Mutageneza z otrzymanie całego szeregu mutantów: 

1.  Mamy  gen  którego  fragment  odpowiada  sekwencji  kodującej  reszty  istotne  dla  aktywności 

enzymu oraz miejsca restrykcyjne R1 i R2 otaczające te sekwencję czyli kasetę. 

2.  Zamiast wprowadzać różne mutację i badać ich efekt a także efekt kilku mutacji jednocześnie 

(może  zachodzić  synergizm)  wykonujemy  bibliotekę  oligonukleotydów  odpowiadające  tej 
kasecie. Biblioteka zawiera dla każdej pozycji i kombinacji pozycji, różne sekwencję  

3.  Bibliotekę poddaje się ligacji z wektorem. 
4.  Otrzymujemy bibliotekę fagów – tysiące mutantów 
5.  Biblioteką fagów poddajemy transformacji komórki bakteryjne. 
6.  Otrzymujemy  bibliotekę  w  postaci  kolekcji  klonów  które  są  dalej  analizowane  pod  kontem 

aktywności 

W ten sposób postępując otrzymuje się nowe białka o nowych ulepszonych właściwościach. 

Mutageneza sterowana oligonukleotydowo: 

 



 

Sekwencja normalna – typu dzikiego 



 

Oligonukleotyd  wprowadza  mutację  –  w  tym  wypadku  punktową.  Jest  w  części 
komplementarny do sekwencji typu dzikiego, po za miejscem które wprowadza mutację. W 
ten sposób można też wprowadzać delecję czy insercję 



 

Mutacja jest racjonalnie wprowadzona do sekwencji oligonukleotydu 

 



 

Sekwencja typu dzikiego w tym wypadku to sekwencja w kolistym wektorze M13(pojedyncza 
nić) ale może być to inny kulisty genom. 



 

ssDNA hybrydyzuje z nukleotydem 



 

Przy użyciu polimerazy DNA i dNTP-ów otrzymujemy cząsteczkę typu dsDNA 



 

Tym wektorem transformujemy komórki bakteryjne 



 

W bakteriach zachodzi replikacja DNA i podział komórek. Replikacja dotyczy obu nici! 



 

Otrzymujemy  2  typy  komórek  –  jedne  z  DNA  typu  dzikiego  a  drugie  ze  zmutowanym 
DNA(obie  nici)  w  zależności  od  nici  macierzystej  która  została  użyta  do  syntezy  DNA  tej 
komórki 



 

Bakterie  identyfikuje  się  po  wysianiu  na  podłoże  stałe  w  odpowiedniej  gęstości  tak  by 
możliwe było rozróżnienie klonów. 



 

Problemy pojawiają się w komórce na poziomie replikacji (?) ale sama metoda jest łatwa 

Poszczególne metody mutagenezy różnią się wydajnością gdyż metody te mają różne cele i problemy 
do rozwiązania 

Mutageneza przy pomocy PCR (mutageneza z wykorzystaniem megaprimera) 

 



 

Istotą techniki megaprimera(mega startera) jest to że wykonujemy 2 reakcje PCR 



 

Technika ta jest bardzo wydajna dla wprowadzania mutacji  punktowych – jeśli wszystko jest 
dobrze wykonane to mamy praktycznie 100% pewność że mutacja została wprowadzona 



 

W pierwszej reakcji korzystamy z 2 starterów – jeden zawiera mutację(forward – przedni) i ją 
wprowadza a drugi nie zawiera mutacji 



 

Otrzymujemy produkt w którym jest mutacja 



 

W  drugiej  reakcji  znowu  posługujemy  się  dwoma  starterami:    starter  przedni  nie  zawiera 
mutacji  a  drugim  starterem  jest  produkt  reakcji  pierwszej  –  jest  bardzo  długi  więc  jest 
megaprimerem 



 

Po  wykonaniu  drugiego  PCR  otrzymujemy  produkt  który  jest  identyczna  do  sekwencji  
wyjściowej z tą różnicą że wprowadziliśmy mutację 



 

Metoda nie jest prosta gdyż używamy mega starter 



 

Problemem  jest  temperatura  hybrydyzacji  –  jeden  starter  jest  krótki  a  drugi  jest 
megaprimerem 



 

Otrzymaną  sekwencję  zmutowaną  można  podmienić  z  sekwencją  typu  dzikiego  w 
wektorze(którego kopię sekwencji modyfikowano w PCR) ze 100% skutecznością 



 

Kolejną zaletą jest to że potrzebujemy 3 a nie 4 starterów.