Wykład XII 18.05.2012r.
Natalia Kleiber
1. Problemy z produkcją transkryptów białka eukariotycznego w E. coli:
a) Istnienie intronów:
Nie mogą być wycinane przez splicing jak u eukariota
Rozwiązanie problemu:
- intronów możemy się pozbyć i wykonujemy cDNA do nadekspresji
- użycie syntetycznego genu
b) Przedwczesna terminacja transkrypcji/ utworzenie struktur terminacyjnych:
Rozwiązanie problemu:
o mutageneza: Po wykonaniu analizy sekwencji, istnieją narzędzia bioinformatyczne,
które pozwalają przewidzieć problemy związane ze strukturami drugiego i trzeciego
rzędu transkryptu, strukturami które mogą tworzyć spinki do włosów, czy problemy
związane z użyciem kodonu i wtedy posługując się mutagenezą ukierunkowaną lub
mutagenezą kasetową możemy dokonywać zmian sekwencji. I problem zostaje
rozwiązany.
o
Użycie
syntetycznego
genu:
otrzymujemy
szereg
oligonukleotydów
o optymalnej sekwencji. Te oligonukleotydy składają się na odpowiedniki cDNA.
Pozbywamy się intronu, optymalizujemy sekwencję tak aby transkrypt nie tworzył
spinek do włosów i wprowadzamy odpowiednie kodony. Taki syntetyczny gen
tworzony z oligonukleotydów ligowanych ze sobą jest optymalną sekwencją do
nadekspresji w E. coli. Koszt takiego genu 30 000 Da to 2-3 tys.zł.
c) Brak kontrolowanych modyfikacji potranslacyjnych:
E. coli nie może prowadzić takich modyfikacji potranslacyjnych jak komórki eukariotyczne. Te
modyfikacje mają kluczowe znaczenie jeżeli chodzi o funkcję białek eukariotycznych:
fosforylacja
acetylacja
przyłączenie reszty kwasów tłuszczowych
przyłączenie cząsteczek ubikwityny, SUMO
Mogą się też zdarzać modyfikacje nieoczekiwane np.
polegające na usuwaniu ostatniej reszty jaką jest metionina (u prokariota metionina jest
często usuwana z końca łańcucha polipeptydowego)
nieenzymatyczna glikozylacja.
d) Fałdowanie białek:
Paradygmaty związane z fałdowaniem białek:
Białko może ulegać fałdowaniu samo z siebie. Nie jest to do końca prawdą, ponieważ
część białek aby mogły się sfałdować i przyjąć aktywną strukturę potrzebują białek
pomocniczych. W komórce E. coli nie ma takich białek pomocniczych. W rezultacie
białka się nie fałdują i nie przybierają aktywnej trzeciorzędowej formy. Fałdują się
w sposób nietypowy i nigdy nie wiadomo czy białko które poddajemy nadekspresji,
będzie dobrze sfałdowane.
Białko po fałdowaniu przyjmuję strukturę trzeciorzędową, która określa jego aktywność
(ten paradygmat nie jest związany z problemami ekspresji w E. coli).
e) Różne kodony są używane w różnych organizmach
tzn. ten sam kodon może kodować różne
aminokwasy w różnych organizmach.
Rozwiązanie problemu: syntetyczny gen.
f) Brak mostków disiarczkowych:
W cytoplazmie E. coli panuje silnie redukujące środowisko, zatem w białka,
w których powinny powstać mostki di siarczkowe takich mostków nie będą miały.
W takich przypadkach brak czynnika stabilizującego strukturę i często dochodzi do
nieprawidłowego fałdowania.
Rozwiązanie problemu:
o
Zastosowanie specjalnych szczepów i wektorów bakteryjnych.
o
Eksport białka ekspresjonowanego z cytoplazmy do peryplazmy.
W peryplazmie nie jest już tak redukcyjne środowisko i tu mogą tworzyć się
mostki disiarczkowe. Dodatkowo często nadekspresjonuje się białka cza
peronowe, które też są kierowane do peryplazmy i tu pomagają w fałdowaniu
się białka nadekspresjonowanego. Aby białko mogło być skierowane do
peryplazmy,
wymaga
przyłączenia
peptydu
kierującego.
Ilość
ekspresjonowanego białka w peryplazmie jest mniejsza niż w cytoplazmie.
o
Fałdowanie poza komórką w warunkach utleniających.
2. Eksperymenty nadekspresji są w sprzeczności.
Wynika to z tego, że podczas eksperymentu dążymy do maksymalizacji ilości białka, które jest
nadekspresjonowane. Do maksymalizacji ilości białka stosujemy wektory z silnymi
promotorami po to aby powstało jak najwięcej transkryptów i jak najwięcej białek. Często to
powoduje problemy. Jeżeli jest bardzo dużo produktów transkrypcji czyli również dużo
polipeptydu(duże stężenie białka) powoduje to dotąd nieopisane reakcje obronne.
W wyniku czego nadekspresjonowane białko ulega degradacji, anormalnemu fałdowaniu
i tworzy tzw. ciała strącone (ang. Inclusion bodies).
Inclusion bodies to struktury, gdzie białko nadekspresjonowane jest wyłączane
z cytoplazmy komórki prokariotycznej. Z inclusion bodies ciężko jest sobie poradzi. Można
próbować doprowadzić do tego, aby one nie powstawały, albo aby powstawały w niewielkich
ilościach i towarzyszyło im białko w formie rozpuszczalnej. Jest to możliwe np. przez:
obniżenie wydajności promotora (obniżenie wydajności transkryptu czyli również ilości
białka),
obniżenie temperatury nadekspresji.
Inclusion bodies niosą również pewne korzyści:
Zawarte jest w nich białko nadekspresjonowane w czystej formie,
ale zdenaturowane. Jeżeli wyizolujemy ciałka strącone to mamy
białko w formie czystej, ale denaturowane. Są jednak sposoby na
renaturację takiego białka, chociaż renaturacja nie zawsze kończy
się sukcesem.
Ciałka strącone mogą powstawać również z powodu takiego, że
białka nie fałdują się dobrze dlatego, że w cytoplazmie E. coli
panuje silnie redukujące środowisko (nie tworzą się mostki
disiarczkowe).
Wektory do klonowania w komórkach eukariotycznych- wektory
drożdży i grzybów
1. Plazmid 2 µm:
a) Charakterystyka:
Jest duży 6kb,
Nie występuje we wszystkich szczepach
drożdży,
Występuje w dużej liczbie kopii: 70-200
kopii na jedną komórkę,
Replikacja plazmidu zależy od białek
komórki, a także od dwóch genów
zawartych w plazmidzie: REP1 i REP2,
W każdym wektorze wymagana jest
sekwencja, która służy do delecji
transformantów (D).
b) W jaki sposób uzyskiwana jest selekcja plazmidu, który jest pochodną plazmidu 2 µm?
Selekcja poprzez antybiotyk, gen markerowy kodujący odporność na antybiotyk jest
niezwykle rzadka w komórkach drożdżowych, dlatego stosuje się niżej przedstawiony
sposób selekcji.
Jako geny markerowe używane są geny, które normalnie zaangażowane są
w biosyntezę aminokwasów.
Mamy komórkę drożdżową ze zmutowanym genem LEU2. Jest to jeden z genów
potrzebny do biosyntezy leucyny. Czyli na obu chromosomach (drożdże są diploidalne)
mamy zmutowane allele LEU2, czyli mamy szczep oznaczany jako LEU2
-
.
Drożdże tworzące kolonie wymagają pożywki, w której jest leucyna. Mamy zatem
szczep auksotroficzny, którego przeżycie jest zależne od obecności leucyny w pożywce.
Jeżeli nie będzie leucyny w pożywce to drożdże nie przeżyją.
Widzimy wektor który posiada gen LEU2 w formie dzikiej, funkcjonalnej. Jeżeli
transformujemy komórki drożdżowe z genem LEU2
-
to komórki drożdżowe, które
pobrały wektor przetrwają, natomiast komórki które nie pobrały wektora (nie uległy
transformacji) na podłożu niezawierającym leucyny zginą.
2. Wektor YEp13:
a) Charakterystyka:
Wektor episomalny (Episom: DNA,
który jest obcy podlega wbudowaniu do
chromosomu i zostaje w nim przez
wiele pokoleń)
Wektor czółenkowy, który może się
przemieszczać pomiędzy jednym typem
komórek do drugich
b) Klonowanie:
Mamy sekwencje pBR322, której elementy pozwalają na zbudowanie DNA, a także
na jego replikację w komórce bakteryjnej.
Po otrzymaniu wystarczającej ilości materiału, po otrzymaniu rekombinowanych
cząsteczek te cząsteczki poddawane są transformacji do komórek drożdżowych.
c) Jak to się dzieje, że ten wektor jest episomalny?
W komórkach drożdży piekarskich jest możliwa bardzo efektywna rekombinacja,
w szczególności rekombinacja homologiczna.
Rekombinacja homologiczna jest skierowana w sekwencję homologiczne, czyli
identyczne, podobne. Tymi sekwencjami homologicznymi jest ten fragment wektora,
w którym jest gen markerowy LEU2 i sekwencja LEU2 w chromosomie.
W chromosomie mamy gen zmutowany, a w wektorze mamy gen typu dzikiego. Te
sekwencje są na tyle podobne, że przez nie zachodzi rekombinacja homologiczna.
Skutkiem tej rekombinacji może być wbudowanie wektora do chromosomu komórki.
Wektor, ponieważ posiada sekwencje do replikacji, na początku podlega normalnej
replikacji, a z czasem może dojść do wbudowania w postaci episomu.
3. YIp i YRp
Jest to plazmid do którego dodano sekwencję drożdżową.
Nazwa: Drożdżowy wektor integrujący
URA3 mówi nam, że mamy do czynienia z wektorem
drożdżowym integrującym
Nie ma żadnych elementów pochodzących z komórek
drożdżowych, a szczególnie tych odpowiedzialnych za
replikację
Klonowanie wykonujemy tak samo jak w innych
wektorach drożdżowych episomalnych (transformacja
bakterii i następnie transformacja komórki drożdżowej)
Wektor czółenkowy, który może się przemieszczać
pomiędzy jednym typem komórek do drugich
Eksperyment polega na klonowaniu w komórkach
bakteryjnych, izolujemy DNA, transformujemy komórkę
drożdżową. Komórka drożdżowa musi mieć genotyp
URA3-. Po transformacji na podłożu selekcyjnym komórki
- które nie pobrały wektora zginą,
- które pobrały wektor ale nie są zdolne do rekombinacji,
po podziałach komórkowych również zginą,
- zostaną tylko te które pobrały wektor i są zdolne do
rekombinacji. Wektor zostanie wbudowany w genomie
drożdży. Powstaną stabilne komórki.
Jest to plazmid replikujący, stąd litera R w nazwie
Gen markerowy: TRP1 jest potrzebny do biosyntezy
tryptofanu
Jest to plazmid replikujący tzn. że może on replikować
niezależnie od komórki drożdżowej
U drożdży występuje wiele miejsc startu replikacji. Takie
miejsce występuje w pobliżu TRP1
4. Po co nam wiele wektorów?
To zależy do jakich celów chcemy użyć wektora
Wybieramy go kierując się np. informacjami co do wydajności transformacji i liczby kopii,
która zostanie w komórce drożdżowej po transformacji takim wektorem.
5. Wydajność wektorów:
Najbardziej wydajny jest wektor episomalny 1 µg oczyszczonego wektora z komórek
bakteryjnych to możemy transformować od 10 do 100 tys. komórek (w jednej komórce
może być od 20 do 50 kopii)
W wektorach replikujących wydajność jest niższa 1 µg oczyszczonego wektora może
transformować od 1 do 10 tys. komórek (od 5 do 100 kopii na komórkę)
Najmniej wydajne są wektory integrujące z 1 µg oczyszczonego wektora dostaje się od 1 do
10 kopii (w jednej komórce jedna kopia)
6. Sztuczny chromosom drożdżowy (YAC)
Są używane do klonowanie bibliotek DNA, których fragmenty wbudowane do wektorów są
stosunkowo długie, dłuższe niż fagach czy kosmidach.
Te wektory noszą nazwę chromosomów dlaczego, że w nich występują te elementy, które
występują też w strukturze chromosomu drożdżowego (telomery, centromer, wiele miejsc
startu replikacji)
7. Sztuczny chromosom drożdżowy pYAC3
a) Charakterystyka:
Względnie duży
Posiada elementy, które pozwalają na klonowanie
w komórkach bakteryjnych
CEN4 sekwencja centromerowa,
TEL sekwencje telomerowe, w komórce drożdżowej
służą do odtworzenia sekwencji telomerycznych,
jest to ważne ze względu na to że otrzymujemy
krótkie sekwencje w wektorze, nie pomnażamy jego
wielkości bez potrzeby.
TRP1 i URA3 geny markerowe
CEN4 i TEL sprawiają, że wektor razem z insertem
jest postrzegany w komórce drożdżowej jako
chromosom. Dzięki temu ten wektor jest strukturą
stabilną.
może replikować dzięki sekwencji pochodzącej
z E. coli
8. Klonowanie YAC
Dlaczego transformanty selekcjonuje się dwoma genami markerowymi?
o
Otrzymaliśmy ramię prawe i lewe, które mogą ulec samoligacji, a interesują nas
tylko takie, w których znalazło się i ramię prawe i lewe. Tzn. że wymagany jest
szczep URA3- i TRP1-
Selekcja rekombinantów zależna od genu SUP4:
o
Selekcja fenotypowa podobna do selekcji biało niebieskiej.
o
Jeżeli wektor jest wbudowany to SUP4 jest inaktywowany- otrzymujemy kolonię
koloru białego
o
Jeżeli wektor nie został wbudowany to SUP4 jest aktywny- otrzymujemy kolonię
koloru czerwonego
Wektory do klonowania w komórkach eukariotycznych- klonowanie
wektorów dla roślin wyższych
1. Czy w roślinach występują wektory plazmidowe?
Odpowiedź: tak i nie:
NIE: nie są znane naturalnie występujące plazmidy, które byłyby obecne w roślinach
wyższych.
TAK: znane są plazmidy, które mogę być obecne w roślinach, ale pochodzą z królestwa
bakterii.
2. Zakażanie roślin dwuliściennych przez Agrobacterium tumafaciens:
Jeżeli tkanka rośliny ulegnie uszkodzeniu, może ulegać infekcji przez Agrobacterium
i dochodzi do powstania nowotworowych zmian w tkance roślinnej .
Agrobacterium dzięki plazmidowi, który najpierw jest w komórce bakteryjnej a potem
w tkance roślinnej zmienia metabolizm rośliny
3. Plazmid Ti z Agrobacterium tumafaciens:
a) Charakterystyka:
Jest protoplastą wektorów plazmidowych które
są używane do transformacji dwuliściennych
roślin.
Plazmid jest dość duży 200kb
Po infekcji plazmid jest przenoszony do
komórki roślinnej, gdzie fragment T-DNA jest
integrowany w chromosomie bakteryjnym.
T-DNA zawiera różne informacje, ale również
te związane z cechami onkogennymi tzn. że
ekspresja genów tego fragmentu powoduje
szybki, niekontrolowany podział komórek
roślinnych.
Po infekcji następuje nowotworzenie, czyli
zwiększa
się
masa
komórek
transformowanych.
Transformacja nie dotyczy całej rośliny,
zmiana zachodzi lokalnie.
Transformacja jest korzystna dla komórki
bakteryjnej dlatego, że fragment T-DNA
zawiera również informację genetyczną, która
przestawia metabolizm komórki roślinnej, tak
że ta komórka zaczyna syntezę opin. Opiny są
związkami chemicznymi, z których korzysta
bakteria.
4. Redukcja wielkości plazmidu:
a) Dlaczego plazmid musi zostać zredukowany: Jest za duży, niepraktyczny, ulegają często
pęknięciu, zniszczeniu mechanicznemu
b) System binarny:
Dysponujemy dwoma wektorami: plazmid A i plazmid B
Plazmid A zawiera region wirulentny i region gospodarza,
które pochodzą z plazmidu Ti
Plazmid B zawiera region T-DNA pochodzący z plazmidu
Ti
Do plazmidu B zostaje wklonowany dany fragment DNA
w zaznaczone miejsce restrykcyjne. Następnie taką
mieszanką plazmidów (plazmid A i plazmid B
z wbudowanym fragmentem DNA) transformujemy
komórki bakteryjne, albo wprost komórki roślinne i tam
informacja zawarta w jednym i drugim plazmidzie pozwala
na efektywne wbudowanie T-DNA do genomu komórki
roślinnej.
c) Strategia kointegracyjna:
Korzystamy
z
dwóch
plazmidów:
Typowy(normalny) plazmid Ti oraz mały
plazmid stosowany do klonowania w E. coli,
w którym umieszczone jest T-DNA (czyli DNA,
który integruje w genomie roślinnym)
Klonowanie
przeprowadzamy
w
małym
plazmidzie. Jego wielkość pozwala na łatwe
klonowanie i transformację
Tym małym plazmidem poddajemy transformacji
Agrobacterium i w komórce dochodzi do
rekombinacji
homologicznej.
Rekombinację
kierujemy poprzez sekwencję fragmentu T-DNA,
która jest homologiczna z fragmentem T-DNA w
plazmidzie Ti.
Otrzymujemy
genetycznie
modyfikowany
organizm
Agrobacterium,
który
posiada
zmieniony,
zrekombinowany
plazmid
Ti,
w którym jest wbudowany nowy gen.
Aby wbudować DNA do Agrobacterium, korzystamy z naturalnego środowiska komórki
i naturalnych procesów rekombinacyjnych. Dzięki temu gen znajduje się w plazmidzie
Potem korzystamy z naturalnego procesu, jakim jest proces infekcji. Czyli Agrobacterium
może przenosić ten zrekombinowany plazmid, który posiada pozostałe regiony
niezmodyfikowane, a więc gen określający specyficzność i wirulencję.
PROBLEM: aby dokonać transformacji, roślina musi mieć uszkodzoną tkankę (ścianę
komórkową) i dopiero wtedy dochodzi do transferu genu. Transfer dotyczy tylko części
rośliny, gdyż wbudowanie do chromosomu ma miejsce tylko w tych komórkach, które
najpierw uległy transformacji, a potem uległy namnożeniu w procesie nowotworzeni.
5. Transformacja całej rośliny:
Transformacji poddaje się nie dojrzałe rośliny ale komórki roślinne, które utrzymywane są
w postaci zawiesiny, w hodowli. Te komórki zakaża się Agrobacterium.
Tak transformowane komórki są następnie hodowane w zdefiniowanych warunkach.
W przypadku roślin jest dość prosto, aby z pojedynczych komórek, stosując odpowiednie
czynniki hormonalne, wyprowadzić pojedyncze rośliny.
Jest to bardzo korzystny proces z tego powodu, że otrzymujemy już całe transformowane
rośliny, w których w każdej komórce ma miejsce podstawienie w chromosomie poprzez
fragment T.
Przy pomocy tej technologii doprowadzono do uzyskania pochodnych roślin
dwuliściennych, natomiast jednoliścienne nie mogą być w ten sposób transformowane.
Rośliny
jednoliścienne
są
transformowane
z
wykorzystaniem
biolistyki
(mikrowstrzeliwanie). Jest to technologia wykorzystywana do pokonania ściany
komórkowej. Nanostruktury (DNA) są opłaszczane na bardzo małe kulki, a następnie są
wstrzeliwane do tkanki roślinnej, najlepiej jak to są embriony lub komórki na bardzo
wczesnym stadium. Komórki ulegają uszkodzeniu, ale nie jest to zbyt tragiczne w skutkach
i otrzymujemy zdegenerowane rośliny, w których dochodzi do wbudowania DNA.
6. Bezpośredni transfer genów:
W tej metodzie nie posługujemy się plazmidami Ti ani jego pochodnymi.
To musi być DNA, który zawiera gen, który mamy intencję wbudować do chromosomu
komórki roślinnej.
Jeżeli plazmidowy DNA w formie super zwiniętej zostanie umieszczony w komórce
roślinnej to on ulega bardzo często integracji.
Czyli mamy jakiś plazmid, w którym produkujemy gen,
który nas interesuje, który chcemy aby był zintegrowany
w chromosomie komórki roślinnej i następnie takim
plazmidem
transformujemy
komórki
roślinne,
najczęściej w formie protoplastów, ale mogą to być też
komórki posiadające ścianę i w tym eksperymencie
wykorzystujemy biolistykę.
Warunkiem powodzenia eksperymentu jest to aby
cząsteczka DNA była super zwinięta i jeżeli tak jest to
dochodzi
do
rekombinacji
takich
cząsteczek
plazmidowych z chromosomem komórki roślinnej. Jest
to rekombinacja niehomologiczna, czyli za bardzo nie
kontrolujemy tego procesu. Skutki mogą być różne.
Nie ma tu wymogów co do podobieństwa sekwencji
pomiędzy plazmidem a DNA rośliny dlatego, że jest to
rekombinacja niehomologiczna i przypadkowa.
Wymogi: super zwinięty DNA i gen markerowy, który
często wykorzystywany jest do selekcji protoplastów,
które są transformowane np. może być do gen oporności
na kanomycynę. Kanomycyna jest antybiotykiem który
zabija komórki eukariotyczne.
7. Precypitacja DNA:
Precypitacja DNA np. z fosforanem wapnia czy z glikolem polietylenowym
Na rysunku widzimy protoplasty roślinne i DNA, który tworzy precypitat. Ten precypitat
jest wspomagany np. glikolem polietylenowym
Po transformacji protoplastów doprowadza się do odbudowania ściany komórkowej
i regeneruje się całe rośliny.
Inną metodą wprowadzenia wektora do rośliny jest elektroporacja.