Diagnostyka molekularna w medycynie 

 
 

Wydział Lekarski II rok 
Osoba prowadząca: Dr n.biol. Anna Wawrocka 
 
Diagnostyka molekularna chorób genetycznych 

  Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami biologii 

molekularnej. 

 

   Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe. 

 

   Molekularne  badania  diagnostyczne  pozwalają  na  szybką  weryfikację  rozpoznania  klinicznego  i 

stanowią nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych genetycznie.  

 
Izolacja DNA 

-  pełna krew obwodowa (limfocyty) 
-   komórki płynu owodniowego (AFC) 

-   komórki kosmówki (CVS) 
-   hodowle fibroblastów 

-   komórki epitelialne 
-   cebulki włosów 

-   plamy krwi, nasienia 
-   fragmenty tkanek 

-   szpik kostny 
 

Metody izolacji DNA: 

1.  Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów 
2.  Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek 
3.  Izolacja DNA poprzez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA 

Izolacja DNA z krwi obwodowej – metodą wysalania białek 
Etapy: 
1.  Liza komórek bezjądrzastych 
2. Liza leukocytów 
3. Odbiałczanie 
4. Wytrącanie DNA alkoholem 
 
Hybrydyzacja (renaturacja) –  
Tworzenie  podwójnej  helisy  między  komplementarnymi  niciami  DNA  lub  RNA  pochodzącymi  z  różnych 
źródeł.  Oddziaływanie  badanego  fragmentu  DNA  i  sondy  molekularnej  prowadzi  do  utworzenia  hybrydu 
(dupleksu) o dwuniciowej strukturze. 
Metody hybrydyzacji molekularnej: 
-Southern Blotting, 
-DNA fingerprinting, 
-Northern blotting, 
-In situ hybridization (FISH). 
 
Sondą molekularną mogą być: 
-syntetyczne oligomery 
-syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty 
-cDNA 
-fragmenty chromosomów 
-całe genomy bakteryjne   
Sonda  molekularna  musi  być  zdenaturowana  (jednoniciowa).  Łączenie  sondy  molekularnej  z  docelowym 
fragmentem kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad. 
Sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.

 

 

 
 
 

Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) –  
Stosowana  najczęściej,  dotyczy  hybrydyzacji  DNA-DNA.  Ma  na  celu  wyszukanie  sekwencji  DNA  spośród 
mieszaniny fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi. 
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć: 
- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz (Dystrofia mięśniowa Duchenne’a) 
-mutacje  punktowe,  które  tworzą  nowe  lub  zmieniają  dotychczasowe  miejsce  restrykcyjne  dla  enzymu, 
stosowanego do trawienia DNA 
 
Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization) – dotyczy hybrydyzacji RNA pacjenta 
z sondą molekularną.  Stosowana w celu badania ekspresji genów. 

 

 
DNA Fingerprinting 
W  metodzie  tej  wykorzystuje  się  obecność  w  genomie  polimorficznych  sekwencji  powtórzonych  VNTR 
(variable number of tandem repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR 
z  sondami  molekularnymi  rozpoznającymi  jednocześnie  kilkanaście  loci  otrzymuje  się  dla  każdego  osobnika 
charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny 
Zastosowanie: 
-ustalanie ojcostwa 
-badania medyczno-sądowe 
 
PCR- (ang.polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy 

  Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów. 
  Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.  
  Nagroda Nobla z chemii w 1993r. 
  Reakcja  ta  odzwierciedla  naturalny  proces  replikacji  i  umożliwia  w  warunkach  in  vitro  szybkie 

powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej 
transkrypcji). 

  Badana  sekwencja  DNA  jest  powielana  przy  użyciu  pary  oligonukleotydowych  starterów,  z  których 

każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA. Startery te są wydłużane w 
kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA  

  W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:  

       - denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,  
       - wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,  

- synteza nici komplementarnej 68-72°C 
  Wizualizacja  produktów  PCR  następuje  poprzez  rozdział  elektroforetyczny.  Cząsteczki  DNA 

umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich 
szybkość  zależy  od  wielkości  cząsteczki  –  im  mniejsze  tym  szybciej  będą  się  przesuwały  w  żelu. 
Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem 
UV. 

 

PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)  
Analiza  polimorfizmu  długości  fragmentów  restrykcyjnych.  Polega  ona  na  amplifikacji  fragmentu  DNA,  w 
obrębie którego występuje  marker RFLP (fragment  DNA  zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego 
trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym. 
Zastosowanie: 
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny 
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia 
 
Multipleks PCR 

  jednorazowo można amplifikować  

ok.10 markerów 

  można badać DNA zmieszany  

i zdegradowany 

 
Zastosowanie: duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje 
 
Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide) 

  polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną  

dla  produktu PCR  

  sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany 

 
Zastosowanie: 
wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych 
Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza  
 
MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR) 

  Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA 
  Dwusiarczyn sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl 
  W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym 

Porównanie próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia metylację 
cytozyny 

  PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i 

niemetylowanej. 

 
Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS) 
U  podstaw  patogentycznych  PWS  znajduje  się  regulacja  ekspresji  genów  nazywana

 

  rodzicielskim  piętnem 

genomowym. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu 15 pochodzącym od 
ojca, które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15 pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w 
tym samym cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.  
 
Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS: 
Kontrola- obecność kopii matczynej i ojcowskiej 
PWS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej 
AS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej 
 
Sekwencjonowanie DNA, główne metody 

  Metoda enzymatyczna – polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA 

 

  Metoda chemiczna – znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi dla 

poszczególnych zasad 

 

Sekwencjonowanie DNA, metodą enzymatyczną 

  Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r. 

 

  Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2’3’-dideoksynukleozydotrifosforanów 

(ddNTP). Wbudowanie ddNTP (terminatora) powoduje zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T. 
W każdej reakcji stosowany jest tylko jeden nukleotyd terminujący. 

 
QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction) 

  QF-PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji chromosomowych). 

Jest to ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y. 

  Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats) 

 

  Rutynowo źródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na drodze 

amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży 

 

  Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa się za 

pomocą sekwenatora kapilarnego 

 

 

PCR w czasie rzeczywistym – (ang. Real Time PCR)  

  Metoda ilościowa oparta na amplifikacji DNA in vitro- opiera się na pomiarze liczby kopii DNA, przez 

pomiar fluorescencji 

 
Zastosowania aplikacji real-time PCR:  
 

  Ilościowe określanie ekspresji genów  
  Testowanie stabilności genetycznej  
  Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków  
  Ilościowe określanie DNA wirusowego  

  Detekcja patogenów  
  Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna)  
  Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie  
  Obrazowanie in vivo procesów komórkowych  
  Studia nad DNA mitochondrialnym  
  Detekcja metylacji  
  Detekcja inaktywacji chromosomu X  
  Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych  
  Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych  
  Wykrywanie mikrodelecji  

 
Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje 

  Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji - 
  mikromacierze do badania ekspresji genów  

  najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA  
  mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)  
  mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-do badania ekspresji obszarów 

pozagenowych  

  mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)- badanie ekspresji różnych form 

splicingowych tego samego genu 

  mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)  

  mikromacierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA 

 
Mikromacierze typu SNP 

  Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym eksperymencie nawet 

kilkuset mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób genetycznych.  

 

  Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych oraz oceny 

ryzyka rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.  

 
Mikromacierze ekspresyjne 
 

  Przykłady zastosowań  

 

  Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:  

  w środowisku (np. podanie leku)  
  w genotypie (np. obecność transgenu) 

 

  Znajdowanie genów, których ekspresja różni się  

  między tkankami  
  podczas rozwoju  
  w tkance chorej i zdrowej  
  między gatunkami.