ZASTOSOWANIE KULTUR IN-VITRO W PRODUKCJI ROŚLIN OZDOBNYCH

Kultury `in-vitro' - aseptyczne kultury fragmentów rośłin ( tkanki , organy , merystemy , zarodki , protoplasty ) prowadzone w ściśle kontrolowanych warunkach ( w specjalnych pojemnikach i pomimieszczeniach).

Podstawą rozmnażania roślin w kulturach in vitro jest naturalna zdolność roślin do romnażania bezpłciowego , wykorzystywana również w innych metodach ich reprodukcji na drodze wegetatywnej oraz zdolność totipotencji komórek.

Totipotencja komórek roślinnych - nieograniczona zdolność komórek do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów. W każdej komórce kompletny materiał genetyczny , co umożliwia odtworzenie nowej rośliny.

• TOTIPOTENCJA

• Dydeferencjacja - odróznicowanie się komórek i ich powrót do stanu merystematycznego

• Redydeferencjacja - ponowne zróznicowanie się komórek dające możliwość regeneracji komórek i tkanek

• POCZĄTKI KULTUR IN VITRO

• 1902 - Haberland , pierwsze doświadczenia

• 1936 - odkrycie auksyny IAA

• 1930-1940 - kultury kallusa

• 1939- pierwsze kultury roślinne

• 1950 - kultury merystemów , odwirusowywanie roślin

• 1956 - odkrycie kinetyny

• 1958 - zarodki somatyczne w kulturach zawiesinowych

• 1962 - opracowanie składu uniersalnejpozywki do kultur komórek , tkanek , organów roślinnych ( Murashige i Skoog )

• 1965 - opracowanie metody rozmnażania storczyków in vitro

• Dalsze lata - zwiększanie puli odmianowej i gatunkowej rozmnażanej in vitro. Udoskonalanie metod. Automatyzacja i robotyzacja.

• ZALETY KULTUR TKANKOWYCH

• Nieduża ilość materłu rołślinnego potrzebna do założenia kultury

• Zdrowy , wyrównany genetycznie i fenotypowo materiał

• Bardzo wysoki współczynnik rozmnażania ( z 1 rośliny matecznej nawet 1 mln roślin w ciągu roku np. lilie , storczyki )

• Całoroczna produkcja niezależna praktycznie od sezonu wegetacyjnego

• Łatwość międzynarodowego obrotu i transportu ( mała waga , sterylny , wolny od patogenów materiał )

• MOŻLIWOŚCI ZASTOSOWANIA KULTUR TKANKOWYCH

• Klonowanie odmian heterozygotycznych

• Odwirusowywanie , kultury izolowanych merystemów

• Szybkie rozmnażanie , wprowadzenie na rynek nowych odmian

• Wykorzystywane w inzynierii genetycznej

• Zachowanie linii męskosterylnych , uzyskiwanie form haploidalnych , tetraploidalnych , fuzje protoplastów , mieszańce somatyczne

• Długoterminowe przechowywanie cennego materiału roślinnego , banki genów. Zakładanie mateczników in-vitro . Przechowywane w niższej temperaturze w słabszym oświetleniu w labolatorium

• Pozyskiwanie wtórnych metabolitów

• Produkcja zarodków somatycznych i sztucznych nasion

• Mechanizacja i automatyzacja produkcji ( bioreaktory)

• Produkcja materiału roslinnego na bardzo dużą skalę

• WADY KULTUR TKANKOWYCH

• Metoda pracochłonna

• Metoda kosztowna

• Możliwość zakażeń

Wyjściowa roślina
Rozmnażanie z wykorzystaniem isteniejących paków	Rozmnażanie poprzez zarodki somatyczne
Pobieramy merystem , albo pąk wierzchołkowy , po odkażeniu wykładamy na pożywkę. Następuje regeneracja. Bazujemy na merystemach , pobudzamy je do aktywności.	Pobieramy eksplantat , następuje morfogeneza na drodze bezpośredniej ( na ekplantacie powstaja pąki przybuszowe , pędy , tworzą się zarodki somatyczne ) lub na drodze pośredniej - stadium kallusa , na kallusie pąki przybyszowe.

• PRODUCJA ROŚLIN IN-VITRO W MLN SZTUK

	1995 - 1996	1998-1999
Europa	160	179
Azja	135	155
USA	128	110
OGÓŁEM:	783	822

• PRODUKCJA GLOBALNA MIKROSADZONEK

ROK	MLN SZTUK SADZONEK
1986	130
1990	390
1993	663
1996	733
1998	822

W tym 90 % to rośliny ozdobne , paprocie , Syngonium , Calathea , Alocasia , Spathiphyllum, Ficus. Syngonium rozmnażane metodą in-vitro ma ładny , zwarty pokrój. Rozmnażane także byliny ogrodowe - ostróżki ( Delphinium ) , hosty ( Funkia ) , żurawki ( Heuchera ) , rośliny wodne , sukulenty , krzewa , drzewa - różaneczniki ( Rhododendron ) , magnolie ( Magnolia ) , powojniki (Clematis ) oraz rośliny cebulowe i bulwiaste.

• LABOLATORIA KOMERCYJNE

• USA - ponad 100

• Europa Zachodnia - 250

• Holandia - 67

• Polska - 40 ( 50 mln sztuk rocznie mikrosadzonek)

• Niemcy - 21

• ROCZNA PRODUKCJA MIKROSADZONEK W LABOLATORIACH IN VITRO W MLN SZTUK

• Europa - 200

• USA - 110

• Indie - 130

Europa i Usa - 70 % rośliny ozdobne , 10-15 % rośliny drzewiaste

Europa - poniżej 1 % warzywa

USA - 10 % warzywa

Indie - ananasy , palmy , bananowce , papaje ( przemysł spożywczy )

• LABOLATORIUM KULTUR TKANKOWYCH

• Pomieszczenie do przygotowywania szkła i pożywek

• Pokój do pracy w warunkach sterylnych

• Pokój do wzrostu kultur

• Pokój do mycia i przechowywania szkła

• Chłodnia w duzych labolatoriach do przechowywania roślin

• Pokój do obserwacji

• Pomieszczenia socjalne i biurowe

• Pomieszczenie do przygotowywania szkła i pożywek - wyposażenie:

• Zlew

• Urządzenie do destylacji wody

• Autoklaw

• Stoły

• Lodówka , zamrażarka

• Szafki na odczynniki i szkło

• Wagi

• Mieszadła magnetyczne

• Kuchenka elektryczna

• pH-metr

• urządzenie dozujące pożywkę

• mikroskop

• Pokój do pracy w warunkach sterylnych

• Stół z laminarnym przepływem powietrza ( filtr HEPA )

• Palnik gazowy

• Urządzenie do sterylizacji narzędzi

• Mikroskop

• Wózki

• Narzędzia: pęsety , skalpele , środki odkażające

• Pokój do wzrostu kultur

• Półki z oświetleniem

• Zegar sterujący oświetleniem i temperaturą

• Klimatyzator

• Ewentualnie wytrząsarka , rotor - do kultur płynnych

• ETAPY ROZMNAŻANIA

• Stadium inicjalne( eksplantaty inicjalne: wierzchołki pędów)

• Namnażanie pędów

• Ukorzenianie pędów

• Aklimatyzacja - przystosowanie roślin do gorszych warunków , aklimatyzujemy stopniowo. Często etap ukorzeniania łączy się z aklimayzacją.

Eksplantat - fragment rośliny umieszczony na specjalnejpozywce w warunkach in vitro

Eksplantat inicjalny - fragment rołśiny wykorzystywany do założenia całej kulury in vitro

• EKSPLANTATY INICJALNE

• merystemy

• wierzchołki pędów

• fragmenty pędów(jeden, dwa węzłami)

• pąki

• fragmenty kwiatostanów/ kwiatów

• fragmenty liści( blaszki liściowe, ogonki liściowe)

• nasiona/ zarodki, siewki

• fragmenty cebul, bulw, kłączy, rozłogów

• fragmenty korzeni

• Przygotowywanie eksplantatów pierwotnych( inicjalnych)

• Przygotowanie rośliny matecznej - jeśli pozyskujemy korzenie to przesadzamy roślinę do warunków bezglebowych , jeśli rośnie w gruncie , przesadzamy do szklarni

• Pobieranie fragmentów roślinnych - fragmenty większe niż ostateczne wykładane na pozywki. Pobieramy w godzinach porannych. Jak najszybciej umieszczamy na pozywce. Ścinając umieszczamy na wilgotnej bibule , można przetrzymać w lodówce

• Odkażanie eksplantatów- umycie w ciepłej wodzie z mydłem , dezynfekcja ( etanol , podchloryn sodu lub wapnia , nadtlenek wodoru ). Odkażania wymagają szczególnie rośliny pokryte włoskami czy woskiem. Dodajemy preparatu zmniejszającego napięcie powierzchniowe. Następnie 3-5 krotne płukanie w sterylnej wodzie.

• RODZAJE POŻYWEK

• Stałe

• Płynne

• Półpłynne

• Dwufazowe - dolna warstwa zestalona , górna płynna

• SKŁAD POŻYWEK

• Sole nieorganiczne: makro i mikroelementy

• Związki organiczne: węglowodany, witaminy, regulatory wzrostu, aminokwasy, hydrolizat kazeiny, substancje zestalające( Agar, Phytagel, Gelrite)

• Pożywka musi mieć określone pH - 5,7-5,8. Wrzosowate wymagaja niższego odczynu. Część pożywek sterylizuje się na zimno a nie w autoklawie.

• Węglowodany

• Sacharoza (najczęściej )

• Maltoza

• Cukry proste: fruktoza, glukoza

• D- mannitol

• D- sorbitol

• Witaminy

• Kw. Nikotynowy

• Inozytol

• Ryboflawina

• Tiamina

• Pirydoksyna

• Regulatory wzrostu

• Auksyny

• Cytokininy

• Gibereliny

• Kw. abscysynowy

• Inne: Tiba, Ancymidol, Paclobutrazol , CDA , TIBA

• Auksyny

• Powodują wzrost wydłużeniowy pędów, indukcję kallusa, stymulują wzrost i podziały kom., tworzenie się pąków przybyszowych; jako zw. stymulujące powstawanie korzeni; stosowane przy procesie somatycznej embriogenezy , w etapie namnażania pędów

• Cytokininy

• Stymulują podziały kom., namnażanie pędów, proliferacji pąków przybyszowych, hamują wydłużanie pędów, wzrost korzeni, procesy starzenia; stosowane głównie na etapie namnażania pędów

• Gibereliny

• Wpływają na wzrost kom., wzrost wydłużeniowy pędów, znoszą spoczynek nasion, zarodków somatycznych, pąków szczytowych i cebulek przybyszowych, hamują wzrost kallusa

• Kwas abscysynowy

• Stymuluje dojrzewanie zarodków somatycznych, tworzenie się cebulek i bulw przybyszowych, ułatwia aklimatyzację, stymuluje spoczynek

• ZAKAŻENIA

• Pierwotne - przy zakładaniu kultury

• Wtórne - w trakcie prowadzenia kultury

• Źródła zakażeń mikrobiologicznych

• Eksplantaty

• Personel

• Niesprawne filtry/ wentylacja

• Niesterylne pożywki

• Niesterylne narzędzia

• Szkodniki

• Warunki pracy personelu

• Mycie rąk , praca w rękawiczkach

• Dezynfekcja ( 70 % etanol )

• Czyste fartuchy

• Praca w czapce, masce

• Praca w głebi komory

• Ograniczenie rozmów

• Szkodniki - źródła

• Materiał roślinny

• Wnoszone przez personel

• Wentylacja

• Zapobieganie zakażeniom

• Czysta odzież

• Zmiana odzieży po wyjściu ze szklarni

• Maty okażające

• Zabezpieczenie kultur folią

• Środki chemiczne

• STERYLIZACJA I ODKAŻANIE

• Pożywki - autoklaw 121 stopni C ; 0,1 MPa ; 15-20 min

• Narzędzia - odkażanie etanolem , opiekanie nad palnikami

2

2