszczowców, do pożywek siarczan miedzi

MANGAN - aktywator wielu reakcji, udział w fotolizie wody, utrzymanie równowagi oksydacyjno-redukcyjnej, do pożywek siarczan manganowy

MOLIBDEN - w przemianach azotu, w syntezie kwasu askorbinowego, w metaboliźmie zw. fosforowych, do pożywek sole molibdenianowe

CYNK - we wszystkich strukturach komórkowych, udział w syntezie IAA, w metaboliźmie białkowym i oddychaniu, do pożywek siarczan cynku

Skład pożywki uzupełnia się śladowymi ilościami:

KOBALT - w skład wit. B12, udział w procesach metabolicznych (w wiązaniu azotu), do pożywek chlorek kobaltu

JOD - aktywator enzymów, do pożywek jodek w jodku potasu

GLIN - wpływa na pęcznienie cytoplazmy i aktywność enzymów w cytoplaźmie,

do pożywek chlorek glinu

NIKIEL i TYTAN - udział w oddychaniu, do pożywek chlorek niklu i siarczan tytanu

Witaminy

tiamina (wit.B1) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3

pirydoksyna (wit.B6) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3

biotyna (wit.H) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3

kwas nikotynowy (wit.PP) 0,5 - 1,0 mg ·dm-3

kwas foliowy 0,01- 0,1 mg ·dm-3

kwas askorbinowy (wit.C) 1,0 - 100 mg ·dm-3

kwas pantotenowy (wit.B5) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3

Aminokwasy

dodatek wpływa korzystnie na rozwój roślin, zwłaszcza kultur zarodków

cysteina, glicyna, glutamina, histydyna, prolina

Regulatory wzrostu

grupa związków organicznych działających stymulująco lub hamująco na procesy wzrostu i rozwoju roślin

AUKSYNY

syntetyzowane w merystemach wierzchołkowych pędu i korzenia, hamują rozwój pąków bocznych (zjawisko dominacji wierzchołkowej)

• W kulturach in vitro indukują:

• wzrost wydłużeniowy komórek i organów

• regeneracja brakujących organów

• tworzenie zawiązków korzeni

• namnażanie tkanki kalusowej

• Najczęściej stosowane auksyny:

• naturalne: IAA kwas indolilo-3-octowy

IBA kwas indolilo-3-masłowy

PAA kwas fenylooctowy

- syntetyczne: NAA kwas naftylo-1-octowy

2,4-D kwas 2,4—3,6-dichlorobenzoesowy

Picloram kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolinowy

Dicamba kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy

0,001- 10,0 mg·dm-3

CYTOKININY

• W kulturach in vitro:

• indukują podziały i różnicowanie się komórek

syntetyzowane głównie w korzeniach, transportowane do części nadziemnych

• indukują tworzenie pąków bocznych (zmniejszanie dominacjiwierzchołkowej)

• hamują ukorzenianie

• Najczęściej stosowane cytokininy:

• naturalne: Zea zeatyna

2iP 6(ၧ,ၧ-dimetyloalliloamino)puryna

• syntetyczne K kinetyna

BA (BAP) benzyloaminopuryna

BPA tetrahydropiranylobenzyloadenina

TDZ tidiazuron

0,1 - 40,0 mg·dm-3

GIBERELINY

tworzą się w młodych liściach i pędach, kwiatach i kiełkujących zarodkach

• W kulturach in vitro

- stymulują wydłużanie i podziały komórkowe

- hamują wzrost pąków bocznych (stymulują wzrost pąka głównego)

- przyspieszają kwitnienie i przerywają spoczynek

Do pożywek: GA3 kwas giberelinowy

• niski stosunek auksyn do cytokinin stymuluje namnażanie pędów :

• przybyszowych

• wierzchołkowych

• wysoki stosunek auksyn do cytokinin stymuluje:

• ukorzenianie pędów

• embriogenezę

• inicjację tkanki kalusowej

POLIAMINY

wpływają na tworzenie się zarodków somatycznych, korzeni przybyszowych, pędów

JASMONIDY

hamują embriogenezę, powstanie kalusa

BRASINOSTEROIDY

stymulują wzrost i wydłużanie się komórek, przyspieszają starzenie się komórek w zamierających hodowlach tkankowych

KWAS ABSCYSYNOWY ABA

- hamuje tworzenie elementów drewna i łyka oraz przedwczesne kiełkowanie zarodków

ETYLEN

- hamuje wzrost, przyspiesza dojrzewanie nasion

Cukry

• są głównym źródłem węgla i energii, wpływają na potencjał osmotyczny komórki

• sacharoza 10 - 30 g · dm-3

• glukoza, 30 - 40 g · dm-3

• inozytol - alkoholowa pochodna cukrów prostych 100 - 500 mg · dm-3

Inne składniki

• Węgiel aktywowany - absorbuje substancje aktywne i inhibitory

Substancje zestalające

• Agar - polisacharyd zbud. z galaktozy, składnik ścian kom. niektórych glonów

0,6 - 1 %, przy pH <4,5 płynny

• Phytogel, Gelrite - polimery z bakterii

WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNE I FIZYCZNE POŻYWKI

Kwasowość

- wpływa na dostępność i pobieranie składników

pH 5,5 - 6,0 ustala się przed dodaniem agaru i przed autoklawowaniem

Stopień zestalenia pożywki

- zależy od gatunku, rodzaju i stadium rozwoju eksplantatu

pożywki płynne, półpłynne i stałe

Warunki sterylne

- wolne od form wegetatywnych i przetrwalnikowych mikroorganizmów patogenicznych (grzybów, bakterii, wirusów).

Sterylizacja

procedura gwarantująca zabicie wszystkich żyjących organizmów, łącznie z endosporami i wirusami

• Ogrzewanie płomieniem

• Sterylizacja gorącym powietrzem

• Sterylizacja gorącą parą wodną (autoklaw - 121ႰC, 1 atm., 20 min.)

• Sterylizacja promieniami jonizującymi (ၢ, ၧ, X)

• Sterylizacja przez filtrację (filtr membranowy z octanu celulozy, poliwęglanu)

• Sterylizacja z użyciem zw. chemicznych - w specjalistycznych instytucjach - tlenek etylenu rozcieńczony azotem lub węglem, aldehyd glutarowy, nadtlenek wodoru

Dezynfekcja

procedura inaktywacji, zniszczenia lub usunięcia potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów (nie niszczy endospor bakteryjnych)

• Środki chemiczne bakteriobójcze lub bakteriostatyczne

fenol, chlor, podchloryny (niszczą endospory)

Sposoby sterylizacji lub dezynfekcji

• laboratorium in vitro:

• 70% alkohol etylowy (blaty)

• handlowe środki bakterio- i grzybobójcze (podłogi)

• lampy UV (komory z laminarnym przepływem powietrza)

• szkła i instrumentów:

• autoklaw

• suszarki (temp. 130-170 ႰC / 2-4 godz.)

• 70% alkohol etylowy + opalanie w płomieniu

• promienie jonizujące (szalki, strzykawki)

• pożywek:

• autoklaw

• sterylne filtry

Odkażanie materiału roślinnego

• wybór odczynnika dezynfekującego, jego stężenie i czas działania zależą od wrażliwości tkanek odkażanego eksplantatu oraz od stopnia porażenia przez drobnoustroje

Etapy odkażania:

1. Oczyścić eksplantat z obumarłych części, wosku, włosków itp.

2. Zanurzyć w 70% alkoholu etylowym (30 sek.)

3. Umieścić w środku odkażającym z dodatkiem Tween20, Ludwik -

lepiej wydłużać czas odkażania niż zwiększać stężenie

4. Trzykrotne płukanie w sterylnej, destylowanej wodzie (po 5 min.)

Środki stosowane do odkażania materiału roślinnego:

-alkohol etylowy, chloramina, nadtlenek wodoru, podchloryn sodu, wapnia, woda bromowa, preparaty handlowe (ACE, DOMESTOS)

Kontrolowane warunki prowadzenia kultury

Temperatura: 18-28ºC, Światło: 30-70 µM m^-2 s^-1, Fotoperiod dobowy: 16+8 h (dzień+noc)

Wyposażenie laboratorium in vitro

• PRZYGOTOWALNIA POŻYWEK

WAGI, MIESZADŁA, PHMETR, AUTOKLAW

• PRZESZCZEPIALNIA

KOMORA DO PRAC STERYLNYCH, WIRÓWKI

• FITOTRON

• MYJNIA