Replikacja DNA

Replikacja DNA polegająca na powieleniu

genomu jest podstawowym procesem leżącym

u podstawy dziedziczenia

• Replikacja zachodzi w fazie S interfazy
• Synteza nowej nici DNA przebiega zawsze w kierunku 5’ →

3’

• Nowe nukleotydy dołączają się do końca 3’
• Cechą replikacji jest jej

semikonserwatywność – obie nici

stanowią matrycę

Cechy charakterystyczne

•

Jest to proces endoenergetyczny – energia pochodzi z
wiązań wysokoenergetycznych dATP, dGTP, dCTP, dTTP

•

Do replikacji potrzebne są:

Matryca DNA

Trifosforany deoksyrybonukleotydowe

Liczne enzymy

Jony magnezu

Primery

Replikacja jądrowego DNA u Eucaryota rozpoczyna się od
utworzenia widełek replikacyjnych

REPLIKACJA mtDNA

•

W kolistym mtDNA replikacja przebiega według modelu przemieszczającej
się pętli

•

Miejsce rozpoczynające replikację określane jest jako pętla D (D-loop)

•

Jedna z nici służy jako matryca (H), a druga (L), która w tym czasie nie jest
kopiowana, układa się w kształt litery D. Replikacja nici H przebiega przez
pewien czas i w pewnym momencie odsłania się miejsce ori na nici L

•

W następnej kolejności replikowana jest właśnie ta nić, która utworzyła
pętle D.

•

Na całkowitą replikację mtDNA potrzeba około 100 minut.

Białka i enzymy wspomagające

replikację

• POLIMERAZA DNA

– katalizuje reakcje syntezy DNA w kierunku

5’ → 3’.

Kolejne nukleotydy dołączane są do końca 3’.

• Nić wiodąca (3’ → 5’)

– syntezowana jest w sposób ciągły

• Nić opóźniona (5’ → 3’)

– syntezowana jest w sposób

nieciągły

Rodzaje polimerazy DNA u

Eucaryota

• Polimeraza DNA α

–

synteza nici opóźnionej i uzupełnianie przerw po

fragmentach Okazaki. Pełni rolę prymazy.

• Polimeraza DNA β

–

naprawa DNA

• Polimeraza DNA δ

–

synteza nici wiodącej

• Polimeraza DNA ε

–

sprawdzanie poprawności syntezy DNA (posiada

aktywność nukleazową 3’→5’) oraz naprawa DNA

• Polimeraza DNA γ

–

synteza mtDNA

Polimerazy Eucaryota nie mają aktywności nukleazowej 5’ → 3’

olimerazę DNA nie potrafi syntezować DNA de novo. Wymaga obecności

primera do którego będzie dobudowywać kolejne nukleotydy.

• * rolę primera może pełnić oligonukleotyd powstały z

rozpadu DNA (wg Biochemia, E. Bańkowski)

Enzymy replikacyjne

• Helikaza

– rozplata nici DNA. Jest ATP-azą, która rozrywa

wiązania wodorowe między komplementarnymi nićmi DNA.

• Rozwija DNA w kierunku 5’

→ 3’

Enzymy replikacyjne

• Białko SBB

(RPA)(białko wiążące

jednoniciowe DNA) – podąża za
helikazą i stabilizuje rozplątaną
helisę

Enzymy replikacyjne

• Topoizomeraza (gyraza DNA)

– przyłącza się do nici DNA tuż

przed widełkami replikacyjnymi i działa jako połączenie
obrotowe w taki sposób, że tylko krótki fragment nici
zostaje obrócony.

Enzymy replikacyjne

• Prymaza

(aktywowana jest przez helikazę) – syntezuje unikalny

fragment RNA (primer) na nici DNA

• Na nici wiodącej syntezowany jest jeden primer
• Na nici opóźnionej syntezowane jest wiele primerów, dających

początek fragmentom Okazaki

• Primer jest niezbędny do zapoczątkowania syntezy nici DNA przez

polimerazę DNA

• Prymaza Eucaryota zbudowana jest z dwóch podjednostek (mniejsza ma

aktywność polimerazy RNA). U Eucaryota z dwoma podjednostkami

primazy związana jest

polimeraza DNA-α

Enzymy replikacyjne

• RNaza H

– usuwa startery

wytworzone przez prymazę

• Wykazuje aktywność nukleazową

5’→3’

Enzymy replikacyjne

• Ligaza DNA

– łączy fragmenty

Okazaki w jedną nić

Ligaza DNA I

– główny enzym odpowiedzialny za ligację

fragmentów DNA in vivo

• Ligaza DNA II

– procesy naprawy

• Ligaza DNA III

– naprawa DNA i rekombinacja

Wszystkie ligazy wymagają nakładu ATP

Inicjacja

•

Rozpoczyna się zawsze w ściśle określonych miejscach w DNA –

ori

(miejsce inicjacji)

Przyłączenie

białek inicjatorowych

do specyficznych sekwencji DNA w

obrębie ori. Białka te powodują zmianę w strukturze DNA ułatwiającą
utworzenie widełek replikacyjnych oraz regulują przyłączenie się do ori
enzymów replikacyjnych

U człowieka jest 20 000 regionów ori

Nie wszystkie regiony chromosomu ulegają replikacji w tym samym
czasie

Czas trwania replikacji = 5-10h

Inicjacja

• DNA Eucaryota zawiera wiele miejsc ori (u bakterii jest jedno) co

skutkuje znacznie szybszym przebiegiem replikacji

Czas rozpoczęcia replikacji w konkretnych ori zależy od fizycznej
organizacji genomu

• Aktywnie transkrybowane geny zawarte w

euchromatynie

oraz

centromer

ulegają replikacji wcześniej

• Heterochromatyna

telomery

ulegają replikacji później

• Ori ewoluują w czasie rozwoju osobniczego – są szersze we

wczesnym okresie rozwoju i bardziej ograniczone w późniejszych
stadiach rozwojowych.

Inicjacja

• Replikon

– jednostka replikacji

Odcinek DNA z ori oraz wszystkie sekwencje, które do niego przylegają i
replikują się razem z nim ( autonomiczny fragment DNA zdolny do
niezależnej replikacji, ARS)

• Nić 5 → 3’ to nić opóźniona. Jej replikacja przebiega w sposób nieciągły.

Powstają fragmenty DNA nazywane fragmentami Okazaki

• Skąd ta nazwa ?

Nić opóźniona jest zawsze położona dalej od widełek

replikacyjnych niż nić wiodąca.

Inicjacja

•

Miejsca ori składają się z:

Rdzenia – zbudowany z:

- ORE – element rozpoznający miejsce inicjacji
- DUE – element rozplatający DNA
- Element bogaty w pary zasad A=T

► wiązanie białek inicjatorowych

b) Elementów pomocniczych – na które składają się Aux-1 i Aug-2

(funkcja podobna do wzmacniaczy w procesie transkrypcji

Elongacja

• Przyłączona do nici polimeraza DNA dobudowywuje kolejne

nukleotydy do primerów

• Za syntezę nici wiodącej odpowiada kompleks:

Białko PCNA

Polimeraza DNA δ

+ białko RPA

białko PCNA (

antygen jądrowy komórek proliferujących)

jest

ślizgającym się

zaciskiem DNA

i jako białko pomocnicze polimerazy δ

zwiększaja jej wydajność ok. 1000 razy zapobiegając oddzieleniu
polimerazy od DNA.

Za syntezę nici opóźnionej odpowiada

Polimeraza DNA α +

białka dodatkowe

Terminacja

• Terminacja replikacji następuje w momencie ukończenia procesów

przebiegających jednocześnie w różnych miejscach replikujących się
cząsteczek DNA.

• Zakończenie replikacji poszczególnych replikonów kończy się w momencie

zetknięcia się ze sobą widełek replikacyjnych podążających w przeciwnych
kierunkach

Problem z terminacją nici

opóźnionej

• Do syntezy nici opóźnionej konieczne jest dołączenie tuż

przed widełkami replikacyjnymi startera dla nowego
fragmentu Okazaki.

• Przy końcach chromosomu na matrycy DNA brakuje jednak

miejsca do syntezy startera dla ostatniego fragmentu
Okazaki

• Wiąże się to z realnym ryzykiem utraty części DNA

zlokalizowanego przy końcach chromosomów podczas
każdej replikacji ( u bakterii problem nie istnieje bo DNA jest
koliste)

W tej sytuacji z pomocą przybywają

TELOMERY

• Telomery

to krótkie, powtarzalne sekwencje DNA na końcach nici.

Ich długość w obrębie gatunku jest stała, mimo że różnice mogą
występować w różnych chromosomach tego samego gatunku.

• W komórkach ssaków sekwencja to: TTAGGG (heksanukleotyd)
• Funkcja:

1) zapewniają niezmienną długość genomów
2) chronią chromosomy przed łączeniem się z innymi
chromosomami
3) chronią przed działaniem nukleaz

Telomeraza

- odwrotna transkryptaza-

• Jest enzymem rybonukleoproteinowym.
• Początkiem replikacji telomerów jest zawsze końcowa

sekwencja telomeru pozostałego z poprzedniego cyklu
replikacyjnego.

• Telomery ludzkie mają powtarzalną sekwencję 5’ TTAGGG 3’
• Matrycą jest telomerazowy DNA, który tworzy pary zasad z

końcowym fragmentem cząsteczki DNA i przedłuża ją o
krótki odcinek. Następnie jest translokacja.

Telomery

• Na końcu 3’ DNA powstaje nić bogata w G i T

• Na końcu 5’ komplementarnie zostaje

dobudowywana nić bogata w C i A

• Nić bogata w C i A jest zawsze krótsza od nici

bogatej w G i T

Telomery

• Do telomerów przyłączają się też białka hamujące

wydłużanie się telomerów:

TRF1 i TRF2

• Na końcu 3’ telomerów, bogatym w G, znajduje się

niesparowany odcinek łańcucha polinukleotydowego. Bierze
on udział w zabezpieczeniu końca telomeru przez
wytworzenie tzw.

pętli t

Telomery

• TRF2 wiąże się na końcu telomerowego DNA w postaci

oligomeru, a następnie przybliża koniec do leżącego w
pewnym oddaleniu fragmentu DNA

• Stabilizuje to strukturę pętli t dzięki penetracji

jednoniciowego odcinka DNA w podwójną helisę

Telomery

• Dodatkowo końce chromosomów są

chronione

białkową czapeczką

, która

stanowi informację dla układu
naprawczego DNA, że koniec chromosomu
NIE wynika z pęknięcia DNA.

przy braku czapeczki może dojść do

łączenia się ze sobą końców
chromosomów

Telomeraza

• Nie jest aktywna we wszystkich komórkach ssaków
• Pozostaje aktywna tylko w

komórkach rozrodczych

macierzystych

(szpik kostny)

● Chromosomy pozbawione aktywnej telomerazy, skracają się

przy każdej replikacji

● Po wielu podziałach chromosom może być tak skrócony, że

geny przy jego końcach ulegną

degradacji !

Telomeraza

• Zjawisko

skracania się chromosomów

związane jest ściśle ze procesem

starzenia się komórki

• Komórki hodowane in vitro po upływie

odpowiedniego czasu pozostają żywe, ale
przestają się dzieli, co można łączyć ze
skracaniem się telomerów

Telomeraza - nowotwory

• Komórki nowotworowe mają

aktywną

telomerazę

Mają zdolność do nieogranicznonych

podziałów

Mutacja dynamiczna

• Polega na powieleniu fragmentu genu

(zwielokrotnienie liczby sekwencji
trójnukleotydowych)

• Może dotyczyć autosomów lub

chromosomów X

• Prawdopodobną przyczyną tej

mutacji jest zjawisko

poślizgu

polimerazy DNA

podczas replikacji.

Mutacja dynamiczna

• Chorobom tym często towarzyszy

zjawisko

antycypacji

–

prawdopodobieństwo dalszego wydłużania
się obszaru podlegającego ekspansji w
kolejnych rundach

replikacji

ma tendencję

wzrostową, przez co choroba z pokolenia
na pokolenie ujawnia się wcześniej, a jej
objawy są coraz cięższe.

Choroba Huntingtona

• Dziedziczona autosomalnie dominująco
• Pełna penetracja
• Za chorobę odpowiada mutacja genu IT-15,

zlokalizowanego na krótkim ramieniu

chromosomu 4

w regionie 4p16.3

•

• IT-15 koduje białko

huntingtynę

Choroba Huntingtona

• Huntingtyna występuje w cytoplazmie wielu komórek,

również w neuronach

• Jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania transportu

aksonalnego

• Wiąże białka związane z:

- transmisją sygnałów nerwowych
- apoptozą
(aktywność antyapoptotyczna)
- odgrywa rolę w embriogenezie

Choroba Huntingtona

• Choroba je wynikiem zwielokrotnionej liczby powtórzeń

CAG (kodującej glutaminę), na końcu 5’ egzonu genu
kodującego huntingtynę

• Osoby zdrowe mają 10-29 powtórzeń CAG
• Osoby chore mają >36 powtórzeń CAG (korelacja między

>50 liczbą powtórzeń a ujawnieniem się choroby we
wcześniejszym wieku)

• Nieprawidłowa huntingtyna tworzy nierozpuszczalne wtręty

w neuronach

• Brak prawidłowej huntingtyny powoduje obumieranie

neuronów prążkowia

Choroba Huntingtona

- choroba zwyrodnieniowa-

• Dochodzi do zaniku:

- małych neuronów w jądrze ogoniastym
- małych neuronów w skorupie
- dużych neuronów w gałce bladej
* atrofia dotyczy też kory mózgowej

Choroba Huntingtona

• Choroba występuje w 3 postaciach:

a) klasycznej – rozwija się w wieku średnim (około 40 lat)
b) młodzieńczej – przed 20 rokiem życia
c) późnej – po 55 roku życia

• Późne objawy (po 40 r,ż), powodują że osoby nieświadome

choroby zdążą już do tego czasu spłodzić potomstwo i
przekazać zmutowany allel

• choroba utrzymuje się w populacji, mimo że dziedziczy się

w sposób dominujący i jest letalna

• Śmierć w ciągu 10 – 25 lat od momentu wystąpienia

pierwszych objawów

Choroba Huntingtona

- objawy -

• Początkowo objawy są łagodne i często

niezauważalne

- spadek masy ciała (mimo prawidłowej diety)
- zaburzenia osobowości
- zaburzenia pamięci
- problemy z koncentracją, uczeniem się, podejmowaniem
decyzji
- zaburzenia ruchu gałek ocznych (jeden z pierwszych
objawów)

Choroba Huntingtona

- objawy -

• Choroba postępuje:

- hiperkinezy – objawiające się niekontrolowanymi ruchami
pląsawiczymi
- taneczne zaburzenie chodu
- zaburzenia mowy i połykania (mm. gardła)
- postępujące otępienie

• Charakterystyczne objawy w chorobie Huntingtona:

- nie można utrzymać wysuniętego języka
- nie można utrzymać stałego uścisku ręki

Choroba Huntingtona

• W zaawansowanej postaci choroby ruchy pląsawicze ustają,

chory staje się spowolniały i pojawiają się zaburzenia

równowagi (częste upadki, zaburzenie rytmu mowy)

• Występuje zjawisko antycypacji

• Choroba postępuje tym wolniej im:

a) później pojawią się objawy

b) u pacjentów z większą masą ciała

c) u pacjentów bez depresji na początku choroby

• Antycypacja ojcowska

– choroba postępuje szybciej u

mężczyzn którzy odziedziczyli zmutowany gen od ojca

Choroba Huntingtona

• Najczęstsze przyczyny śmierci:

1) Zachłystowe zapalenie płuc

2) Powikłania zatorowo-zakrzepowe
3) Następstwa urazów po wypadkach

►

Istnieje test potwierdzający, czy pacjent jest nosicielem

zmutowanego genu.

Czy warto znać prawdę…?

Zespół FRA X

(zespół Mertina-Bella)

• Zespół łamliwego chromosomu

dziedziczony jest jako cech

dominująca sprzężona z chromosomem X

• Częściej u mężczyzn (1:4000) niż u kobiet (1:8000)
• Występuje tu niepełna penetracja genu, mutacja

dynamiczna oraz antycypacja

• Mutacja genu

FMR1

zlokalizowanego na chromosomie X

• Białko FMRP (produkt powyższego genu) należy do grupy

białek wiążących się z RNA

• W części 5’ genu FMR znajduje się sekwencja złożona z

powtórzeń

CGG

Zespół FRA X

•

Liczba powtórzeń:

- 6-55 u zdrowych osób
- 55-200 u nosicieli bez objawów (premutacja)
- >200 pełna mutacja

• Pełna mutacja wiąże się z hipermetylacją

powtórzeń CGG

• Ten podwyższony stopień metylacji

wraz z obniżoną acetylacją histonów
prowadzi do utraty ekspresji FMR1
i utraty funkcji białka FMRP

Zespół FRA X

• Antycypacja odmateczna

– podczas przekazywania premutacji

następnym pokoleniom liczba CGG wzrasta, gdy premutację
przekazuje matka (liczba CGG się nie zmienia gdy gen jest od
ojca)

• Brak FMRP daje pełen obraz kliniczny w okresie pokwitania
• Białko to reguluje

stabilność, transport oraz translację

neuronalnych cząsteczek mRNA

kodujących białka

zaangażowane w strukturę synaps i ich funkcjonowanie.

• FMRP reguluje proces translacji specyficznych cząsteczek mRNA,

których to ekspresja ma miejsce w wyniku odpowiedzi na aktywację
metabotropowych receptorów glutaminianowych grupy I (mGluRs)
wpływając na procesy związane z regulacją plastyczności synaps. W
przypadku nieobecności białka FMRP przekazywanie sygnału z mGluR
grupy I ulega zwiększeniu, prowadząc do kilku zmian neurologicznych
powiązanych z FRA.

Zespół FRA X

•

Cechy fenotypowe :

- mały obwód głowy, duże jądra, niska masa urodzeniowa
(chłopcy)
- autyzm
- opóźniony rozwój psychoruchowy
- zaburzenia mowy

Zespół FRA X

• U dorosłych mężczyzn:

- deformacja trzewioczaszki (zwiększony
wymiar podłużny, zmniejszony poprzeczny)
- duża żuchwa
- bladoniebieskie tęczówki
- powiększenie jąder
- szerokie ręce i krótkie palce
- napady padaczki
- obniżenie IQ (pełna mutacja IQ ok. 40)
- trudności z rozwiązywaniem problemów

- cechy autystyczne (trzepotanie i gryzienie
rąk, zaburzenia czucia dotyku,
lęk przed nawiązaniem kontaktów
społecznych)

FRA X u kobiet

• U kobiet objawy są znacznie łagodniejsze (przy pełnej

mutacji IQ pozostaje w normie lub wynosi 50-69)

• Podwyższone ryzyko zaburzeń emocjonalnych
• Przedwczesna niewydolność jajników powodująca

ustanie miesiączki przed 40 r.ż.

• U 1/3 występują zmiany w budowie trzewioczaszki,

zaburzenia mowy oraz zaburzenia koncentracji
U części kobiet z pełną mutacją objawy mogą nie wystąpić.
Może to wynikać z

selektywnej inaktywacji nieprawidłowego

chromosomu X

FXTAS

( fragile X-associated tremor/ataxia syndrome)

• U pewnej grupy mężczyzn z premutacją (60-200 powtórzeń

CGG) po 50 r.ż. Pojawiają się problemy neurologiczne.

• Podwyższony poziom transkryptu genu FMR1

Document Outline