Enzymy modyfikujące DNA

Cezary Smaczniak

Cięcie i łączenie fragmentów DNA są jednymi z pierwszych technik wykorzystywanych w pracowni biologii molekularnej i stanowią podstawę wszystkich doświadczeń rekombinacji DNA. Manipulacje na DNA są przeprowadzane przez zestaw enzymów: restrykcyjne endonukleazy (enzymy restrykcyjne) używane są jako molekularne nożyczki, ligazy DNA łączą razem fragmenty nici DNA a inne enzymy, które modyfikują DNA, ułatwiają zachodzenie całego procesu.

Spis treści

1. Enzymy restrykcyjne 2. Polimerazy 2.1 Polimeraza DNA I E. coli 2.2 Fragment Klenow Polimerazy DNA I E. coli 2.3 Polimeraza DNA T4 2.4 Polimeraza DNA T7 2.5 Terminalna Transferaza 2.6 Termostabilna Polimeraza DNA 3. Inne enzymy modyfikujące DNA 3.1 Nukleazy: DNazy 3.2 Alkaliczna Fosfataza 3.3 Kinaza Polinukleotydowa 4. Źródła

1. Enzymy restrykcyjne

Są to enzymy należące do grupy endonukleaz (czyli enzymów zdolnych do rozcinania DNA w miejscu położonym w środku nici). Znane jest kilka klas restryktaz, lecz największe znaczenie maja enzymy II klasy, zdolne do przecinania DNA w obrębie ściśle określonej sekwencji (składającej się z 4-8 nukleotydów) lub stałej odległości od danej sekwencji. Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne są zwykle palindromami - są jednakowe czytane do końca 3' do 5' jednej nici jak i od końca 3' do 5' drugiej nici. Enzymy restrykcyjne są głównym narzędziem inżynierii genetycznej. Znając sekwencje nukleotydową DNA i mając do dyspozycji kilka tysięcy restryktaz możemy wyciąć w zasadzie dowolny fragment DNA.

2. Polimerazy

2.1 Polimeraza DNA I ''E. coli''

Polimeraza DNA I E. coli jest DNA-zależną polimerazą DNA syntetyzyjąca nić w kierunku od 3' do 5', która posiada także aktywności zarówno 3´ - 5´ jak i 5´ - 3´ egzonukleazy. Jest to jednołańcuchowe białko o masie około 109 kDa, które wymaga magnezu jako kofaktora. Każde z jego trzech aktywności enzymatycznych są rozmieszczone w odrębnych domenach holoenzymu.

Może zostać podzielona na dwa mniejsze fragmenty poprzez traktowanie proteolityczne. Mniejszy fragment o masie 35 kDa posiada aktywność 5´ - 3´ egzonukleazy, natomiast większy znany jest jako fragment Klenow.

• 
  Rysunek 1. Proteoliza holenzymy polimerazy I DNA.

Polimeraza DNA I była często używana na samym początku technologii rekombinacyjnych do radioznakowania DNA i syntetyzowania cDNA. Jednakże okazało się, że inne enzymy są bardziej efektywne w tych celach, włączając proteolityczny fragment polimerazy DNA I zwanej fragmentem Klenow oraz polimerazy DNA faga T4. Holoenzym polimerazy DNA I jest obecnie rzadko używany.

2.2 Fragment Klenow Polimerazy DNA I ''E. coli''

Jest dużym fragmentem powstałym po cięciu proteolitycznym polimerazy DNA I. Poza generowaniem fragmentów Klenow drogą proteolizy może on powstawać u bakterii poprzez ekspresje skróconego genu polimerazy DNA I. Posiada aktywności DNA-zależnej 3' - 5' polimerazy DNA (katalizuje reakcję polimeryzacji DNA na nici matrycowej) oraz 3´ - 5´ egzonukleazy (sprawdza dokładność parowanych zasad i usuwa te, które zostały błędnie sparowane).

Z powodu jego wielofunkcyjnej natury, fragment Klenow posiada dwa różne miejsca aktywne, odległe od siebie o 35 A. Musi on być zdolny do wiązania (przyjmowania) nici matrycowej, primera oraz trifosfonukleotydów - aktywność polimerazy (P) - Domena Nieuporządkowana (Disordered Domain) jest regionem wiążącym DNA. Równie dobrze musi spełniać swoją rolę jako egzonukleaza (E).

• 
  Rysunek 2. Miejsca aktywne fragmentu Klenow polimerazy I DNA.

Funkcje fragmentu Klenow w laboratorium:

• Synteza podwójnej nici DNA z pojedynczej nici matrycowej.

Funkcją polimerazy DNA jest syntetyzowanie nici komplementarnej podczas replikacji DNA. Przeprowadzana powyższa reakcja w laboratorium jest integralna do takich procesów jak synteza drugiej nici DNA w klonowaniu cDNA i tworzenie radioaktywnych sond do reakcji hybrydyzacji.

Polimeraza DNA wymaga primera, aby dostarczyć wolną grupę 3´-OH do inicjacji syntezy. Primery używane w znacznej większości reakcji polimeryzacji w warunkach in vitro są jednoniciowymi fragmentami DNA, zazwyczaj o długości od 6 do 20 zasad. Ten krótki fragment musi być komplementarny do odcinków na matrycowym DNA. Aby użyć fragmentu Klenow do syntezy komplementarnej nici DNA, należy po prostu wymieszać jednoniciową matrycę DNA, primery i enzym w obecności odpowiedniego buforu.

Reakcja, która zachodzi jest przedstawiona poniżej:

• 
  Rysunek 3. Synteza komplementarnej nici DNA przez fragment Klenow.

Rzeczą będącą godną uwagi w powyższej reakcji jest to, że fragment Klenow może napotkać primer, usunąć go i kontynuować syntezę nowej nici DNA.

• Dobudowywanie brakującego fragmentu na końcu 3´ DNA.

Reakcja dobudowywania służy utworzeniu tępych końców na fragmentach stworzonych przez cięcie enzymami restrykcyjnymi, które zostawiają wolne końce 5´. Ta reakcja jest pojęciowo identyczna do tej, która była przedstawiona wcześniej, ale przy użyciu dłuższego primera i bardzo krótkich odcinków jednoniciowej matrycy DNA.

• 
  Rysunek 4. Tworzenie lepkich końców - działalność polimerazy fragmentu Klenow.

• Trawienie "odstających" końców 3´.

Jest to kolejna metoda służąca utworzeniu tępych końców, gdy cięcie nastąpiło w wyniku użycia enzymów restrykcyjnych zostawiających wolne końce 3´. Aktywność 3´ - 5´ egzonukleazy fragmentu Klenow strawi odstające końce. Aktywność polimerazy równoważy aktywność egzonukleazy aż do utworzenia tępych końców.

Rysunek 5. Tworzenie lepkich końców - działalność egzonukleazy fragmentu Klenow.

• Przygotowanie radioaktywnych sond DNA.

W niektórych sytuacjach, aktywność 3´ - 5´ egzonukleazy fragmentu Klenow jest niepożądana. Wprowadzając mutacje w genie kodującym fragment Klenow, można stworzyć różne postacie enzymów, które będą posiadały aktywność polimerazy, lecz pozbawione zostaną aktywności egzonukleazy. Te formy enzymów nazywane są zazwyczaj fragmentami exo- Klenow.

2.3 Polimeraza DNA T4

T4 jest bakteriofagiem atakującym E. coli. Działania polimerazy DNA T4 są bardzo zbliżone do fragmentu Klenow polimerazy DNA I - działa jako 5´ - 3´ polimeraza DNA oraz 3´ - 5´ egzonukleaza, lecz nie posiada aktywności 5´ - 3´ egzonukleazy.

Generalnie, polimeraza DNA T4 używana jest w tych samych typach reakcji, co Klenow, szczególnie w tworzeniu tępych końców. Są jednakże dwie różnice pomiędzy tymi enzymami, które mają praktyczne znaczenie:

• Aktywność 3´ - 5´ egzonukleazy polimerazy DNA T4 jest mniej więcej 200 razy (inne źródło podaje, że 1000 razy) wyższa niż Klenow, czyniąc ją bardziej przydatną dla badaczy przy tworzeniu tępych końców poprzez pozbywanie się końców 3´.

• Kiedy fragment Klenow wypiera dalej położone nukleotydy zastępując je nowymi, polimeraza DNA T4 nie ma takiej możliwości.

2.4 Polimeraza DNA T7

Polimeraza DNA z bakteriofaga T7 posiada aktywności polimerazy DNA oraz 3´ - 5´ egzonukleazy, lecz bak jej domeny posiadającej aktywność 5´ - 3´ egzonukleazy. Jest przy tym bardzo podobna w działaniu do fragmentu Klenow i polimerazy DNA T4.

Mówi się, ze sława polimerazy DNA T7 pochodzi od jej "procesywności", to znaczy, że przeciętna długość DNA zsytezowanego przed dysocjacją enzymu od nici matrycowej jest znacznie większa niż u innych enzymów. W związku z tą właściwością, głównie polimerazę DNA T7 używa się do sekwencjonowania DNA techniką terminacji łańcucha (chain termination technique).

2.5 Terminalna Transferaza

Terminalna Transferaza katalizuje przyłączanie nukleotydów do końca 3´ DNA. Pracuje na pojedynczej nici DNA a także na wolnych końcach 3´ podwójnej nici DNA (sterczących końcach) i jest przykładem polimerazy DNA, która do rozpoczęcia reakcji nie wymaga primerów. Może także przyłączać homopolimery rybonukleotydów do końca 3´ DNA.

Bardziej preferowanym substratem dla tego enzymu są wolne końce 3´, ale także, choć ze zmniejszoną aktywnością, jest w stanie dobudowywać nukleotydy na końcach 3´ tworząc tępe końce. Kobalt jest niezbędnym kofaktorem dla aktywności tego enzymu.

Terminalna Transferaza jest użyteczna w przynajmniej dwóch procedurach:

• Znaczenie 3´ końców DNA.

• 
  Rysunek 6. Działanie terminalnej transferazy.

Najczęściej substratem dla tej reakcji jest fragment DNA utworzony przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, które zostawiają lepkie końce (sterczący koniec 3´ DNA).

• Dodawanie komplementarnych homopolimerycznych ogonów do DNA.

• 
  Rysunek 7. Wklonowywanie cDNA do plazmidu z użyciem terminalnej transferazy.

Ta pomysłowa procedura powszechnie stosowana była w przeszłości do klonowania cDNA w wektorach plazmidowych, ale w dużej mierze została zastąpiona przez inne, bardziej wydajne techniki. Ogólnie rzecz biorąc, terminacyjna transferaza tworzy lepkie końce poprzez dodawanie ogonów do liniowego wektora plazmidowego - poliG a do cDNA - poliC. Podczas inkubacji, komplementarne nukleotydy G i C parują się "wkładając" fragment cDNA do wektora, który następnie jest powielany w E. coli.

2.6 Termostabilna Polimeraza DNA

Termostabilna Polimeraza DNA tak jak inne polimerazy DNA, katalizuje matrycowo-zależną syntezę DNA z trifosfonukleozydów. Primer posiadający wolną grupę 3´-OH jest wymagany do zainicjowania syntezy oraz jon magnezu. Generalnie, enzymy te mają maksymalną aktywność katalityczną w 75 - 80°C, i znacznie obniżają swoją aktywność w niższych temperaturach.

• 
  Rysunek 8. Przykłady termostabilnych polimeraz DNA.

3. Inne enzymy modyfikujące DNA

3.1 Nukleazy: DNazy

Tnie podwójną lub pojedynczą nić DNA. Cięcia pojawiają się głównie przy zasadach pirymidynowych (C lub T), enzym ten jest endonukleazą. Głównymi produktami są: 5´-fosfo di-, tri- i tetranukleotydy.

Niektóre z powszechnych zastosowań DNazy I to:

• Eliminowanie DNA (np. plazmidów) z preparatów RNA

• Analiza oddziaływań DNA-białko przez footprinting w obecności DNaz

• Nacinanie DNA w metodzie "Nick-translation"

Innymi nukleazami do manipulowania DNA są:

• Egzonukleaza III (E. coli)

• Mung Bean Nuclease (Mung bean sprouts)

• Nukleaza BAL 31 (Alteromonas)

• Nukleaza S1 (Aspergillus)

3.2 Alkaliczna Fosfataza

Alkaliczna fosfataza usuwa grupy fosforanowe z końców 5´ DNA i RNA oraz nukleotydów i białek. Enzym ten wykazuje najwyższą aktywność w środowisku zasadowym (alkalicznym; pH>7) - stąd nazwa.

Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z różnych źródeł, które odróżnia między innymi możliwość inaktywacji:

• Bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP) - jest enzymem wykazującym najwyższą aktywność a także najbardziej trwałą (najtrudniej ją zniszczyć) po zakończeniu reakcji defosforylacji.

• Alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - Calf intestinal alkaline phosphatase) - jej źródłem jest jelito wołowe. Jest fosfatazą najczęściej rozpowszechnioną i używaną w laboratoriach biologii molekularnej gdyż wykazuje niewiele niższą aktywność w stosunku do BAP a można ją efektywnie zniszczyć przez trawienie proteolityczne lub termicznie.

• Alkaliczna fosfataza z krewetek (Shrimp alkaline phosphatase) - wywodzi się z krewetek żyjących w zimnych wodach i jest stosunkowo łatwa do zniszczenia termicznego.

Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza używana jest głównie do dwóch zadań:

• Usuwanie grupy 5´fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które uprzednio zostały pocięte przez enzymy restrykcyjne. Działanie to, w późniejszych reakcjach ligacji, zapobiega samołączeniu się wektorów a tym samym wielce ułatwia wstawianie innych fragmentów DNA do wektorów.

• Usuwanie grupy 5´fosforanowej z fragmentów DNA przed znakowaniem radioaktywną grupą fosforanową.

3.3 Kinaza Polinukleotydowa

Jest enzymem, który katalizuje przenoszenie grupy fosforanowej z ATP na końce 5´ zarówno DNA jak i RNA. Jest wytwarzana przez bakteriofaga T4, w przemyśle natomiast otrzymywana jest najczęściej poprzez ekspresję klonowanego genu fagowego w E. coli.

Aktywność enzymatyczna PNK jest wykorzystywana w dwóch typach reakcji:

• W reakcji podstawienia (Forward Reaction), PNK przenosi grupy gamma fosforanowe z ATP na końce 5´ polinukleaotydów (DNA lub RNA). Docelowy nukleotyd nie posiada grupy 5´ fosforanowej gdyż ta została albo wcześniej zdefosforylowana albo była zsyntetyzowana chemicznie.

• W reakcji wymiany (Exchange Reaction), docelowy DNA lub RNA posiadającą grupę fosforanową jest inkubowany z nadmiarem ADP - w tym wypadku, PNK najpierw przeniesie fosforan z kwasu nukleinowego na ADP, tworząc ATP i opuszczając zdefosforylowany cel, a następnie przeprowadzi reakcję podstawienia, czyli przeniesie fosforan z ATP na docelowy kwas nukleinowy.

Rysunek 9. Aktywność enzymatyczna PNK.

---