Rozdział 1. Dlaczego klonowanie genów
i analiza DNA są istotne.
Podstawowe założenie zasad ustanowionych przez Grzegorza Mendla jest takie, że każda
dziedziczna właściwość organizmu jest kontrolowana przez czynnik zwany genem, który
jest fizyczną cząsteczką, obecną gdzieś w komórce. Ponowne odkrycie praw mendlowskich
w 1990. daje początek genetyce, nauce mającej na celu zrozumienie, czym geny właściwie
są i jak dokładnie funkcjonują.
1.1 Wczesny rozwój genetyki.
Geny znajdują się na chromosomach – zaproponowano w 1903. i poparto eksperymentalnie
w 1910, następnie odkryto technikę mapowania genu, a do końca 1922 stworzono
wyczerpującą analizę względnych pozycji ponad 2000 genów na czterech chromosomach
muszki owocowej, Drosophila melanogaster.
Niestety, do 1940s, nie rozumiano molekularnej natury genów. Przed 1952. nikt nie wierzył,
że kwas deoksyrybonukleotydowy stanowi materiał genetyczny – sądzono do tej pory, że
geny są zrobione z białek.
W latach 1952-1966, miał miejsce drugi wielki okres dla genetyki, gdy odkryto rolę DNA.
Wyjaśniono strukturę kwasu deoksyrybonukleinowego, złamano kod genetyczny i opisano
proces transkrypcji i translacji.
1.2 Pojawienie się klonowania genów i reakcji łańcuchowej polimerazy.
Po czasach odkryć, nastąpiło uśpienie i czas zawodu. Genetycy wiedzieli, że pewne
fundamentalne podstawy molekularne nie są jeszcze rozumiane. Panowała frustracja, że
techniki eksperymentalne lat 1960s, nie były do tego stopnia zaawansowane, żeby móc
badać szczegóły dotyczące genów.
Lata 1971-1973 przyniosły rewolucję w biologii molekularnej. Pojawiły się nowe metody,
pozwalające z sukcesem przeprowadzić niektóre eksperymenty, które wcześniej nie były
możliwe. Były one związane z technologią rekombinacji DNA i inżynierią genetyczną a ich
rdzeń stanowiło klonowanie genów, dające początek kolejnemu wspaniałemu okresowi dla
genetyki. Metody te doprowadziły do gwałtownego i wydajnego sekwencjonowania DNA, co
pozwoliło ustalić struktury indywidualnych genów, osiągając kulminację na przełomie wieku,
gdy pojawiły się liczne projekty sekwencjonowania genomu, między innymi genomu
ludzkiego – ukończone w 2000.
Rozpoczęto badania regulacji poszczególnych genów, które pozwoliły zrozumieć, jak
aberracje w aktywności genów, skutkują pojawieniem się u człowieka chorób, między innymi
nowotworów.
Techniki przyczyniły się do pojawienia się nowoczesnej biotechnologii, która wykorzystywała
geny do produkcji białek i innych cząsteczek, potrzebnych w medycynie i procesach
przemysłowych.
Kary Mullis, w 1980s wynalazł reakcję łańcuchową polimerazy PCR, która stanowiła idealne
dopełnienie technik klonowania genów. PCR ułatwił wiele możliwych, ale trudnych i
czasochłonnych do przeprowadzenia procesów. Dzięki PCR pojawiły się nowe zastosowania
analizy DNA w dziedzinach medycyny, rolnictwa i biotechnologii. Wraz z pojawieniem się
PCR, wystartowały nowe dyscypliny, takie jak: archeogenetyka, ekologia molekularna,
kryminalistyka w oparciu o analizę DNA. Pozwalały one odpowiadać na pytania o ewolucję
człowieka, wpływ zmian środowiskowych na biosferę i działać przeciwko przestępstwom.
1.3 Czym jest klonowanie genów?
1)
Fragment DNA, zawierający gen, który chcemy klonować, jest włączany do kolistej
cząsteczki DNA, zwanej wektorem, w celu utworzenia rekombinowanej cząsteczki
DNA.
2)
Wektor transportuje gen do komórki gospodarza, którą zwykle stanowi komórka
bakteryjna, ale także inne typy żywych komórek mogą być używane.
3)
Wewnątrz komórki gospodarza, wektor ulega powieleniu, co skutkuje otrzymaniem
licznych kopii, nie tylko cząsteczki samego wektora, ale także genu, który jest przez
niego przenoszony.
4)
Gdy komórka gospodarza się dzieli, kopie rekombinowanych cząsteczek DNA, są
przekazywane do komórek potomnych, gdzie także wektor ulega replikacji.
5)
Po dużej liczbie podziałów, powstaje kolonia lub klon komórek identycznych do
komórek gospodarza. Każda komórka w klonie, zawiera jedną lub więcej kopii
rekombinowanej cząsteczki DNA.
Mówimy, że gen niesiony przez rekombinowaną cząsteczkę DNA, jest teraz
sklonowany.
1.4 Czym jest PCR?
Reakcja łańcuchowa polimerazy, bardzo różni się od klonowania genów. Jest
przeprowadzana w pojedynczej probówce, przez zmieszanie DNA z zestawem reagentów
i umieszczenie w termocyklerze, nie angażując serii manipulacji na żywych komórkach, jak
jest to w przypadku klonowania. Termocykler to urządzenie, które pozwala na inkubację
mieszaniny reakcyjnej w serii różnych temperatur, które zmieniają się w zaprogramowany
sposób.
Przebieg reakcji PCR:
1)
Mieszanina jest ogrzewana do temperatury 94°C, w której wiązania wodorowe,
trzymające razem dwie nici dupleksu DNA są niszczone, powodując, że cząsteczka
ulega denaturacji.
2)
Mieszanina jest chłodzona do 50-60°C. Dwie nici każdej cząsteczki, mogą się
z powrotem połączyć w tej temperaturze, ale większość nie, ponieważ mieszanina
zawiera znaczny nadmiar krótkich cząsteczek DNA, zwanych oligonukleotydami lub
starterami, które stapiają się z cząsteczkami DNA w specyficznych pozycjach.
3)
Temperatura jest podnoszona do 74°C. Jest ona odpowiednia dla pracy polimerazy
DNA Taq, która także obecna jest w mieszaninie. Enzym przyłącza się na końcu
każdego ze starterów i syntetyzuje nowe nici DNA, komplementarne do cząsteczki
matrycy DNA. Mamy na tym etapie cztery nici DNA, zamiast dwóch, z którymi
rozpoczynaliśmy.
4)
Temperatura jest podnoszona do z powrotem do 94°C. Dwuniciowe cząsteczki DNA, z
których każda składa się z nici pochodzącej z oryginalnej cząsteczki i nowej nici DNA,
ulegają denaturacji do pojedynczych nici. Tutaj rozpoczyna się drugi cykl
denaturacja-stapianie-elongacja, na końcu którego, uzyskujemy osiem nici DNA.
Przez powtórzenie cyklu 30 razy, dwuniciowa cząsteczka, od której rozpoczęliśmy,
jest konwertowana w ponad 130 milionów nowych dwuniciowych cząsteczek,
będących kopią regionu wyjściowej cząsteczki, flankowanego przez miejsca stapiania
dwóch starterów.
1.5 Dlaczego klonowanie genów i PCR są takie ważne.
Zarówno klonowanie genów, jak i PCR to proste procedury. Dlaczego w takim razie są tak
istotne w biologii? Dlatego głównie, że obie techniki, pozwalają uzyskać czystą próbkę
indywidualnego genu, odseparowanego od wszystkich innych genów w komórce.
1.5.1 Otrzymywanie czystej próbki genu przez klonowanie.
Fragment DNA, który chcemy klonować, jest jednym z wielu, w mieszaninie fragmentów,
z których każdy stanowi sekwencję genu lub jej część. Ta mieszanina może stanowić nawet
cały genom organizmu, np. człowieka, w postaci fragmentów. Każdy z tych fragmentów jest
włączany do innej cząsteczki wektora, tworząc rodzinę rekombinowanych cząsteczek DNA,
z których jedna niesie interesujący nas gen docelowy. Zwykle tylko jedna rekombinowana
cząsteczka DNA jest transportowana do pojedynczej komórki gospodarza, więc, chociaż
ostateczny zestaw klonów może zawierać wiele różnych rekombinowanych cząsteczek,
każdy indywidualny klon, zawiera wiele kopii tylko jednej cząsteczki. Gen jest teraz
odseparowany od wszystkich pozostałych genów z początkowej mieszaniny wszystkich
fragmentów, a jego specyficzne cechy mogą być teraz badane w szczegółach.
W praktyce, kluczem do sukcesu lub porażki w eksperymencie klonowania genów, jest
zdolność do identyfikacji docelowego klonu z wielu innych, które uzyskano. Gdy rozważamy
genom bakterii Eschericha coli, który zawiera ponad 4000 różnych genów, możemy
początkowo zwątpić co do tego, czy jesteśmy zdolni znaleźć pojedynczy gen, pośród
wszystkich możliwych klonów. Problem staje się jeszcze bardziej przytłaczający, gdy
pamiętamy, że bakterie to stosunkowo proste organizmy i że genom ludzki, zawiera około
pięć razy tyle genów. Jednakże różnorodne strategie mogą być wykorzystywane do
upewnienia się, że odpowiedni gen może być otrzymany na końcu eksperymentu
klonowania. Niektóre z tych strategii bazują na modyfikacjach podstawowej procedury
klonowania, dzięki czemu, tylko komórki zawierające pożądaną rekombinowaną cząsteczkę
DNA, mogą się dzielić, a klon docelowy jest automatycznie wyodrębniany. Inne metody
angażują techniki, które pozwalają pożądanemu klonowi być identyfikowanym
z mieszaniny wielu różnych klonów.
Gdy gen został sklonowany, nie ma praktycznie limitu dla informacji, które można uzyskać
o jego strukturze i ekspresji. Dostępność klonowanego materiału stymulowała rozwój metod
analitycznych, służących badaniu genów, a nowe techniki są wprowadzane cały czas.
1.5.2 PCR także może być wykorzystywany do oczyszczania genu.
Reakcja łańcuchowa polimerazy, także jest wykorzystywana do uzyskania czystej próbki
genu, ponieważ region wyjściowej cząsteczki DNA, która jest kopiowana podczas PCR,
stanowi
segment
o
granicach
wyznaczonych
przez
miejsca
stapiania
dwóch
oligonukleotydowych starterów. Gdy startery przyłączą się w pozycjach flankujących gen
docelowy, wiele kopii tego genu zostanie zsyntetyzowanych. Wynik jest taki sam, jak
w przypadku eksperymentu klonowania, choć nie pojawia się problem selekcji, ponieważ
pożądany gen jest wybierany automatycznie, jako rezultat obecności pozycji hybrydyzacji
starterów.
Eksperyment PCR może być ukończony w kilka minut, podczas gdy tygodnie, jeśli nie
miesiące, potrzebne są do uzyskania genu na drodze klonowania. Dlaczego zatem
klonowanie genów jest nadal stosowane? Ponieważ PCR ma dwa ograniczenia:
Znane muszą być sekwencje hybrydyzacji starterów. Łatwo jest zsyntetyzować
oligonukleotydy o określonej z góry sekwencji, ale gdy jest ona nieznana, wówczas
odpowiednie dla reakcji startery nie mogą być wyprodukowane. To znaczy, że PCR
nie może być stosowany do izolowania genów, które wcześniej nie zostały już
zbadane.
Istnieje limit długości sekwencji DNA, która może być powielona metodą PCR. Kilka
kilozasad (kb), może być skopiowana dość łatwo, a z segmentami do 40 kb, można się
uporać korzystając ze specjalnych technik, ale są to i tak długości mniejsze, niż
długości wielu genów, szczególnie ludzkich lub innych kręgowców. Klonowanie jest
zatem wykorzystywane, gdy wymagane jest uzyskanie nienaruszonej wersji długiego
genu.
Klonowanie genów jest dlatego jedynym sposobem izolacji długich genów lub tych, których
nigdy wcześniej nie badano. Mimo to PCR posiada wiele ważnych zastosowań. Na przykład,
nawet gdy sekwencja genu nie jest znana, nadal jest możliwe ustalenie odpowiednich
sekwencji dla pary starterów, w oparciu o sekwencje odpowiednika docelowego genu
w innym organizmie. Gen, który został wyizolowany i zsekwencjonowany, powiedzmy
z myszy, może być wykorzystany do zaprojektowania pary starterów dla izolacji jego
odpowiednika u człowieka.
Ponadto, istnieje wiele zastosowań, gdzie koniecznym jest izolacja lub detekcja genów,
których sekwencje są już znane. PCR genów ludzkich globin na przykład, jest
wykorzystywana do sprawdzenia obecności mutacji, które mogą powodować chorobę
krwi, zwaną talasemią. Zaprojektowanie odpowiednich starterów do PCR jest proste,
ponieważ sekwencje genów ludzkich globin są znane. Po PCR, kopie genu są
sekwencjonowane lub badane w inny sposób, w celu wyznaczenia, czy jakakolwiek z mutacji
wywołujących talasemię jest obecna.
Inne kliniczne zastosowanie PCR angażuje wykorzystanie starterów specyficznych do DNA
wirusów, wywołujących choroby. Pozytywny wynik wskazuje, że próbka zawiera wirusa i że
osoba, od której próbka pochodzi, powinna podlegać leczeniu, aby zapobiec wystąpieniu
choroby. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest niesamowicie czuła: starannie przygotowana
reakcja, daje wykrywalne ilości DNA, nawet, jeżeli tylko jedna matrycowa cząsteczka DNA
znajdowała się na początku w mieszaninie reakcyjnej. To oznacza, że technika może
wykrywać wirusy w najwcześniejszych stadiach infekcji, zwiększając szanse, że leczenie
zakończy się sukcesem. Wysoki stopień czułości oznacza, że PCR może być także
wykorzystywany w badaniu materiałów w kryminalistyce, takich jak włosy lub zaschnięte
plamy krwi, a nawet kości osób, które nie żyją od dawna.
Rozdział 2. Wektory do klonowania
genów: plazmidy i bakteriofagi.
Cząsteczka DNA musi wykazywać kilka cech, aby być zdolną do funkcjonowania jako wektor
do klonowania genów. Przede wszystkim musi być zdolna do replikacji w komórce
gospodarza, dzięki czemu liczne kopie rekombinowanych cząsteczek DNA mogą być
produkowane i przekazywane do komórek potomnych. Wektor musi być także stosunkowo
niewielki, najlepiej mniejszy niż 10 kb, jako że duże cząsteczki mają tendencję do uszkodzeń
podczas oczyszczania i są także trudniejsze do późniejszych manipulacji. Dwa rodzaje
cząsteczek o satysfakcjonujących właściwościach można znaleźć w komórkach bakteryjnych:
plazmidy i chromosomy bakteriofagów.
2.1 Plazmidy
Plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA, egzystującymi niezależnie w komórce bakteryjnej.
Prawie zawsze niosą one w swojej sekwencji jeden lub więcej genów i często geny te,
odpowiedzialne są za użyteczne cechy, wykazywane przez bakterię niosącą plazmid.
Np. zdolność do przetrwania w normalnie toksycznych stężeniach antybiotyków, takich jak
chloramfenikol lub ampicylina, jest często wynikiem obecności w bakterii plazmidu,
niosącego geny oporności na antybiotyki. W laboratorium, oporność na antybiotyki jest
często wykorzystywana jako marker selekcyjny, dla upewnienia się, że bakteria w danej
kulturze, zawiera we wnętrzu szczególny plazmid.
Większość plazmidów zawiera co najmniej jedną sekwencję DNA, która funkcjonuje jako
miejsce inicjacji replikacji, dlatego są one zdolne do powielania wewnątrz komórki,
w sposób niezależny od obecności głównego chromosomu bakteryjnego. Mniejsze plazmidy
wykorzystują enzymy replikacyjne komórki bakteryjnej, aby tworzyć kopie samych siebie,
podczas gdy niektóre z większych plazmidów, niosą geny, które kodują specjalne enzymy,
będące specyficznymi do replikacji plazmidu. Kilka typów plazmidów jest także zdolnych do
replikacji przez włączenie do chromosomu bakteryjnego. Te integracyjne plazmidy lub
episomy mogą w sposób stabilny pozostawać w tej formie podczas licznych podziałów
komórkowych, ale zawsze, na pewnych etapach funkcjonują jako niezależne elementy.
2.1.1 Rozmiar i liczba kopi
Rozmiar i liczba kopii plazmidu są szczególnie istotne, jeśli chodzi o klonowanie. Jak już
wspomniano, wielkość plazmidu nie powinna przekraczać 10 kb. Wówczas jest on pożądany
jako wektor do klonowania. Wielkość plazmidów waha się od 1 kb w przypadku
najmniejszych, do 250 kb, dla największych cząsteczek, więc tylko kilka z nich jest
użytecznych
do
celów
klonowania.
Jednakże,
większe
plazmidy,
mogą
być
przystosowywane do klonowania w pewnych okolicznościach.
Liczba kopii odnosi się do liczby cząsteczek indywidualnego plazmidu, które normalnie
znajdują się w pojedynczej komórce bakteryjnej. Czynniki kontrolujące liczbę kopii, nie są
dobrze zrozumiane. Niektóre z plazmidów, szczególnie te większe są pod ścisłą kontrolą
(stringent) i występują w małej liczbie kopii, jednej lub dwóch na komórkę. Inne, zwane
plazmidami zrelaksowanymi, są obecne licznie, w ilości 50 lub więcej na komórkę. Ogólnie
rzecz biorąc, użyteczny wektor do klonowania powinien być obecny w komórce w wielu
kopiach, dzięki czemu, będzie można uzyskać duże ilości rekombinowanych cząsteczek
DNA.
2.1.2 Koniugacja i kompatybilność
Plazmidy dzieli się na dwie grupy: koniugacyje i niekoniugacyjne. Plazmidy koniugacyjne
charakteryzuje zdolność do sprzyjania koniugacji płciowej między komórkami bakterii,
procesowi, który może skutkować koniugacyjnym rozprzestrzenianiem się plazmidu z jednej
komórki do wszystkich innych w obrębie kultury bakterii. Koniugacja i transfer plazmidu, są
kontrolowane przez zestaw genów transferowych lub tra które są obecne na plazmidach
koniugacyjnych i nie obecne w przypadku plazmidów niekoniugacyjnych. Jednakże,
niekoniugacyjne plazmidy, mogą w pewnym okolicznościach ulegać kotransferowi, wraz
z plazmidami koniugacyjnymi, gdy oba rodzaje obecne są w tej samej komórce.
Kilka różnych rodzajów plazmidów, może znajdować się w pojedynczej komórce, w tym
więcej niż jeden rodzaj plazmidów koniugacyjnych jednocześnie. W prawdzie, komórki E. coli
znane są z tego, iż zawierają do siedmiu różnych plazmidów na raz. Aby być zdolnym do
koegzystowania w tej samej komórce, różne plazmidy muszą być kompatybilne. Gdy dwa
plazmidy są niekompatybilne, wówczas jeden z nich zostanie gwałtownie usunięty z komórki.
Różne rodzaje plazmidów mogą być dlatego przypisane do różnych grup niekompatybilności
na podstawie tego, czy mogą lub nie ze sobą koegzystować, a plazmidy z pojedynczej grupy
niekompatybilności są często spokrewnione ze sobą w różny sposób. Podstawy
niekompatybilności nie są dobrze zrozumiane, ale zdarzenia podczas replikacji plazmidu
zdają się leżeć u podstaw tego zjawiska.
2.1.3 Klasyfikacja plazmidów
Najbardziej przydatna klasyfikacja naturalnie występujących plazmidów jest oparta o główną
cechę, kodowaną przez geny plazmidu. Pięć głównych typów plazmidów, zgodnie z tą
klasyfikacją są następujące:
1)
Plazmidy F, płciowe niosą tylko geny tra i nie mają żadnych cech, poza zdolnością do
stymulacji koniugacyjnego transferu plazmidów; np. plazmid F z E. coli.
2)
Plazmidy R, oporności, niosą geny nadające komórce gospodarz oporność na jeden
lub więcej czynników antybakteryjnych, takich jak chloramfenikol, ampicylina i rtęć;
są bardzo ważne w mikrobiologii klinicznej, jako że rozprzestrzeniane przez naturalne
populacje, mogą nieść głębokie konsekwencje w zakresie leczenia infekcji
bakteryjnych; np. RP4, powszechnie występujący u Pseudomonas, a także i wielu
innych bakterii.
3)
Plazmidy Col, kodujące kolicyny, białka, które zabijają inne bakterie; np. ColE1
z E. coli.
4)
Plazmidy degradujące, które pozwalają komórce gospodarza metabolizować
cząsteczki takie jak toluen lub kwas salicylowy; np. TOL z Pseudomonas putida.
5)
Plazmidy wirulencji, nadają patogenność komórce gospodarza; np. plazmidy Ti
z Agrobacterium tumefaciens, które indukują guzowatość korzeni u roślin
dwuliściennych.
2.1.4 Plazmidy w organizmach innych niż bakteryjne.
Chociaż plazmidy są szeroko rozpowszechnione wśród bakterii, nie są w żaden sposób tak
powszechne
w
innych
organizmach.
Najlepiej
scharakteryzowanym
plazmidem
eukariotycznym jest 2 μm circle, który występuje w wielu szczepach drożdży Saccharomyces
cerevisiae. Odkrycie plazmidu 2 μm, było użyteczne, ponieważ pozwoliło na konstrukcję
wektorów do klonowania, dla tego bardzo ważnego w przemyśle organizmu. Jednakże,
poszukiwanie plazmidów u innych eukariontów, takich jak grzyby strzępkowe, rośliny,
zwierzęta, okazało się rozczarowujące, gdyż podejrzewa się, że wiele wyższych organizmów
po prostu nie zawiera plazmidów w swoich komórkach.
2.2 Bakteriofagi
Bakteriofagi lub po prostu fagi, są wirusami, które infekują bakterie. Jak większość wirusów,
fagi są bardzo proste w swojej budowie, składając się jedynie z cząsteczki DNA (lub czasem
RNA), niosącej kilka genów, w tym niektóre odpowiedzialne za replikację faga, otoczonej
płaszczem ochronnym, czyli kapsydem, zbudowanym z cząsteczek białka.
2.2.1 Cykl infekcyjny faga
Ogólny wzór infekcji, który jest taki sam dla wszystkich typów fagów, jest procesem
trójetapowym:
1)
Cząstka fagowa przyłącza się do zewnętrznej powierzchni bakterii i wstrzykuje swój
chromosom DNA do komórki.
2)
Cząsteczka DNA faga jest replikowana, zwykle przez specyficzne enzymy faga,
kodowane przez geny w chromosomie fagowym.
3)
Inne geny faga, kierują syntezą składników białkowych kapsydu, a nowe cząstki
fagowe są składane i uwalniane z bakterii.
Dla niektórych typów fagów, cały cykl infekcyjny jest zakańczany bardzo szybko,
prawdopodobnie w mniej niż 20 minut. Ten typ gwałtownej infekcji, zwany jest cyklem
litycznym, jako że uwolnienie nowych cząstek fagowych jest związane z lizą komórki
bakteryjnej. Charakterystyczną cechą litycznego cyklu infekcyjnego jest to, że po replikacji
DNA faga, natychmiast następuje synteza białek kapsydu, a cząsteczka DNA faga, nigdy nie
jest utrzymywana w stabilnej formie w komórce gospodarza.
2.2.2 Fagi lizogeniczne
W kontraście do cyklu litycznego, infekcja lizogeniczna, charakteryzuje się zatrzymaniem
cząsteczka DNA faga w bakterii, prawdopodobnie przez tysiące podziałów komórki.
W przypadku wielu fagów lizogenicznych, DNA faga jest włączane do genomu bakterii,
w sposób podobny do insercji episomu. Zintegrowana forma DNA faga (zwanego teraz
profagiem), jest wyciszona, a bakteria (lizogeniczna), która niesie profaga jest fizycznie
nierozróżnialna spośród nieinfekowanych komórek. Jednakże, profag jest ostatecznie
uwalniany z genomu gospodarza, a fag powraca do trybu litycznego i prowadzi do lizy
komórki. Fag lambda (λ) jest typowym przykładem faga lizogenicznego.
Pewna liczba fagów lizogenicznych wykazuje inny cykl infekcyjny. Gdy M13 lub spokrewniony
fag, zainfekuje E. coli, nowe cząstki faga są w sposób ciągły składane i uwalniane z komórek.
DNA faga M13 nie jest integrowane z genomem bakterii i nie pozostaje wyciszone.
W przypadku tych fagów, liza komórki nigdy nie występuje, a zainfekowana bakteria może
kontynuować wzrost i podziały, aczkolwiek z mniejszą szybkością niż komórka
nieinfekowana.
Choć występuje wiele różnych typów bakteriofagów, tylko λ i M13 odnalazły istotną rolę
jako wektory do klonowania.
Organizacja genów w cząsteczce λ DNA
Lambda stanowi przykład faga typu główka i ogonek. DNA zawarte jest w wielobocznej
strukturze główki, zaś ogon służy do przytwierdzenia faga do powierzchni bakterii
i wstrzyknięcia DNA do komórki.
Cząsteczka DNA faga λ, ma wielkość 49 kb i była intensywnie badana technikami
mapowania genów i sekwencjonowania DNA. W konsekwencji, pozycje i znaczenie
wszystkich genów w cząsteczce DNA faga λ są znane. Cechą mapy genetycznej faga λ jest to,
że geny powiązane w zakresie swoich funkcji są połączone w klastery w genomie. Na
przykład wszystkie geny kodujące składniki kapsydu białkowego, są zgrupowane razem na
obszarze długości jednej trzeciej cząsteczki DNA, a geny kontrolujące integrację profaga do
genomu gospodarza, stanowią klaster w środku cząsteczki. Łączenie w klastery powiązanych
ze sobą genów jest wyjątkowo ważne dla kontroli ekspresji genomu λ, jako że pozwala
genom być włączonym lub wyłączonym raczej jako grupie, niż indywidualnie. Klastery są
także ważne w konstruowaniu wektorów do klonowania opartych na λ.
Liniowa i kolista forma λ DNA
Drugą cechą λ, która okazuje się być istotna w konstruowaniu wektorów do klonowania jest
konformacja cząsteczki DNA. Obecna w główce faga cząsteczka DNA jest liniowa, z dwoma
wolnymi końcami. Składa się ona z dwóch komplementarnych nici DNA, sparowanych
według zasad Watsona i Cricka (dsDNA). Jednakże, na każdym z końców cząsteczki, jest
krótki 12-nukleotydowy obszar, w obrębie którego DNA pozostaje w formie jednoniciowej.
Te dwa fragmenty są względem siebie komplementarne, a więc może między nimi
występować parowanie zasad, tworząc formę kolistą, w pełni dwuniciową. Komplementarne
pojedyncze nici są często nazywane lepkimi lub kohezyjnymi końcami, ponieważ parowanie
zasad pomiędzy nimi, może złączyć ze sobą dwa końce cząsteczki DNA (lub końce dwóch
różnych cząsteczek DNA). Kohezyjne końce w obrębie cząsteczki λ DNA zwane są miejscami
cos i grają dwie odrębne role podczas cyklu infekcyjnego faga. Po pierwsze, pozwalają
liniowej cząsteczce DNA, która jest wstrzykiwana do komórki, ulec cyrkularyzacji, która
stanowi warunek konieczny insercji do genomu bakteryjnego. Druga rola miejsc cos, jest
istotna po wycięciu faga z genomu gospodarza. Na tym etapie, duża liczba nowych
cząsteczek λ DNA jest produkowana zgodnie z mechanizmem replikacyjnym obracającego
się koła, w którym ciągła nić DNA, jest rozwijaną cząsteczką matrycy. W wyniku takiej
replikacji otrzymuje się katenan, zbudowany z serii liniowych λ genomów połączonych ze
sobą właśnie w miejscach cos. Rola miejsc cos, polega teraz na służeniu jako sekwencje
rozpoznawane przez endonukleazę, która tnie katenan w miejscach cos, tworząc
indywidualne genomy λ. Endonukleaza ta, będąca produktem genu A w cząsteczce λ DNA,
wytwarza jednoniciowe lepkie końce, a także bierze udział w łączeniu z innymi białkami,
aby spakować każdy genom λ, do struktury główki fagowej. Procesy cięcia i pakowania,
rozpoznają tylko miejsca cos i sekwencje DNA po obu stronach miejsc cos, więc zmiana
struktury wewnętrznych regionów genomu λ, na przykład przez insercję nowych genów, nie
ma wpływu na te zdarzenia, tak długo, jak genom λ, na znacznej długości nie pozostanie
zmieniony w zbyt znaczący sposób.
M13 – fag filamentowy
M13 jest przykładem faga filamentowego i całkowicie różni się w swojej strukturze od faga λ.
Ponadto, cząsteczka DNA M13 jest znacznie mniejsza od genomu λ, mając długość tylko 6407
nukleotydów. Jest kolista i niezwykła w tym, że w całości składa się z jednoniciowego DNA.
Mniejszy rozmiar cząsteczki DNA M13 oznacza, iż zawiera ona mniej miejsca na geny, niż
genom λ. Jest to możliwe, ponieważ kapsyd M13, zbudowany jest z licznych kopii zaledwie
trzech różnych białek (produktów tylko trzech genów), podczas gdy synteza struktury główka
i ogonka faga λ, wymaga aż 15 różnych białek. Dodatkowo, M13 posiada prostszy cykl
infekcyjny niż λ i nie wymaga genów koniecznych do insercji do genomu gospodarza.
Wejście cząsteczki DNA M13 do komórki E. coli (i kolaj) zachodzi przez pilus, strukturę, która
łączy dwie komórki podczas koniugacji płciowej. Wewnątrz komórki, jednoniciowa
cząsteczka zachowuje się jak matryca do syntezy nici komplementarnej, skutkując
pojawieniem się normalnego, dwuniciowego DNA. Ta cząsteczka, nie jest włączana do
genomu bakterii, ale w zamian za to ulega replikacji do czasu, aż w komórce nie pojawi się
ponad 100 jej kopii. Gdy bakteria się dzieli, każda komórka potomna, otrzymuje kopie
genomu fagowego, który kontynuuje replikację, tym samym utrzymując liczbę cząsteczek
DNA na stałym poziomie w komórce. Cząstki faga są nieustannie składane i uwalniane i około
1000 nowych fagów produkowanych jest, podczas każdego pokolenia zainfekowanych
komórek.
Kilka cech M13, czyni go atrakcyjnym jako wektor do klonowania. Genom jest mniejszy niż
10 kb, a zatem w obrębie wielkości pożądanych w przypadku wektorów do klonowania.
Ponadto, dwuniciowa forma replikatywna (RF) genomu M13 zachowuje się bardzo
podobnie do cząsteczki plazmidu i tak też może być traktowana w celach
eksperymentalnych. Jest łatwo przygotowywana z kultury zainfekowanych komórek E. coli,
i może być ponownie wprowadzana do komórek poprzez transfekcję. Co najważniejsze,
geny klonowane z wykorzystaniem wektorów opartych o genom faga M13, mogą być
uzyskiwane w formie jednoniciowego DNA. Jednoniciowe wersje klonowanych genów są
użyteczne dla kilku technik, szczególnie sekwencjonowania DNA i mutagenezy in vitro.
Klonowanie w wektorze M13 jest prostym i niezawodnym sposobem otrzymywania
jednoniciowego DNA, dla tego typu pracy. Wektory M13 są także stosowane w phage
display, technice identyfikowania par genów, których białkowe produkty oddziałują ze sobą.
2.2.3 Wirusy jako wektory do klonowania dla innych organizmów
Większość żyjących organizmów jest infekowana przez wirusy i nie jest zaskakującym, że
w związku z tym istniało duże zainteresowanie możliwością wykorzystania wirusów jako
wektory do klonowania, w przypadku organizmów wyższych. Jest to szczególnie istotne, gdy
ma się na uwadze, że plazmidy nie są powszechnie znajdywane w organizmach innych niż
bakterie czy drożdże. Kilka eukariotycznych wirusów, było wykorzystywanych jako wektory
do klonowania w specjalnych zastosowaniach: na przykład ludzkie adenowirusy,
wykorzystywane w terapii genowej, bakulowirusy, stosowane do syntezy ważnych
farmaceutycznie białek w komórkach owadów i caulimowirusy oraz geminiwirusy, używane
do klonowania w roślinach.