Ostatni wykład zakończyłem przedstawieniem możliwości korzystania z sekwencji reporterowych i
dla przypomnienia: jest to metoda do badania aktywności promotora. Istotą testu jest to, że badanie
promotora jest prowadzone w takim układzie, w którym gen właściwy temu promotorowi
zastępujemy genem reporterowym. I tu mamy ilustrację:
Ten układ jest badany. Gen reporterowy charakteryzuje się tym, że jego produkt jest łatwy do
zaobserwowania i zmierzenia. Aby tak było gen reporterowy musi pochodzić spoza kompleksu,
którego ekspresję badamy. Przykłady:
1) jeżeli b-galaktozydazę w układzie umieścimy pod kontrolą aktywnego promotora
eukariotycznego, w komórce eukariotycznej pojawi się produkt, którego wcześniej nie było
(eukariota normalnie nie mają aktywności b-galaktozydazy, tylko E.Coli). Prosty test
histochemiczny, w którym produkt daje niebieski (?). Można zorientować się czy enzym jest
obecny.
2) Inne geny, np. gen neo. Koduje on oporność na działanie neomycyny i każdej jej pochodnej.
Test jest testem fenotypowym oporności na działanie antybiotyku.
3) Cat kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu. Ja wszystkich nie będę charakteryzował,
potem może wrócimy.
4) Lux – lucyferaza. Lucyferaza jest enzymem, którego aktywność w odniesieniu do specjalnego
substratu może być obserwowana przez emisję światła. Reakcji katalizowanej przez
lucyferazę towarzyszy uwolnienie energii w postaci światła i możemy obserwować
bioluminescencję, co jest dobrym sposobem dostrzegania aktywności układów. Gen
lucyferazy jest eukariotyczny, pochodzi np. ze świetlika.
Teraz chciałem pokazać państwu jak używa się genu reporterowego. Jeden z wielu
przykładów to test CAT assay, często używany w biologii molekularnej do badania aktywności
komórkowej. Test, w którym wykorzystuje się acetylotransferazę chloramfenikolu.
Tu się przygotować na masło maślane!
Na początku jest plazmid, w którym mamy gen x – gen, którego promotor chcemy zbadać. W tych
wszystkich testach analizujemy funkcję promotora. I aby układ dostosować do układu testu z genem
reporterowym, X jest usuwany, np. przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Na jego miejsce
wstawiany jest gen cat. Promotor zostaje. Ten układ jest trochę wydumany, dlatego że zwykle to
akurat na odwrót się robi. Tzn. dysponujemy wektorem, w którym jest promotor podstawowy, pod
którego kontrolą jest gen cat. I tu byłby cat i jakiś promotor podstawowy. Do tego dokładamy region
promotora, który chcemy badać. Można też oczywiście usunąć ten podstawowy promotor i cały
promotor umieścić przed genem cat, tak że dostaniemy taki rekombinowany konstrukt - promotor, a
pod jego kontrolą gen cat. Teraz ten konstrukt transformuje komórki eukariotyczne. Cat bowiem jest
bakteryjny, nie ma jego odpowiednika w komórkach eukariotycznych. Następnie komórki są jakiś czas
utrzymywane w warunkach hodowli, po to żeby w komórkach nagromadził się produkt ekspresji cat,
czyli acetylotransferaza chloramfenikolu. Trwa to kilkanaście godzin, żeby enzym pojawił się w
komórce.
Musimy w dalszej części eksperymentu sprawdzać czy faktycznie aktywność cat jest obecna w
komórkach Przygotowuje się zatem ekstrakt komórkowy, który jest inkubowany z substratami.
Substratem jest chloramfenikol, antybiotyk, naturalny substrat acetylotransferazy chloramfenikolu,
oraz acetyloCoA.Te 2 związki dodawane są do ekstraktu. Chloramfenikol jest znakowany
radioaktywnie
14
C. Całość inkubowana. Analizujemy skutek reakcji, czyli czy chloramfenikolu uległ
acetylacji (przez cat). Najprostszy sposób analizy to chromatografia cienkowarstwowa. Na rys. widać,
że naniesiono na płytkę 3 próbki. Ponieważ substrat jest radioaktywny, to po rozwinięciu
chromatogramu płytka jest suszona i obraz jest rejestrowany na kliszy lub przy pomocy rejestratora.
Pierwsza próbka pozostała w miejscu naniesienia, nie ma produktów powyżej, tzn że to jest po prostu
substrat – próbka kontrolna. Ekstrakt w niej był inkubowany tylko z substratami bez wektora. Inne
przykłady w zależności od poziomu aktywności produktu genu reporterowego CAT są różne. W
pierwszym przypadku jest tylko 1 prążek, bardzo słaby, zatem aktywność też jest słaba. Substratu jest
względnie dużo. W 2 przypadku są 2 prążki, a substratu jest mało. Prążki pojawiają się, bo acetylacja
przebiega w 2 miejscach, przy czym jedno jest bardziej preferowane. Tak więc widzimy, że przy
pomocy tej metody można porównywać aktywność. W ten sposób można przeprowadzić analizę
jakościową, np. że w próbce 2 aktywność jest mniejsza niż w 3. Jeżeli mamy wiele badanych
warunków, w których aktywność promotora może się zmieniać, można jakościowo porównywać tę
aktywność porównując natężenie prążka. Porównanie ilościowe różne metody:
– najprostszy: po wykonaniu autoradiogramu wiemy w których miejscach jest
radioaktywność. Zeskrobujemy te fragmenty (produkty) i mierzymy ich radioaktywność
- prostszy: obraz odczytywany nie na kliszy fotograficznej, gdzie odczyt jest nieliniowy, ale na
urządzeniu fosfolinature? Do odczytu radioaktywności. I wtedy mamy porównanie ilościowe.
Możemy porównywać aktywność tego samego promotora w różnych warunkach. Możemy też
prowadzić analizę wpływu sekwencji + i – na transkrypcję. Wpływ delecji takich sekwencji można
obserwować przy pomocy testu CAT. Można też wprowadzić mutacje punktowe i robić wszystko, co
się chce i porównywać te aktywności. Można też porównywać różne promotory.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Teraz przejdziemy do innej grupy
metod – pozwalającej na identyfikowanie i
studiowanie produktów translacji. Trzeba
zauważyć, że jeżeli gen jest sklonowany, czyli
że mamy jakąś sekwencję, musimy poznać
produkt jego translacji. Podstawa to
translacja pozakomórkowa. Aby ją
przeprowadzić musimy mieć czysty mRNA i
wszystko, co potrzeba do translacji
(aminokwasy, rybosomy, itd.). Ponadto
potrzeba Met z
35
S, izotopem siarki. Chodzi o
to, by nowo syntezowane białka były
znakowane, by wiedzieć, że synteza zaszła.
Metionina jest dobrym znacznikiem, bo jest
w małych ilościach w większości białek (inne
aminokwasy są w różnych ilościach).
Istnieją 2 systemy używane, ale oba
funkcjonują na tej samej zasadzie. Na
przykład jeśli sklonowaliśmy wspomniany
wcześniej gen, można przeprowadzić jego
transkrypcję In vitro. O wektorach do
transkrypcji In vitro mówiłem – PGR i wiele
innych. mRNA może być typu dzikiego lub mutantów. Także system translacji In vitro jest bardzo
pojemny i otwarty. Można badać wiele aspektów. Następnie prowadzona jest translacja i
otrzymujemy wyznakowane białko. Przeprowadzamy elektroforezę, widzimy na autoradiogramie jaki
powstał produkt. Na ilustracji wzięliśmy czyste mRNA , ale produktów powstało bardzo wiele. Zatem
mRNA Nie było oczyszczone dla 1 genu, ale to był mRNA komórkowy.
Wiedząc czym jest translacja pozakomórkowa, czyli In vitro, możemy przejść do omówienia dwóch
eksperymentów służących do identyfikacji białkowych produktów genów, które otrzymaliśmy:
I METODA:
HRT – translacja uwolnionych hybrydów (ang. hybryd-release translation).
Wychodzimy od błony, np.
nitrocelulozowej lub nylonowej, na
której jest cDNA, otrzymany wcześniej
w wyniku klonowania. Produkt
białkowy tego cDNA chcemy zobaczyć
lub sprawdzić czy odpowiada realnemu
produktowi białkowemu, który istnieje
w komórce. Mogliśmy sklonować jakiś
pseudogen, albo gen, który normalnie
nie ulega ekspresji w komórce.
Mogliśmy też nie znać dokładnie
miejsca startu transkrypcji, wystarczą
nam szczątkowe informacje, chcemy
tylko wiedzieć czy Cdna odpowiada
produktowi białkowemu . Eksperyment
nie dotyka samego produktu
białkowego, który jest obserwowany,
tylko na początku pracujemy z jego
transkryptem. Wróćmy do schematu.
cDNA immobilizowany na błonie, która
jest inkubowana z mRNA. mRNA jest
całkowitym,
totalnym mRNA
komórkowym. Nie potrzeba go
oczyszczać, jest izolowany jako całość z
komórki. Jeżeli warunki hybrydyzacji są
odpowiednio dobrane, powstają
specyficzne kompleksy między cDNA a specyficznym transkryptem. Jeżeli tego transkryptu nie ma,
obraz nie powstanie. Brak trankryptu oznacza, że w danym typie komórek nie istnieje produkt
białkowy dla tego czegoś co sklonowaliśmy. W schemacie powstają specyficzne kompleksy. Nadmiar
mRNA jest usuwany, natomiast mRNA specyficznie zaadsorbowany na błonie jest uwalniany.
Uwolniony mRNA wchodzi do systemu translacji w układzie bezkomórkowym In vitro. Po wykonaniu
translacji In vitro, przeprowadzana jest elektroforeza i autoradiografia. Jeżeli wyizolowano właściwy
mRNA ,otrzymywany jest produkt. Dla tego produktu musimy zmierzyć, że on istnieje (jest sygnał) i
jeżeli jest specyficzny będzie 1 sygnał. Możemy poddać też elektroforezie markery, czyli białka o
znanych masach cząsteczkowych i wtedy też możemy oszacować masę produktów.
II Metoda
HART – hybryd-arrest translation
Techniki i zjawiska stosowane są te same, ale
odwrócone o 180
0
. Znów preparat totalnego,
nieoczyszczonego mRNA. Pytanie jest
identyczne – czy cDNA jest tym cDNA, dla
którego istnieje produkt białkowy. Do mRNA
dodajemy specyficzny cDNA np. w postaci
wektora (czyli nie immobilizowany, a w
roztworze!). Wektorów musi być odpowiednio
dużo, by transkrypty właściwe zostały
skompleksowane. cDNA hybrydyzuje z
właściwym transkryptem, dla białka, które jest
produktem sekwencji, którą otrzymaliśmy jako
cDNA. Preparat po inkubacji z tRNA jest
używany jako substrat w translacji In vitro.
Zhybrydyzowane mRNA nie mogą ulegać
translacji, bo są związane w kompeksie z cDNA,
a pozostałe mRNA mogą. W poprzednim
eksperymencie spodziewaliśmy się białka jako
sygnału, a tu nie. Zatem po przeprowadzeniu
translacji In vitro i elektroforezy powinniśmy
obserwować brak paska w stosunku do jakiegoś
odniesienia (gdy pasek jest). Po elektroforezie
widzimy 2 ślady: w pierwszym są wszystkie
produkty translacji, a w drugim wszystkie poza
te, którym jest przypisane cDNA z przypisanym
mRNA, które kompleks ujemy.