Diagnostyka molekularna w medycynie
Wydział Lekarski II rok
Osoba prowadz
ąca: Dr n.biol. Anna Wawrocka
Diagnostyka molekularna chorób genetycznych
Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami
biologii molekularnej.
Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe.
Molekularne badania diagnostyczne pozwalają na szybką weryfikację rozpoznania
klinicznego i stanowią nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych
genetycznie.
Izolacja DNA
-
pełna krew obwodowa (limfocyty)
-
komórki płynu owodniowego (AFC)
-
komórki kosmówki (CVS)
-
hodowle fibroblastów
-
komórki epitelialne
-
cebulki włosów
-
plamy krwi, nasienia
-
fragmenty tkanek
-
szpik kostny
Metody izolacji DNA:
1.
Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów
2.
Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek
3.
Izolacja DNA poprzez zastosowanie gotowych zestawów dostępnych komercyjnie
Izolacja DNA z krwi obwodowej – metod
ą wysalania białek
Etapy:
1.
Liza komórek bezjądrzastych
2. Liza leukocytów
3. Odbiałczanie
4. Wytrącanie DNA alkoholem
PCR- (ang.polymerase chain reaction) reakcja ła
ńcuchowa polimerazy
Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i
funkcji genów.
Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.
Nagroda Nobla z chemii w 1993r.
Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro
szybkie powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu
reakcji odwrotnej transkrypcji).
Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z
których każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA. Startery te
są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA
W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:
- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,
- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,
- synteza nici komplementarnej 68-72°C
Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA
umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej
elektrody, a ich szybkość zależy od wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się
przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są
widoczne po naświetleniu światłem UV.
PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Polega ona na amplifikacji fragmentu
DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne),
a następnie jego trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia
Multipleks PCR
jednorazowo można amplifikować
ok.10 markerów
można badać DNA zmieszany
i zdegradowany
Zastosowanie: duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje
Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide)
polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną
dla produktu PCR
sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany
Zastosowanie:
wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych
Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza
MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR)
Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA
Dwusiarczyn sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl
W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym
Porównanie próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia
metylację cytozyny
PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i
niemetylowanej.
Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS)
U podstaw patogentycznych PWS znajduje się regulacja ekspresji genów nazywana
rodzicielskim
piętnem genomowym. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu
15 pochodzącym od ojca, które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15
pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w tym samym cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od
matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.
Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS:
Kontrola- obecność kopii matczynej i ojcowskiej
PWS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej
AS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej
Sekwencjonowanie DNA, główne metody
Metoda enzymatyczna – polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA
Metoda chemiczna – znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi
dla poszczególnych zasad
Sekwencjonowanie DNA, metod
ą enzymatyczną
Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r.
Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2’3’-
dideoksynukleozydotrifosforanów (ddNTP). Wbudowanie ddNTP (terminatora) powoduje
zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T. W każdej reakcji stosowany jest tylko jeden
nukleotyd terminujący.
Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. Net Generation Sequencing)
Pozwala na sekwencjonowanie setek milionów lub miliardów par zasad za jednym zamachem
(exom sequencing – sekwencjonowanie całego exomu- wszystkich sekwencji kodujących
genomu)
• Umożliwia sekwencjonowanie złożonej mieszaniny DNA
• Zazwyczaj generuje stosunkowo krótkie sekwencje
• Obróbka i składanie sekwencji wymagają dedykowanych programów i dużej mocy
obliczeniowej
• W praktyce od 2005 roku, cały czas testowane nowe rozwiązania
QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction)
QF-PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji
chromosomowych). Jest to ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y.
Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats)
Rutynowo źródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na
drodze amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży
Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa
się za pomocą sekwenatora kapilarnego
MLPA (ang. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification)
“Analiza ilościowa typu Multiplex wielu genów jednocześnie”, Detekcja zmian liczby kopii 45
genomowych sekwencji DNA w jednej, prostej do przeprowadzenia reakcji PCR.
-Minimum 20 ng ludzkiego DNA lub 10-120 ng RNA
-Analiza częściowo zdegradowanego DNA
DNA ze skrawków parafinowych
Tkanek w formalinie
Płodowy DNA uzyskany z plazmy krwi matczynej.
-Rozróżnienie sekwencji które różnią się pojedynczym nukleotydem, detekcja znanych mutacji
oraz SNP (delecji lub duplikacji ale nie substytucji)
- metoda stosowana głównie do wykrywania delecji oraz duplikacji DNA
Hybrydyzacja (renaturacja) –
Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z
różnych źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do
utworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).
Sondą molekularną mogą być:
-syntetyczne oligomery
-syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty
-cDNA
-fragmenty chromosomów
-całe genomy bakteryjne
Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje
Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji -
mikromacierze do badania ekspresji genów
najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA
mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)
mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-do badania ekspresji obszarów
pozagenowych
mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)- badanie ekspresji różnych
form splicingowych tego samego genu
mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)
mikromacierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA
Mikromacierze typu SNP
Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym
eksperymencie nawet kilkuset mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób
genetycznych.
Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych
oraz oceny ryzyka rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.
Mikromacierze ekspresyjne
Przykłady zastosowa
ń
Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:
w środowisku (np. podanie leku)
w genotypie (np. obecność transgenu)
Znajdowanie genów, których ekspresja różni się
między tkankami
podczas rozwoju
w tkance chorej i zdrowej
między gatunkami.