Kultury in vitro
Praktyczne zastosowanie
Kultury in vitro - zalety
Sposób uzyskiwania materiału do badań techniką kultur in vitro posiada szereg istotnych zalet takich jak:
zapewnia większą jednorodność badanego materiału oraz uzyskanie dużych ilości roślin w krótkim czasie,
warunki sterylne umożliwiają śledzenie metabolizmu podawanych egzogennie substancji w roślinach, pozwalają eliminować wpływ mikroorganizmów na wartości mierzonych parametrów fizjologicznych w roślinach,
Kultury in vitro - zalety
Sposób uzyskiwania materiału do badań techniką kultur in vitro posiada szereg istotnych zalet takich jak:
w naczyniach hodowlanych wegetacja kultur odbywa się w lepiej regulowanych i stabilizowanych warunkach w porównaniu z warunkami zewnętrznymi,
pozwala na uniezależnienie się od pory roku oraz określanie i regulowanie warunków hodowli,
Kultury in vitro - zalety
Sposób uzyskiwania materiału do badań techniką kultur in vitro posiada szereg istotnych zalet takich jak:
pozwala selekcjonować linie o podwyższonej odporności na herbicydy, pestycydy i inne środki ochrony roślin, co jest znacznie tańsze niż selekcja w warunkach polowych,
umożliwia badanie procesów fizjologicznych takich jak reakcję na stresy, komunikację międzykomórkową, sekrecję różnych związków do środowiska.
Kultury in vitro - zalety
Sposób uzyskiwania materiału do badań techniką kultur in vitro posiada szereg istotnych zalet takich jak:
kultury in vitro zyskują coraz większe znaczenie w pracach hodowlanych, których celem jest otrzymywanie nowych, korzystnych dla człowieka genotypów roślin .
Ziemniak
Kultury tkankowe ziemniaka.
Kultury tkankowe ziemniaka.
Eksplantaty pobiera się ze stożków wzrostu, bulw, wierzchołków korzeni i kalusa.
Najłatwiej otrzymać można rośliny wolne od wirusów i dobrze ukorzeniające się z merystemów.
Wzrost wszystkich merystemów zależy od odmiany, stanu fizjologicznego warunków uprawy a następnie warunków hodowli in vitro.
Izolowany merystem nie powinien być większy niż 0,7 mm ani mniejszy niż 0,3 mm.
Powinien mieć zawiązek liścia ponieważ wtedy łatwiej ukorzenia się.
Ziemniak w kulturze in vitro
Kultury tkankowe ziemniaka.
Uzyskuje się tą drogą rośliny ziemniaka wolne od wirusów X i S oraz V i M.
Łatwość usuwania wirusa zależy nie tylko od niego samego ale także od szczepu, stąd biorą się często różnice w usuwaniu tego samego wirusa.
Otrzymane roślinki ziemniaka ukorzenia się i przenosi się na nową pożywkę średnio co miesiąc.
Obniżenie temperatury otoczenia pozwala na wydłużenie tego okresu.
Otrzymane z merystemów roślinki testuje się na obecność wirusów a wolne od tych patogenów służą jako źródło wycinków pędów, które można ukorzeniać i przeznaczać do hodowli w glebie lub w dalszym ciągu namnażać in vitro.
Mikrobulwy ziemniaka uzyskane w kulturach in vitro
Mikrobulwy ziemniaka uzyskane w kulturach in vitro
Kultury tkankowe warzyw i roślin przemysłowych.
Kultury tkankowe warzyw i roślin przemysłowych.
Najwcześniejsze badania w tej grupie roślin przeprowadzono na marchwi (Daucus carota).
Kultury tkankowe z kalusa marchwi, korzeni pomidora i kapustnych pozwoliły otrzymać ukorzenione pędy.
Z kolei liście i ich fragmenty pozwoliły na zregenerowanie roślin z rodziny psiankowatych a z pylników otrzymano rośliny kapusty pastewnej i rośliny buraka.
Z nerwów liściowych regenerowano kapustę brukselkę.
Z róży kalafiora regenerowano roślinę kalafiora.
Natomiast z merystemu wierzchołkowego otrzymano czosnek a z kwiatostanów cebuli otrzymano rośliny cebuli.
Fragmenty korzenia marchwi w kulturze in vitro
Kalus marchwi
Kultury tkankowe warzyw i roślin przemysłowych.
Bardzo zaawansowane są badania nad następującymi roślinami z tej grupy: Beta vulgaris (burak zwyczajny), Lactuca sativa (sałata siewna), Brassica napus (rzepak), Brassica oleracea (kapusta warzywna), Raphanus sativus (rzodkiew zwyczajna), Sinapsis alba (gorzyca biała), Cucurbita pepo (dynia), Allium cepa (cebula), Asparagus officinalis (szparag lekarski), Pisum sativum (groch), Solanum tuberosum (ziemniak), Daucus carota (marchew)i wiele innych.
Burak cukrowy w kulturach in vitro
Kultury in vitro Brasica
Kultury tkankowe storczyków.
Kultury tkankowe storczyków.
Czynnikami ograniczającymi rozmnażanie storczyków są budowa kwiatu utrudniająca zapylenie i kiełkowanie nasion tylko w obecności symbiotycznych grzybów.
Kultury in vitro zarodków pozwalają na otrzymanie roślin z nasion, które na skutek niesprzyjających czynników zewnętrznych i wewnętrznych słabo kiełkują tak jak to jest właśnie u storczyka.
Kiełkujące zarodki storczyka tworzą najpierw tzw. Protokormy przypominające przedrośla roślin niższych.
Dopiero na nich wyrastają pędy.
Powstawaniu protokormów często towarzyszy narastanie tkanki kalusowej, którą można wykorzystać do otrzymywania roślin tych odmian, które słabo zawiązują nasiona, lub których nasiona źle kiełkują.
Kultury tkankowe storczyków.
Kultury in vitro merystemów storczyków pozwoliło na szybkie namnażanie wegetatywne tych roślin bez konieczności kiełkowania ich nasion.
Merystemy pochodzą zwykle z protokormów z których wyrastają pędy.
Tam gdzie mamy tylko jeden merystem wierzchołkowy podjęto z powodzeniem próbę wykorzystania do namnożeń małych okrytych łuską pąków na pędzie kwiatostanowym.
Storczyk w kulturze in vitro
Storczyk w kulturze in vitro
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Goździki - izolując wierzchołek wzrostu doprowadzono do wytworzenia u jego podstawy tzw. wieloroślinki czyli wielu pędów bocznych.
Z tych odgałęzień każdy oddzielony pęd tworzy nową roślinkę.
Ten sposób pozwala więc na szybkie otrzymanie niezliczonej liczby roślin potomnych o cechach roślin wyjściowych.
Goździk pyszny w kulturze in vitro
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Chryzantemy – opracowane metody pozwalają na masowe rozmnażanie chryzantem w warunkach in vitro z części kwiatostanów.
Podobnie kultury in vitro pąków wierzchołkowych i wycinków węzłów z pąkiem pozwalają na długie przechowywanie cennych odmian na małej powierzchni.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Gerbery – opracowano najpierw metodę uzyskania gerbery z izolowanych nerwów liści a następnie z wierzchołków pędów, koszyczków kwiatowych i młodych kwiatostanów.
Otrzymywanie sterylnych kultur sprawia tu duże trudności ponieważ eksplantaty są pokryte włoskami, które utrudniają sterylizację.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Anturium – uzyskano rośliny z kalusa wyrosłego z fragmentów blaszki liściowej a następnie organogenezę uzyskano tylko z fragmentów blaszki liściowej.
Pozwoliło to jednocześnie na zapewnienie genetycznej stabilności materiału co było utrudnione w przypadku roślin z kalusa.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Pelargonia – rośliny takie można otrzymać z merystemów wierzchołkowych, są one wolne od patogenów i rosną bujniej i lepiej kwitną.
Etapy rozmnażania pelargonii w kulturach in vitro
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Lilia - na pożywce z dodatkiem auksyn i cytokinin mnożą się cebulki z których wyrastają małe listki.
Pędy mnożą się w czasie kolejnych subkultur a otrzymane rośliny z pędów przybyszowych i bocznych są podobne dp roślin macierzystych.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Frezja – tworzenie się przybyszowych pędów z milimetrowych odcinków łodyg wywołano przez kilkunastogodzinne moczenie w płynnej pożywce z dodatkiem auksyny a następnie przez przeniesienie eksplantatów na pożywkę z cytokininą.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Kosaciec – otrzymano rośliny z wycinków łodyg rosnących na pożywce z auksyną a potem przeniesienie na pożywkę z cytokininą na której lepiej rozwijają się pędy.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Hiacynty – otrzymano rośliny z fragmentów łusek.
Kultury tkankowe w uprawie roślin ozdobnych.
Do chwili obecnej lista roślin ozdobnych rozmnażanych w kulturach in vitro wzbogaciła się o szereg innych takich jak np. paprocie, narcyzy, mieczyki, amarylisy, cyklameny, dalie, margerytki itd.
Uwalnianie narcyzów od wirusów z wykorzystaniem kultur in vitro
Irysy w kulturach in vitro
Amarylis w kulturze in vitro
Zastosowanie kultur tkankowych w uprawie drzew i krzewów.
Zastosowanie kultur tkankowych w uprawie drzew i krzewów.
Kultury tkankowe u roślin drzewiastych mogą posłużyć jako dodatkowy sposób rozmnażania wegetatywnego o ile tylko jest to ekonomicznie uzasadnione. W tym celu wykorzystuje się kultury:
- merystemów
- tkanki przyrannej (kalusa)
- pylników lub ziaren pyłku
- zawiązków kwiatów
Zastosowanie kultur tkankowych w uprawie drzew i krzewów.
Zastosowanie kultur tkankowych w uprawie drzew i krzewów.
Dotychczas uzyskano w kulturach i vitro wzrost między innymi takich roślin jak: Salix kaprea (wierzba iwa), Syringa vulgaris (lilak pospolity), Betula verrucosa (brzoza brodawkowata), Prunus amygdalus (migdałowiec), Tilia americana (lipa amerykańska), Eucalyptus bancrofti (eukaliptus), Ulmus camprestis (wiąz), Albies balsamea (jodła balsamiczna)i wielu innych .
Zastosowanie kultur tkankowych w sadownictwie.
Zastosowanie kultur tkankowych w sadownictwie.
Materiałem służącym najczęściej jako źródło merystemów są jednoroczne przyrosty w stanie spoczynku.
Od momentu zbioru do izolowania merystemów gałązki pozostają w chłodni w temperaturze około 4oC.
Niekiedy pobiera się eksplantaty z pąków aktywnych.
Merystem pobiera się wtedy z rozwijających listki pąków.
W ten sposób udało się otrzymać kultury in vitro wielu roślin sadowniczych takich jak między innymi: jabłonie, grusze, brzoskwinie maliny, jeżyny, porzeczki, agrest, podkładki jabłoni i winorośli itd.
Prunus w kulturze in vitro
Zastosowanie kultur tkankowych w sadownictwie.
Rozwój merystemu roślim sadowniczych przebiega w 3 etapach:
1. pierwszym etapem jest izolacja merystemu i po przeniesieniu go na pożywkę wytworzenie rozetki liści,
2. drugim etapem jest namnażanie roślinek czyli stymulowanie wytwarzania pąków przybyszowych i wytwarzanie wokół nich rozetek liściowych,
3. trzeci etap to ukorzenianie się i aklimatyzacja roślinek.
Rozmnażanie in vitro truskawki.
Rozmnażanie in vitro truskawki.
Rozmnażanie in vitro truskawki daje gwarancję otrzymania zdrowych wolnych od wirusów roślin oraz pozwala na pominięcie corocznego kontrolowania zdrowotności roślin.
Mateczniki truskawek in vitro można przechowywać na pożywce podstawowej w stałym oświetleniu przez okres 12-18 miesięcy.
Namnażanie następuje po przeniesieniu roślin z pożywki podstawowej na pożywkę wzbogaconą o 1mg/dm3 BA.
Truskawka w kulturach in vitro
Zastosowanie kultur in vitro w hodowlach roślin zbożowych.
Zastosowanie kultur in vitro w hodowlach roślin zbożowych.
Badania in vitro dotyczą rozmnażania ryżu, pszenicy, jęczmienia, sorgo, kukurydzy, owsa, żyta.
Chociaż typowe kultury in vitro tkanek roślin zbożowych nie przyczyniają się bezpośrednio do zwiększania w nich ilości węglowodanów to mogą one jednak pośrednio zwiększyć produktywność roślin zbożowych dzięki udoskonaleniu metod badań genetycznych i hodowlanych.
Uzyskanie zbóż mających zdolność wiązania azotu i dużą odporność może w przyszłości zrewolucjonizować światową gospodarkę żywnościową.
Kultury tkankowe w uprawie roślin cytrusowych.
Kultury tkankowe w uprawie roślin cytrusowych.
Stosowano najwcześniej regenerację roślin z tkanek ośrodka izolowanego z zalążków w kwiatach lub niedojrzałych nasionach, lub kultury merystemów.
Kultury tkankowe stały się tutaj narzędziem wykorzystywanym do badania wpływu określonych czynników na rozwój tkanek.
Wiadomo, że rośliny cytrusowe pochodzą z klimatu tropikalnego stąd mają one wysokie wymagania, co do warunków hodowli.
Stwierdzono, że izolowanie niewielkich wierzchołków wzrostu pędu daje duże szanse otrzymania zdrowego materiału przy całkowitym utrzymaniu jednorodności genetycznej.
Rośliny otrzymane w ten sposób nie mają młodocianego charakteru takiego, jaki mają rośliny zregenerowane innymi sposobami
Zastosowani kultur tkankowych w hodowli kawy.
Zastosowanie kultur tkankowych w hodowli kawy.
Stosowano tu kultury in vitro z kalusa otrzymanego z gałązek, węzłów, pylników i płatków kwiatów.
Prace mają na celu zmniejszenie ilości kofeiny i większą plenność.
Trwają badania nad uzyskaniem nowych plenniejszych odmian, które mogą być uprawiane na terenach nieodpowiednich dla Coffea arabica.
Coffea w kulturze in vitro
Zastosowanie kultur in vitro zalążków w uprawie bawełny.
Zastosowanie kultur in vitro zalążków w uprawie bawełny.
Kultury in vitro zalążków bawełny stosuje się do badań nad czynnikami regulującymi rozwój włókien i kalusa w eksplantatach.
Badania czynników wpływających na zawiązywanie nasion i wartość włókna można przeprowadzić na wyizolowanych zalążkach w określonym stadium rozwoju.
Barley w kulturze in vitro
Zastosowanie kultur in vitro w uprawie trzciny cukrowej.
Zastosowanie kultur in vitro w uprawie trzciny cukrowej.
Prowadzi się badania na eksplantatach z młodych liści i mają na celu ulepszenie tych roślin.
Tkankę kalusową można otrzymać z prawie wszystkich organów roślinnych.
Kalus o największej totipotencji powstaje najszybciej na młodych eksplantatch rozwijających się z liści lub młodych tkanek kwiatów.
Zastosowanie kultur in vitro w uprawie trzciny cukrowej.
W odpowiednich warunkach kalus daje dość łatwo różnicujące się pędy.
Ich ukorzenianie jest jednak trudne i przebiega w kilku etapach.
Najpierw pojedyncze pędy przenosi się na pożywkę agarową a następnie przenosi do wody i intensywnie napowietrza, co powoduje ich ukorzenianie.
Następnie przesadza się je do wermikulitu, potem do ziemi i dopiero na końcu wysadza w warunki polowe.
Dzięki takim hodowlom uzyskano rośliny odporne na choroby. Poznano także czynniki wpływające na wysokość plonu i zawartość cukru.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Badania z zakresu biotechnologii roślin są bardzo zróżnicowane.
Można w nich wyróżnić następujące główne kierunki badawcze o szczególnym znaczeniu farmaceutycznym:
1.badania dotyczące endogennej produkcji ważnych terapeutycznie związków w kulturach in vitro,
2. procesy biotransformacyjne
3. inżynierię genetyczną
4. mikrorozmnażanie roślin .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Endogenna produkcja ważnych
terapeutycznie związków w kulturach
in vitro
Z farmaceutycznego punktu widzenia, głównym kierunkiem badawczym biotechnologii roślin są badania nad endogenną produkcją biologicznie
aktywnych metabolitów wtórnych.
W światowym dorobku naukowym mamy kilka produktów, które można uzyskać na skalę pozalaboratoryjną z roślinnych kultur in vitro.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Endogenna produkcja ważnych
terapeutycznie związków w kulturach
in vitro
Klasycznymi przykładami są m.in. szikonina,
kwas rozmarynowy, berberyna, ginsenozydy, paklitaksel.
Związki te można pozyskać odpowiednio
z kultur in vitro: Lithospermum erythrorhizon, Coleus
blumei, Coptis japonica, Panax ginseng i Taxus sp.
Producentami związków otrzymywanych z kultur roślin
in vitro są firmy japońskie (Kanebo, Mitsui, Nitto–
Denki, Toyobo), niemieckie (BioPlanta, Boehringer
Mannheim, Diversa, Natterman, Phyton), amerykańska
(Escagenetics) a ostatnio również firma koreańska
Sam Yang Genex Corp
Lithospermum erythrorhizon - nawrot
Coleus blumei Benth. – pokrzywka brazylijska, koleus
Coptis japonica - złotnica
Panax ginseng – żeń szeń
Taxus sp. - cis
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W laboratoriach biotechnologicznych, również krajowych, prowadzone były i są kontynuowane niezwykle istotne badania m. in. nad możliwością uzyskania paklitakselu (kultury Taxus sp.) i innych
cytostatyków, kamptotecyny i jej pochodnych (kultury Camptotheca acuminata), alkaloidów indolowych – winkrystyny i winblastyny w kulturach in vitro i w zregenerowanych roślinach Catharanthus roseus .
Camptotheca acuminata – drzewko życia
Catharanthus roseus – barwinek różowy
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Aby uzyskać znaczną zawartość metabolitów wtórnych w hodowanej in vitro biomasie należy przyjąć określoną strategię postępowania .
Jednym z warunków powodzenia jest
przeprowadzenie selekcji wysokowydajnych linii komórkowych.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W wyniku selekcji udało się znacznie zwiększyć m. in. zawartość berberyny w biomasie Coptis japonica (złotnica) hodowanej in vitro do ponad 13 g%.
Wynik ten jest bardzo dużym osiągnięciem, gdy porówna się uzyskaną zawartość z przeciętną zawartością berberyny w roślinach rosnących w warunkach naturalnych, równą ok. 5 g%.
Jest to klasyczny w biotechnologii roślin przykład efektów selekcji .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W ramach strategii zmierzającej do uzyskania wysokiej zawartości metabolitów roślinnych, po udanej selekcji należy zoptymalizować warunki prowadzenia kultury in vitro.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Optymalizacja obejmuje:
skład podłoża hodowlanego,
warunki świetlne,
temperaturę,
stopień wilgotności powietrza w pomieszczeniach hodowlanych.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Należy też przetestować różne typy kultur:
kalusowe,
wytrząsane,
zawiesinowe,
Ma to na celu wybranie typu kultury najbardziej sprzyjającego przyrostom biomasy, ale też biosyntezie i akumulacji związków czynnych
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Zwykle szybkiemu przyrostowi biomasy towarzyszy niski stopień akumulacji metabolitów wtórnych.
Często zatem należy ustalić:
oddzielnie skład podłoża wzrostowego
Oddzielnie skład podłoża produkcyjnego.
Po uzyskaniu zadowalających przyrostów biomasy, zwykle przenosi się ją na podłoże produkcyjne.
Podłoże produkcyjne często wzbogaca się dodatkiem prekursorów biosyntezy skomplikowanych strukturalnie metabolitów wtórnych oczekując, że będą one wykorzystane przez komórki w produkcji związków czynnych.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Dobrym przykładem wagi badań dotyczących wpływu typu kultur na akumulację metabolitów mogą być kultury in vitro Podophyllum peltatum.
W kulturach kalusowych tego gatunku uzyskano około 2-krotnie większe zawartości podofilotoksyny w porównaniu z kulturami zawiesinowymi.
Podobnie typ prowadzonych kultur Ruta graveolens był istotny dla akumulacji linearnych furanokumaryn.
Większą zawartość tych metabolitów, głównie bergaptenu i ksantotoksyny uzyskano w płynnych kulturach stacjonarnych, niż w kulturach wytrząsanych
Podophyllum peltatum – stopkowiec tarczowaty
Ruta graveolens – ruta zwyczajna
Kultury płynne stacjonarne pędów Ruta graveolens. Podłoże L–S, BAP – 2 mg/l, NAA – 2 mg/l (autor zdjęcia: T. Poboźniak, firma Kodak)
Kultury
wytrząsane pędów Ruta graveolens. Podłoże L–S, BAP –
0.1 mg/l, NAA – 0.1 mg/l (autor zdjęcia: T. Poboźniak, firma
Kodak
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Kumulacji metabolitów wtórnych sprzyja też wysoki stopień organogenezy.
W kulturach organów – pędów, korzeni, można spodziewać się uzyskania znacznej zawartości związków .
Zależność tę wykazano dla różnych grup metabolitów, m.in. dla alkaloidów tropanowych, alkaloidów indolowych połączeń kumarynowych.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W kulturach korzeni Atropa belladonna uzyskano znaczne zawartości L-hioscyjaminy, skopolaminy i apoatropiny, porównywalne z zawartością w korzeniach roślin.
W kulturach pędowych Catharanthus roseus otrzymano 1–8-krotnie wyższe zawartości ajmaliny w porównaniu z jej zawartością w całej roślinie .
Również w kulturach pędów Ruta graveolens uzyskane zawartości linearnych furanokumaryn były znaczne, porównywalne lub wyższe niż w analizowanych częściach nadziemnych roślin pochodzących z różnych stanowisk.
Catharanthus roseus – Madagaskar barwinek
Atropa belladonna – ziele Szatana
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Jeszcze innym elementem strategii jest stworzenie rosnącym in vitro komórkom warunków stresu .
Czynniki stresujące, określane jako elicitory to:
czynniki fizykochemiczne (tzw. elicitory abiotyczne),
całe żywe organizmy lub ich części (tzw. elicitory biotyczne).
Często rolę elicitorów abiotycznych pełnią dodane do kultur związki chemiczne, takie jak np. jasmonian metylu, alginiany wapnia, sodu.
Znanymi elicitorami biotycznymi są np. lizaty bakteryjne, hodowle grzybów (np.Phytophthora megasperma sp. Glicinea = tzw. Pmg – elicitor, czy Althernaria carthami = tzw. Ac – elicitor).
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W wyniku takich zabiegów np. w kulturach Ruta graveolens po elicytacji za pomocą Rhodotorula rubra uzyskano nawet 300-krotny wzrost zawartości alkaloidów akrydynowych .
W kulturach Gingko biloba prowadzonych w Katedrze Botaniki Farmaceutycznej CM UJ dodatek jasmonianu metylu powodował znaczny wzrost zawartości kwasów fenolowych .
Gingko biloba - miłorząb dwuklapkowy
Kalusujące fragmenty liści Ginkgo biloba. Podłoże M–S, BAP – 0,5 mg/l,2,4D – 2 mg/l (autor zdjęcia: dr A. Szewczyk, Katedra Botaniki Farmaceutycznej CM UJ)
Kultury
kalusowe Ginkgo biloba. Podłoże M–S, BAP – 2 mg/l, pikloram
–
4 mg/l (autor zdjęcia: dr A. Szewczyk, Katedra Botaniki
Farmaceutycznej CM UJ)
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Jeszcze innym sposobem uzyskania znacznej zawartości metabolitów wtórnych jest transformacja genetyczna roślin z wykorzystaniem bakterii, głównie Agrobacterium rhizogenes .
W kulturach in vitro ze względu na sztuczność warunków mogą powstawać także nowe, nieznane wcześniej w danych taksonach związki lub nawet zupełnie nowe w świecie roślin połączenia .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Pierwsze nowe związki wykryto w kulturach in vitro w1968 r. Były to laktony seskwiterpenowe, które nazwano panikulidami.
Pod koniec lat 80. XX wieku oszacowano liczbę nowych związków na ok. 90.
Wśród nich najliczniej reprezentowane były połączenia chinoidowe, kolejno alkaloidy i terpeny.
W połowie 1999 r. oszacowano liczbę nowych związków już na ponad 320.
Klasycznym przykładem ogromnego bogactwa enzymatycznego są kultury Ruta graveolens, w których spośród 103 związków wykrytych in vitro, aż 52 związki, to nowe połączenia.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Fakt powstawania nowych związków w kulturach in vitro stanowi nową ciekawą farmaceutyczną perspektywę otrzymywania związków z aktywnością biologiczną.
Dla wielu z nich udowodniono różne kierunki działania biologicznego.
Dobrymi i znanymi przykładami mogą być podoweryny – biflawonoidy z kultur Podophyllum versipelle o właściwościach przeciwzapalnych, czy perycyna – indolowy alkaloid z kultur Picralima nitida o właściwościach analgetycznych.
Podophyllum versipelle – Chinese Mayapple - padofylum
Picralima nitida - Akuama
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii - procesy biotransformacyjne
Procesy biotransformacyjne
Odmiennym kierunkiem badawczym, również istotnym z farmaceutycznego punktu widzenia są procesy biotransformacyjne.
Z udziałem enzymów z komórek roślinnych kultur in vitro mogą zachodzić różne reakcje, m.in. reakcje utleniania, redukcji, syntezy.
Komórki roślin są zdolne do przekształcania podanych egzogennie substratów w oczekiwane produkty.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Procesy biotransformacyjne
Prowadzone w tym zakresie badania są bardzo istotne ze względu na regio- i stereospecyficzność reakcji przeprowadzanych przez enzymy roślinnych komórek.
W badaniach tego typu wykorzystuje się
też odmienność potencjału enzymatycznego roślin w porównaniu z mikroorganizmami (bakterie, grzyby niższe).
Stosunkowo łatwo zachodzą z udziałem
roślinnych komórek reakcje glukozylacji.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Klasycznym przykładem ważnego procesu biotransformacji jest transformacja glikozydów nasercowych – przekształcanie β-metylodigitoksyny w produkt o lepszych parametrach farmakokinetycznych, β-metylodigoksynę z udziałem komórek z kultur in vitro Digitalis lanata.
Jest to przykład regio- i stereospecyficznej
reakcji – 12-β-hydroksylacji.
Digitalis lanata – Grecian naparstnica
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Kolejnym ciekawym klasycznym też przykładem może być reakcja β-D-glukozylacji hydrochinonu w arbutynę, cenny w terapii i kosmetyce glikozyd fenolowy.
W badaniach prowadzonych w tym kierunku wykorzystuje się kultury in vitro licznych gatunków roślin, które w naturalnych warunkach nie syntetyzują arbutyny.
Są to przedstawiciele bardzo różnych taksonów.
Możliwość taka wynika z powszechności występowania enzymów z grupy β-glukozylaz w świecie roślin oraz braku specyficzności substratowej tych enzymów .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Reakcja ta zachodzi z bardzo dużą wydajnością m.in. w kulturach Rauwolfia serpentina, Datura innoxia i Catharanthus roseus.
W Katedrze Botaniki Farmaceutycznej UJCM wykazano zdolność m.in. komórek z kultur in vitro Ruta graveolens i podgatunku R. g. ssp. divaricata do przeprowadzania tej reakcji .
Nowym ciekawym przykładem reakcji biotransformacji może być produkcja salidrozydu i rozawiny w kulturach Rhodiola rosea .
Rauwolfia serpentina – snakeroot – rauwolfia żmijowa
Datura innoxia - bieluń
Rhodiola rosea – różeniec górski .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii - badania z zakresu inżynierii genetycznej
Badania z zakresu inżynierii genetycznej
Jeszcze inny kierunek badawczy, najbardziej dynamicznie rozwijający się w ostatnim okresie, to badania z zakresu inżynierii genetycznej, dotyczące transformacji genetycznej roślin.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Rośliny można poddawać transformacji genetycznej,
wykorzystując bakterie z rodzaju Agrobacterium – A.
tumefaciens i A. rhizogenes.
Bakterie te w warunkach naturalnych są odpowiedzialne za powstawanie chorób nowotworowych u roślin.
Po zainfekowaniu rośliny A. tumefaciens w miejscu zakażenia powstaje tumorowa narośl określana jako crown gall, po zakażeniu drugim gatunkiem – A. rhizogenes, w miejscu infekcji powstają liczne korzenie określane jako hairy roots.
Za powstawanie tych morfologicznie różnych tumorów roślin odpowiedzialne są plazmidy bakteryjne.
Fragmenty plazmidów włączają się do genomu zainfekowanej rośliny .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W celu uzyskania wysokiej zawartości metabolitów wtórnych o znaczeniu farmaceutycznym celowo zakaża się rośliny, ich fragmenty (np. liście, łodygi) A. rhizogenes, aby otrzymać kultury hairy roots.
W kulturach tych można uzyskać znaczne zawartości metabolitów wtórnych, głównie tych, które w warunkach naturalnych transformowane rośliny gromadzą w swych korzeniach.
Uzyskane zawartości metabolitów mogą być nawet 10–50-krotnie wyższe niż w korzeniach roślin nietransformowanych.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Najłatwiej transformacji genetycznej ulegają gatunki roślin z rodzaju Solanaceae.
Największe trudności występują przy próbach z roślinami jednoliściennymi.
Charakterystyczną cechą tego modelu badawczego są ekstremalnie wysokie, nawet do 60 razy, przyrosty biomasy w czasie 3–4 tygodni. Kultury te charakteryzują się ponadto genetyczną stabilnością.
W kulturach hairy roots różnych gatunków roślin uzyskano m.in. wysokie zawartości walepotriatów (10,3 g% s.m. – kultury Valeriana officinalis, var. sambucifolia), glycyryzyny (4,7 g% s.m. – kultury Glycyrrhiza uralensis), alkaloidów tropanowych (1,32 g% – kultury Atropa belladonna) .
Valeriana officinalis – kozłek lekarski
Glycyrrhiza uralensis - lukrecja
Atropa belladonna – pokrzyk wilcza jagoda
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W Polsce tą tematyką badawczą zajmują się głównie ośrodki badawcze w Łodzi, Warszawie, Krakowie, Gdańsku.
W ośrodku łódzkim badano m.in. zdolności biosyntetyczne kultur Hyssopus officinalis, uzyskując w nich interesujące zawartości kwasu rozmarynowego.
Ostatnio obiektem badań były m. in. kultury hairy roots czterech różnych gatunków Salvia, w których wykazano obecność głównie związków terpenowych (z grupy di- i triterpenów) oraz kwasu rozmarynowego.
Ponadto obiektem badań były kultury Arnica montana i Centaurium umbellatum .
Hyssopus officinalis – hyzop lekarski
Salvia - szałwia
Arnica montana – arnika górska
Centaurium umbellatum - centuria
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W ośrodku warszawskim badano m.in. kultury hairy roots Coluria geoides, a ostatnio Lithospermum canescens.
W Krakowie bardzo ciekawe wyniki uzyskano m.in. w badanych kulturach różnych gatunków z rodziny Asteraceae.
W ośrodku gdańskim w kulturach hairy roots Ammi majus poszukiwano linearnych furanokumaryn.
Asteraceae - astrowate
Coluria geoides - koluria
Lithospermum canescens – puccon sędziwy
Ammi majus – kwiat biskupa
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Drugi gatunek Agrobacterium – A. tumefaciens wykorzystuje się najczęściej jako wektor w zabiegach z zakresu inżynierii genetycznej.
W integrujący z genomem rośliny fragment plazmidu bakteryjnego można wprowadzić gen odpowiedzialny za ważną cechę (np. gen odporności na owady, herbicydy, zasolenie) i oczekiwać jego ekspresji, co ma ogromne znaczenie w uprawach roślin, m. in. gatunków o walorach równocześnie przemysłowych, spożywczych, jak i farmaceutycznych, takich jak np. Gossypium sp., czy Glycine soja .
Gossypium sp. - bawełna
Glycine - soja
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W stransformowanych roślinach można uzyskać, korzystając też najczęściej z A. tumefaciens jako wektora, ludzkie białka (np. hemoglobinę, przeciwciała monoklonalne).
Można również za pomocą tego systemu
wprowadzić do roślin antygen bakteryjny, czy wirusowy i uzyskać szczepionki roślinne.
Udało się to już m.in. dla szczepionek przeciwko Vibrio cholerae i Helicobacter pylori, oraz wirusom HIV i HBV .
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii - mikrorozmnażanie roślin leczniczych
Mikrorozmnażanie roślin leczniczych
Niezwykle ważne są prace dotyczące mikrorozmnażania roślin, czyli rozmnażania z wykorzystaniem kultur in vitro.
Szczególnie istotne jest opracowanie takich metod mnożenia roślin dla gatunków leczniczych z innych stref klimatycznych, dla gatunków zagrożonych z powodu zanieczyszczeń środowiska naturalnego, czy też atakowanych przez patogenny.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Mnożenie jest możliwe dzięki zdolności fragmentów
roślin do regeneracji w warunkach in vitro.
Regeneracja następuje z istniejących na eksplantatach merystemów (= zawiązków tkanki twórczej) lub też z wytworzonych przez eksplantaty merystemów przybyszowych.
Merystemy przybyszowe mogą powstać bezpośrednio
na eksplantacie lub pośrednio poprzez etap tkanki
kalusowej.
Merystemy istniejące to merystemy pączka bocznego,
wierzchołka pędu, czy merystemy zarodka.
Merystemy przybyszowe natomiast, to np. wierzchołek pędu lub somatyczny zarodek (=embroid)
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Dla licznych gatunków roślin leczniczych opracowano metody mikrorozmnażania.
Już w 1988 r. podano listę 137 gatunków mnożonych in vitro.
Spośród ok. 80 gatunków roślin farmakopealnych figurujących w wydaniu V Farmakopei Polskiej, już w 1992 r. dla 40 gatunków były opracowane metody mikrorozmnażania .
Współcześnie brak podobnego zbiorczego opracowania przedstawiającego aktualny stan badań w tym zakresie
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Najwydajniejszą metodą mikrorozmnażania roślin
jest metoda wykorzystująca zjawisko powstawania
somatycznych zarodków, czyli zjawisko somatycznej
embriogenezy.
Z kilku gramów embriogennej tkanki można uzyskać ponad 1 mln zarodków.
Metodę mnożenia roślin z wykorzystaniem tego zjawiska opracowano już dla ok. 150 gatunków roślin .
Zjawisko to jest charakterystyczne głównie dla roślin z rodzin Apiaceae, Solanaceae, Brassicaceae, w których liczni reprezentanci to ważne gatunki roślin leczniczych
Apiaceae - selerowate
Solanaceae - psiankowate
Brassicaceae - krzyżowe
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
W Polsce badania dotyczące mikrorozmnażania prowadzone są w ośrodkach w Warszawie, Poznaniu, Łodzi, Krakowie, Gdańsku.
W ośrodku warszawskim opracowano metody mikrorozmnażania zarówno roślin z innych
stref klimatycznych, m.in. Catharanthus roseus, Dioscorea deltoidea, Bergenia sp., jak i rosnących w Polsce w sztucznych kolekcjach
uprawowych, ale atakowanych np. przez
szkodniki – m.in. Carum carvi .
Dioscorea deltoidea - yams
Bergenia sp.,- bergenia, mongolska herbata, uszy słonia
Carum carvi – kminek zwyczajny
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Ważnym przykładem mnożenia roślin z wykorzystaniem kultur in vitro może być metoda opracowana w ośrodku krakowskim dla Scilla maritima .
Dobrym przykładem nowszych badań może być metoda mnożenia 3 gatunków Drosera sp. opracowana w Gdańsku, czy też Pueraria lobata zaproponowana przez ośrodek poznański .
Scilla maritima – cebula morska
Drosera sp. - rosiczka
Pueraria lobata – opornik łatkowaty, kodzu
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Zakończone powodzeniem próby opracowania metody mikrorozmnażania podjęto także w Katedrze Botaniki Farmaceutycznej CM UJ.
Dotyczyły one mikrorozmnażania Leucojum vernum, gatunku będącego źródłem ważnych w terapii alkaloidów – galantaminy i likoryny.
Dla wymienionego gatunku opracowano protokoły mikrorozmnażania zarówno na drodze organogenezy, jak i somatycznej embriogenezy
Leucojum vernum – śnieżyca wiosenna
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii - inne ważne kierunki badawcze
Inne ważne kierunki badawcze
Bardzo istotnym z farmaceutycznego punktu widzenia kierunkiem badawczym biotechnologii roślin są też prace z zakresu biochemii, biologii molekularnej i równocześnie enzymologii, zmierzające do ustalenia szlaków biogenetycznych prowadzących do powstania ważnych terapeutycznie związków pochodzenia roślinnego.
Poznanie enzymów uczestniczących w biogenezie metabolitów, izolacja enzymów, ich charakterystyka fizykochemiczna, ma nie tylko ogromne znaczenie poznawcze.
Wyizolowane enzymy można wykorzystać w celach praktycznych, w produkcji metabolitów wtórnych.
Same enzymy też mogą być oczekiwanym produktem o cennych właściwościach biologicznych
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Inne ważne kierunki badawcze
Wymienione badania prowadzone są w ramach kierunku określanego jako inżynieria enzymatyczna.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Nowe spojrzenie na biotechnologię roślin
Unia Europejska oraz Organization for Economic Cooperation and Development przyjęły klasyfikację wszystkich badań biotechnologicznych określaną różnymi kolorami :
biotechnologia zielona - problematyka badawcza obejmująca biotechnologię roślin (aspekty rolnicze),
biotechnologia czerwona - biotechnologia wykorzystywana w ochronie zdrowia
biotechnologia biała – w jej ramach prowadzi się prace wykorzystujące organizmy żywe w ochronie środowiska i produkcji przemysłowej.
biotechnologia niebieska - bazuje na wykorzystywaniu organizmów morskich, głównie glonów.
Zastosowanie kultur in vitro w biotechnologii
Biotechnologia roślin, to tradycyjnie biotechnologia zielona.
Uwzględniając jednak zasygnalizowane powyżej możliwości wykorzystania metod biotechnologii roślin w produkcji metabolitów wtórnych o walorach terapeutycznych, a szczególnie transformowanych roślin w produkcji biofarmaceutyków (m.in. szczepionek, przeciwciał monoklonalnych), należy uznać, że już dziś stanowi integralną część biotechnologii czerwonej, a pozycja ta z pewnością umocni się jeszcze bardziej w najbliższej przyszłości.