DIAGNOSTYKA
DIAGNOSTYKA
MOLEKULARNA
MOLEKULARNA
DIAGNOSTYKA
DIAGNOSTYKA
MOLEKULARNA
MOLEKULARNA
METODY MOLEKULARNE
METODY MOLEKULARNE
PCR
PCR
Hybrydyzacja
Hybrydyzacja
FISH
FISH
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie
ŁAŃCUCHOWA REAKCJA
ŁAŃCUCHOWA REAKCJA
POLIMERAZY
POLIMERAZY
P
P
olimerase
olimerase C
C
hain
hain R
R
eaction (
eaction (PCR
PCR
)
)
Pozwala na powielenie dowolnej
Pozwala na powielenie dowolnej
sekwencji DNA o długości od kilkuset
sekwencji DNA o długości od kilkuset
do kilku tysięcy nukleotydów
do kilku tysięcy nukleotydów
Polega na przeprowadzeniu wielu
Polega na przeprowadzeniu wielu
cykli syntezy kwasu nukleinowego
cykli syntezy kwasu nukleinowego
z wykorzystaniem starterów
z wykorzystaniem starterów
flankujących określony odcinek DNA
flankujących określony odcinek DNA
MECHANIZM REAKCJI
MECHANIZM REAKCJI
CZYNNIKI:
CZYNNIKI:
Matryca DNA
Matryca DNA
Startery (primery)
Startery (primery)
dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów)
dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów)
Polimeraza DNA
Polimeraza DNA
IZOLACJA
IZOLACJA
1.
1.
Przygotowanie próbek krwi, skóry
Przygotowanie próbek krwi, skóry
itd.
itd.
2.
2.
Dezintegracja komórek – TRIZOL,
Dezintegracja komórek – TRIZOL,
Chloroform
Chloroform
3.
3.
Odwirowanie zanieczyszczeń
Odwirowanie zanieczyszczeń
4.
4.
Zamrożenie (- 80
Zamrożenie (- 80
0
0
C)
C)
STARTERY
STARTERY
Starterem
Starterem
nazywany jest oligonukleotyd
nazywany jest oligonukleotyd
zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych,
zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych,
którego sekwencja jest komplementarna z
którego sekwencja jest komplementarna z
badaną matrycą DNA lub RNA. Startery o
badaną matrycą DNA lub RNA. Startery o
długości ponad 18 nukleotydów w sposób
długości ponad 18 nukleotydów w sposób
wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją
wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją
komplementarną, jeśli nawet pojedyncze
komplementarną, jeśli nawet pojedyncze
kopie matrycy zmieszane są z milionami
kopie matrycy zmieszane są z milionami
innych cząsteczek DNA. Koniec 3'
innych cząsteczek DNA. Koniec 3'
przyłączonego startera wyznacza początek
przyłączonego startera wyznacza początek
replikacji DNA.
replikacji DNA.
CYKL PCR
CYKL PCR
1.
1.
Denaturacja DNA (92-96
Denaturacja DNA (92-96
0
0
C)
C)
2.
2.
Przyłączanie starterów do
Przyłączanie starterów do
matrycy (37-72
matrycy (37-72
0
0
C)
C)
3.
3.
Polimeryzacja DNA (72
Polimeryzacja DNA (72
0
0
C
C
)
)
DENATURACJA (> 90
DENATURACJA (> 90
0
0
C)
C)
PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW
PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW
(37-72
(37-72
0
0
C)
C)
Sekwencja du
plikowana
Sekwencja du
plikowana
Starter 1
Starter 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW
WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW
(72
(72
0
0
C)
C)
Sekwencja du
plikowana
Sekwencja du
plikowana
Primer 1
Primer 2
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Polimeraza
Taq DNA
Wolne nukleo
tydy
POWIELONA SEKWENCJA DNA
POWIELONA SEKWENCJA DNA
LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA
LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA
PODCZAS REAKCJI PCR
PODCZAS REAKCJI PCR
Cykle
Liczba łańcuchów
DNA
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
PROFIL TERMICZNY PCR
PROFIL TERMICZNY PCR
DENATURACJA
DENATURACJA
(ok. 1 minuty)
(ok. 1 minuty)
PRZYŁĄCZANIE
PRZYŁĄCZANIE
STARTERÓW
STARTERÓW
(ok. 30 sekund)
(ok. 30 sekund)
POLIMERYZACJA
POLIMERYZACJA
(ok. 30 sekund)
(ok. 30 sekund)
DENATURACJA
DENATURACJA
(ok. 1 minuty)
(ok. 1 minuty)
METODY DIAGNOSTYCZNE
METODY DIAGNOSTYCZNE
OPARTE NA PCR
OPARTE NA PCR
PCR
PCR
PCR MULTIPLEKSOWY
PCR MULTIPLEKSOWY
:
:
Równoczesna amplifikacja kilku
Równoczesna amplifikacja kilku
regionów genomu w jednej probówce
regionów genomu w jednej probówce
stosując różne pary starterów.
stosując różne pary starterów.
(Diagnostyka chorób genetycznych,
(Diagnostyka chorób genetycznych,
wykrywanie mutacji, wykrywanie
wykrywanie mutacji, wykrywanie
czynników zakaźnych)
czynników zakaźnych)
NESTED PCR
NESTED PCR
:
:
Dodanie zestawu nowych (bardziej
Dodanie zestawu nowych (bardziej
swoistych) starterów po
swoistych) starterów po
przeprowadzeniu wstępnej reakcji
przeprowadzeniu wstępnej reakcji
PCR.
PCR.
(Kontrola swoistości reakcji,
(Kontrola swoistości reakcji,
stworzenie sondy molekularnej z
stworzenie sondy molekularnej z
produktu PCR)
produktu PCR)
Real Time PCR
Real Time PCR
:
:
Analiza ilościowa badanego
Analiza ilościowa badanego
fragmentu genomu z
fragmentu genomu z
wykorzystaniem barwników
wykorzystaniem barwników
fluorescencyjnych (np. SYBR Green).
fluorescencyjnych (np. SYBR Green).
Po każdym cyklu barwnik łączy się z
Po każdym cyklu barwnik łączy się z
2-niciowym produktem, dzięki
2-niciowym produktem, dzięki
czemu możliwe jest określenie jego
czemu możliwe jest określenie jego
ilości (w czasie rzeczywistym).
ilości (w czasie rzeczywistym).
PCR-RFLP
PCR-RFLP
Produkt PCR jest poddawany procesowi
Produkt PCR jest poddawany procesowi
cięcia enzymami restrykcyjnymi, w
cięcia enzymami restrykcyjnymi, w
wyniku czego otrzymuje się fragmenty
wyniku czego otrzymuje się fragmenty
DNA różnej długości, które następnie
DNA różnej długości, które następnie
rozdziela się elektroforetycznie.
rozdziela się elektroforetycznie.
Już zmiana pojedynczego nukleotydu w
Już zmiana pojedynczego nukleotydu w
sekwencji rozpoznawanej przez enzym
sekwencji rozpoznawanej przez enzym
(restryktazę) spowoduje, że nie dokona
(restryktazę) spowoduje, że nie dokona
on rozcięcia DNA -> Inny rozkład
on rozcięcia DNA -> Inny rozkład
prążków w żelu .
prążków w żelu .
RT-PCR
RT-PCR
Umożliwia przeprowadzenie PCR-u na
Umożliwia przeprowadzenie PCR-u na
RNA:
RNA:
1 etap to odwrotna transkrypcja
1 etap to odwrotna transkrypcja
(przepisanie informacji z RNA na DNA,
(przepisanie informacji z RNA na DNA,
dzięki enzymowi: odwrotna
dzięki enzymowi: odwrotna
transkryptaza)
transkryptaza)
2 etap to standardowy PCR
2 etap to standardowy PCR
ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR)
ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR)
Stabilizator
(DTT)
Bufor
z jonami
(np. Mg)
Nukleotydy
(dNTP)
Odwrotna
transkryptaza
Wyizolowane
RNA
Mieszanina
RT-PCR
Stała temperatura
(37
0
C) w czasie 30
min.
Nazwa i pochodzenie
Nazwa i pochodzenie
enzymu
enzymu
Jon
Jon
aktywując
aktywując
y
y
Uwagi
Uwagi
Tth
Tth
Polymerase
Polymerase
<-
<- Th
Th
ermus
ermus t
t
hermophilus
hermophilus
Mn++
Mn++
Termostabilna, z jonami
Termostabilna, z jonami
Mg wykazuje aktywność
Mg wykazuje aktywność
polimerazy DNA
polimerazy DNA
MMuLV
MMuLV
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase
<-
<- M
M
oloney
oloney Mu
Mu
rine
rine
L
L
eucemia
eucemia V
V
irus
irus
Mg++
Mg++
najpowszechniej
najpowszechniej
stosowana odwrotna
stosowana odwrotna
Transkryptaza
Transkryptaza
AMV
AMV
Reverse
Reverse
Transcriptase <-
Transcriptase <- A
A
vian
vian
M
M
yeloblastosis
yeloblastosis V
V
irus
irus
Mg++
Mg++
Coraz powszechniej
Coraz powszechniej
stosowana odwrotna
stosowana odwrotna
Transkryptaza
Transkryptaza
Cth
Cth
Polymerase Klenow
Polymerase Klenow
<- Fragment
<- Fragment
C
C
arbohydro
arbohydrot
t
hermus
hermus
h
h
ydrogenoformans
ydrogenoformans
Mg++
Mg++
Stosowana w mieszaninie
Stosowana w mieszaninie
z Taq polimerazą do
z Taq polimerazą do
jednostopniowej
jednostopniowej
reakcji
reakcji
RT-PCR
RT-PCR
ASYMETRYCZNY PCR
ASYMETRYCZNY PCR
:
:
Dodanie pary starterów z których jeden
Dodanie pary starterów z których jeden
zostaje całkowicie zużyty podczas pierwszych
zostaje całkowicie zużyty podczas pierwszych
cykli amplifikacji DNA.
cykli amplifikacji DNA.
(Produkt może być sondą molekularną w
(Produkt może być sondą molekularną w
reakcji hybrydyzacji lub matrycą w reakcji
reakcji hybrydyzacji lub matrycą w reakcji
sekwencjonowania.)
sekwencjonowania.)
AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA
AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA
:
:
Ważna jest tu komplementarność
Ważna jest tu komplementarność
nukleotydów przy końcach 3` primerów,
nukleotydów przy końcach 3` primerów,
ponieważ umożliwia ona elongację DNA przez
ponieważ umożliwia ona elongację DNA przez
polimerazę.
polimerazę.
(Badanie polimorfizmu alleli, punktowych
(Badanie polimorfizmu alleli, punktowych
mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie
mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie
działania substancji mutagennych,
działania substancji mutagennych,
wykrywanie genów sprzężonych z chorobami,
wykrywanie genów sprzężonych z chorobami,
badanie lekooporności mikroorganizmów
badanie lekooporności mikroorganizmów
ELEKTROFOREZA
ELEKTROFOREZA
Elektroforeza kwasów nukleinowych
Elektroforeza kwasów nukleinowych
obecnie przeprowadzana jest
obecnie przeprowadzana jest
głównie na żelach agarozowym i
głównie na żelach agarozowym i
akryloamidowym oraz w tzw.
akryloamidowym oraz w tzw.
płynnych (nisko
płynnych (nisko
spolimeryzowanych) żelach
spolimeryzowanych) żelach
akryloamidowych w kapilarach.
akryloamidowych w kapilarach.
ANALIZA PRODUKTÓW PCR
ANALIZA PRODUKTÓW PCR
JAK DZIAŁA?
JAK DZIAŁA?
DNA nałożony na żel agarozowy
DNA nałożony na żel agarozowy
zachowuje się jak ujemnie
zachowuje się jak ujemnie
naładowana cząsteczka o dużej
naładowana cząsteczka o dużej
masie. Wędruje w kierunku
masie. Wędruje w kierunku
anody (bieguna dodatniego), a
anody (bieguna dodatniego), a
migracja jest hamowana przez sieć
migracja jest hamowana przez sieć
agarozową proporcjonalnie do
agarozową proporcjonalnie do
wielkości cząsteczki DNA.
wielkości cząsteczki DNA.
ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA
ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA
Jest powszechnie, chociaż niesłusznie
Jest powszechnie, chociaż niesłusznie
uważana za bardziej precyzyjną od
uważana za bardziej precyzyjną od
agarozowej oraz (słusznie) za tańszą.
agarozowej oraz (słusznie) za tańszą.
Zaletami tego podłoża są niskie
Zaletami tego podłoża są niskie
koszta oraz możliwość wybarwiania
koszta oraz możliwość wybarwiania
rozdzielonych frakcji DNA poprzez
rozdzielonych frakcji DNA poprzez
srebrzenie, które daje wyraźne,
srebrzenie, które daje wyraźne,
widoczne gołym okiem i trwałe
widoczne gołym okiem i trwałe
obrazy
obrazy
.
.
ŻELE AKRYLOAMIDOWE
ŻELE AKRYLOAMIDOWE
Barwienie żeli
Barwienie żeli
może
może
być
być
przeprowadzane za pomocą bromku
przeprowadzane za pomocą bromku
etydyny lub innego, podobnego
etydyny lub innego, podobnego
barwnika (np. SYBR Gold, który jest o
barwnika (np. SYBR Gold, który jest o
wiele czulszy lecz znacznie droższy),
wiele czulszy lecz znacznie droższy),
natomiast w przypadku elektroforezy
natomiast w przypadku elektroforezy
kapilarnej szczególnie popularne jest
kapilarnej szczególnie popularne jest
wielokolorowe barwienie
wielokolorowe barwienie
fluorescencyjne, wykorzystujące
fluorescencyjne, wykorzystujące
wzbudzoną laserem fluorescencję
wzbudzoną laserem fluorescencję
wbudowanych w łańcuch DNA
wbudowanych w łańcuch DNA
fluorochromów.
fluorochromów.
PODSUMOWANIE:
PODSUMOWANIE:
PCR umożliwia kopiowanie DNA startując
PCR umożliwia kopiowanie DNA startując
z b małych ilości.
z b małych ilości.
Reakcja opiera się na cyklicznych
Reakcja opiera się na cyklicznych
zmianach temperatury środowiska
zmianach temperatury środowiska
reakcyjnego.
reakcyjnego.
Polimeraza DNA amplifikuje (kopiuje) DNA
Polimeraza DNA amplifikuje (kopiuje) DNA
przy współudziale starterów.
przy współudziale starterów.
Wyniki otrzymujemy najczęściej z
Wyniki otrzymujemy najczęściej z
wykorzystaniem elektroforezy.
wykorzystaniem elektroforezy.
HYBRYDYZACJA
HYBRYDYZACJA
Wykorzystuje sondy molekularne
Wykorzystuje sondy molekularne
(kwas nukleinowy o określonej
(kwas nukleinowy o określonej
sekwencji), będące odcinkami
sekwencji), będące odcinkami
komplementarnymi do szukanych
komplementarnymi do szukanych
fragmentów genomu.
fragmentów genomu.
Technika, która pozwoliła na wierne
Technika, która pozwoliła na wierne
przeniesienie DNA z żelu na podłoże
przeniesienie DNA z żelu na podłoże
umożliwiające wykonanie hybrydyzacji, nosi
umożliwiające wykonanie hybrydyzacji, nosi
nazwę
nazwę Southern blot
Southern blot
. Nazwa tej techniki
. Nazwa tej techniki
pochodzi od nazwiska jej wynalazcy, E.M.
pochodzi od nazwiska jej wynalazcy, E.M.
Southerna, oraz od pomysłu polegającego
Southerna, oraz od pomysłu polegającego
na wykorzystaniu zjawiska włosowatości dla
na wykorzystaniu zjawiska włosowatości dla
wymuszenia wędrówki DNA, podobnie jak
wymuszenia wędrówki DNA, podobnie jak
przy wciąganiu plamy wody przez bibułę.
przy wciąganiu plamy wody przez bibułę.
Biolodzy molekularni szybko nazwali
Biolodzy molekularni szybko nazwali
transfer rozdzielonego elektroforetycznie
transfer rozdzielonego elektroforetycznie
RNA -
RNA - Northern blot
Northern blot
, a transfer białka -
, a transfer białka -
Western blot
Western blot
.
.
HYBRYDYZACJA
HYBRYDYZACJA
METODĄ SOUTHERN BLOT
METODĄ SOUTHERN BLOT
Mikromacierz
nylonowa
8 x 12 cm
Mikromacierz
nylonowa
(powiększenie)
4 x 5 mm
Nowoczesne
mikromacierze
Powiększeni
e
SONDY MOLEKULARNE
SONDY MOLEKULARNE
SONDY MOLEKULARNE
SONDY MOLEKULARNE
HYBRYDYZACJA
HYBRYDYZACJA
in situ
in situ
(FISH)
(FISH)
Pozwala zlokalizować sekwencję
Pozwala zlokalizować sekwencję
kwasu nukleinowego w komórce lub
kwasu nukleinowego w komórce lub
odpowiednim rejonie chromosomu.
odpowiednim rejonie chromosomu.
Znakomita większość sond
Znakomita większość sond
wykorzystywanych w metodzie FISH
wykorzystywanych w metodzie FISH
znakowana jest bezpośrednio
znakowana jest bezpośrednio
fluorochromem. Najczęściej
fluorochromem. Najczęściej
stosowanymi fluorochromami są
stosowanymi fluorochromami są
fluoresceina (FITC), rodamina,
fluoresceina (FITC), rodamina,
czerwień teksańska (Texas Red) i
czerwień teksańska (Texas Red) i
Aqua (DEAC).
Aqua (DEAC).
Obraz
chromosomów
komórek linii raka
prostaty
Metoda M-FISH
Hybrydyzacja
in situ multipleksowa
Hybrydyzacja
Hybrydyzacja
in situ
in situ
genu
genu
Pax3
Pax3
(zarodek myszy)
(zarodek myszy)
Hybrydyzacja
Hybrydyzacja
in situ
in situ
gadzich
gadzich
komórek wątroby
komórek wątroby
(wykrywanie adenowirusów)
(wykrywanie adenowirusów)
SEKWENCJONOWANIE
SEKWENCJONOWANIE
Polega na określeniu sekwencji nukleotydów w
Polega na określeniu sekwencji nukleotydów w
łańcuchu DNA
łańcuchu DNA
Metoda chemiczna
Metoda chemiczna
– chemiczne
– chemiczne
rozszczepianie
rozszczepianie
kolejnych
kolejnych
nukleotydów
nukleotydów
badanego
badanego
fragmentu DNA.
fragmentu DNA.
Metoda enzymatyczna (Sangera)
Metoda enzymatyczna (Sangera)
–
–
synteza komplementarnej nici DNA
synteza komplementarnej nici DNA
na matrycy wykorzystująca system
na matrycy wykorzystująca system
znakowania trójfosforanów czterech
znakowania trójfosforanów czterech
dideoksynukleotydów
dideoksynukleotydów
fluorochromami w czterech różnych
fluorochromami w czterech różnych
kolorach oraz PCR, są 3 warianty:
kolorach oraz PCR, są 3 warianty:
1.
1. Dye Primer Sequencing
Dye Primer Sequencing
- przeprowadza się cztery
- przeprowadza się cztery
niezależne reakcje PCR z czterema porcjami
niezależne reakcje PCR z czterema porcjami
primera, każda porcja znakowana jest
primera, każda porcja znakowana jest
fluorochromem w innym kolorze. Produkty
fluorochromem w innym kolorze. Produkty
czterech reakcji miesza się i analizuje wspólnie.
czterech reakcji miesza się i analizuje wspólnie.
2.
2. Cycle Sequencing
Cycle Sequencing
- startuje się z bardzo małą
- startuje się z bardzo małą
ilością DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po
ilością DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po
każdej denaturacji termicznej uzyskuje się coraz
każdej denaturacji termicznej uzyskuje się coraz
dłuższy łańcuch zakończony znakowanym
dłuższy łańcuch zakończony znakowanym
nukleotydem.
nukleotydem.
3.
3. Dye Terminator Sequencing
Dye Terminator Sequencing
- używa się mieszanki
- używa się mieszanki
nie znakowanych trójfosforanów nukleotydów i
nie znakowanych trójfosforanów nukleotydów i
znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów.
znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów.
Była stosowana przez konkurujące zespoły
Była stosowana przez konkurujące zespoły
naukowe które z sukcesem zakończyły
naukowe które z sukcesem zakończyły
sekwencjonowanie genomu człowieka.
sekwencjonowanie genomu człowieka.
Starter komplementarny do matrycy DNA
3’
5’
5’
3’
GCCTAGGGTTTGCGCTAC
Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA
CGGATCCCAAACGCGATG
CAGGCATGCAATGACC
Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
ddCTP
ddTTP
ddATP
ddGTP
Terminatory
znakowane
fluorescencyjnie
dd
G
GTdd
C
Gdd
T
GTCCdd
G
GTCdd
C
GTCCGdd
T
GTCCGTdd
A
GTCCGTACdd
G
GTCCGTAdd
C
GTCCGTACGdd
T
GTCCGTACGTdd
T
GTCCGTACGTTdd
A
GTCCGTACGTTAdd
C
GTCCGTACGTTACdd
T
GTCCGTACGTTACTdd
G
GTCCGTACGTTACTGdd
G
Lase
r
Detektor
Rozdział produktów reakcji w
automatycznym sekwenatorze
Metoda
Metoda
Sangera
Sangera
Typowe obrazy wyświetlane
Typowe obrazy wyświetlane
przez sekwencjonometr
przez sekwencjonometr
-
=
=
*
*
=
=
-