Potem (…) pierwszej nici.. a także drugiej cDNA. Widzimy zatem transkrypt ,który posiada na 3'
końcu ciąg reszt A. Poli A ogon, do którego jest komplementarny oligonukleotyd. I ten oligo. służy
jako matrycy, jako starter do syntezy pierwszej nici cDNA. Następnie, nie wnikamy w szczegóły
jak to się robi, otrzymujemy drugą komp. Do niej nic i w ten sposób otrzymujemy cząsteczki
cDNA. Następnie jak P. możecie łatwo zauważyć z tego przeźrocza problemem jest 5' koniec, który
nie może być wprost zidentyfikowany z tak otrzymanej sek. cDNA. Nie może to jest zbyt twarde
stwierdzenie, ale moglibyśmy powiedzieć, że trudno jest taki koniec poznać, określić.
Dlaczego? Otóż dlatego proszę Państwa, że synteza pierw. Nici cDNA bardzo często nie przebiega
do końca. Tu macie Państwo jasno zaznaczone, widzicie Państwo czerwony krzyżyk, który właśnie
oznacza zakończenie syntezy. Powodów tego przedwczesnego zakończenia terminacji może być
wiele. Mogą być struktury różnego rodzaju mRNA, które zapobiegają, wyraźnie ograniczają
wydajność syntezę pierwszej nici. Może być niedoskonałość enzymu no powodów może być wiele.
Ale wszystkie one prowadzą do tego, iż po prostu pierwsza nić cDNA nie osiąga końca matrycy.
Tak, czyli odwrotna transkryptaza bo to ona prowadzi syntezę nie osiąga końca swojej matrycy,
jaką jest cDNA. Zatem w bibliotece cDNA bardzo często brak jest informacji. O czym? O
sekwencji 5' mRNA.
Czy to jest jasne? (chyba kiwaliśmy głowami :D) I teraz dlaczego ta informacja jest ważna. Otóż, ta
inf, której brakuje w takim eksperymencie jest ważna gdyż, czym jest koniec 5' RNA, albo jaką
informację niesie 5, koniec. On mówi nam o tym gdzie rozpoczyna się transkrypt, znaczy to jest
informacja o tym gdzie jest miejsce startu transkrypcji. No dobrze, no i co z tego można by zapytać.
Gdzieś się nad tym zawsze zatrzymam, co w tym takiego wielkiego? Otóż jest to ważne dlatego, że
wiele genów ma alternatywne miejsca startu transkrypcji. I jest ta sama inf. zapisana w DNA,
natomiast jest na różny sposób odczytywana właśnie z powodu alternatywnych miejsce inicjacji czy
też startu transkrypcji. Zwracałem parę razy uwagę na to, że repertuar genów, to na wykładach z
Genetyki głównie, ale mimo wszystko warto sobie to przypomnieć, repertuar genów człowieka czy
wyższych organizmów jest znacznie mniejszy niż repertuar ich produktów- białek. I tą wielorakość
produktów uzyskuje się na różne sposoby. I tym jednym z nich jest właśnie... są właśnie transkrypty
inicjowane w różnych miejscach. Stąd poznanie inf. o miejscu startu transk. Jest tak ważne i za nie
długi czas przedstawię Państwu metody, które temu służą, które pozwalają na określenie miejsca
startu transkrypcji. Czyli tu był problem narysowany i o jego rozwiązaniu za chwileczkę. Wcześniej
jednak, chciałbym, że byśmy się przygotowali (…) Otóż metody o których będę mówił, które
pozwalają na zidentyfikowanie sekwencji, która odpowiada startowi transkryptu, albo, które
pozwalają na znakowanie, bo to się , bo to jest tożsame, 5' końca transkryptu, te metody
wykorzystują bardzo prostu eksperyment, zasadniczo sprowadzający się do czego? Do hybrydyzacji
RNA i DNA, sekwencji RNA i genu. Właściwą metody omówię za chwilę. A teraz taki przerywnik,
(takiego bardzo prostego) eksperymentu, który ma może znaczenie bardziej historyczne niż
praktyczne. I który nam uświadomił w jaki sposób zostały odkryte introny. Otóż przeprowadzono
bardzo prosty eksperyment i ten eksperyment pokazał, że istnieją introny, i naprowadził na ich ślad.
Eksperyment który polegał na hybrydyzacji pomiędzy DNA, a mRNA. No i co się takiego stało?
mRNA (już w pełni procesowany), podkreślmy tutaj pokazany w kolorze niebieskim hybrydyzuje z
DNA. No i widać, że ta hybrydyzacja nie dotyczy całej sekwencji genu. Pierwsi badacze, którzy
taką hybrydyzację przeprowadzili byli właśnie zdumieni iż ona nie zachodzi na całej długości genu.
I zaczęli to wyjaśniać. I wyjaśnienie tego skończyło się odkryciem sekwencji intronowych. Zatem
introny one, tuitaj widzimy jako pentle, które nie hybrydyzują z mRNA. Czy coś jeszcze można
wyciągnąć z takiego eksperymentu? Albo czy można coś jeszcze powiedzieć dodatkowego, poza
tym, że nie ma pewnej hybrydyzacji? Można, np. jeśli tak powstałą strukturę, na poprzednim
schemacie pokazaną, jeśli ją podda się trawieniu nukleazą S1. Jeśłi podda się ją trawieniu nukleazą
S1 to co się stanie? Nukleaza S1 jest jak pamiętacie... może... trawi pojedyncze nici DNA i RNA,
więc te przede wszystkim pentle które widzicie zostaną zdegradowane i otrzmamy taką strukturę
jak tutaj państwo widzicie, w której będą odcinki typu ds tworzone jako hybrydy DNA-RNA. I
jeżeli teraz RNA zostanie zdegradowane np. przez zmianę pH na alkaliczne, to co się stanie? No po
prostu dostaniemy frag. Które będą odpowiadały czemu? No będą odpowiadały dokłądnie
sekwencjom egzonowym. No oczywiście nie będzie to dokładnie sekwencja egzonowa, bo nukleaza
może też jakieś końce ponadtrawiać, w sytuacji kiedy struktura nie jest do końca zamknięta. No ale
jakieś wyobrażenie o wielkości sekwencji egzonowych po takim eksp. Można już mieć. Wielkość
tych egzonów można wyznaczyć naturalnie, pytacie się Państwo jak, no oczywiści przez
elektroforezę, i to jest właściwie cała inf. jaką można w tym eksp. Uzyskać. Informacja, która
pozwala na określenie wielkości egzonów. Intronów też oczywiście, przez zsumowanie wielkości
egzonów, ale na tym się kończy. Eksp. Warty jest zauważenie, ze względu na znaczenie historyczne.
Teraz chciałem, przejść do głównych problemów, mianowicie jak przy pomocy hybrydyzacji bo tu
też była hybrydyzacja, można wyznaczyć sekwencje 5' końca transkryptu, tę istotną inf. o miejscu
startu transkrypcji. Pierwszą metodą jest metoda, która wykorzystuje nukleazę S1. Też nukleazę S1.
Otóż, jeszcze raz, celem eksperymentu jest znakowanie 5' końca transkryptu. Określenie w którym
miejscu transkrypcja się rozpoczyna. No i eksperyment jest schematycznie przedstawiony. On jest
podzielony na części, zwróćcie uwage od razu państwo i będziemy go teraz po kolei omawiali.
Aby wykonać taki eksperyment musimy dysponować oczywiście sekwencją genu. Są różne
warianty tej metody. Jeden z nich zilustrowałem na schemacie. Wymaga tego aby gen występował,
może na razie w ten sposób. Mamy pokazany ten gen na samej górze schematu. Widzą państwo
sekwencję, która jest sekwencją kodującą. To jest to pogrubione. Natomiast ta sekwencja
niepogrubiona to jest po prostu... hm.. dziwne... (PROBLEMY TECHNICZE). No więc, co jest
zaznaczone.. Cienką kreską to jest sekwencja niekodująca. Sek. która nie podlega transkrypcji. To
jest region 5', albo region upstream', który nie koduje, ale któy podlega transkrypcji. Transkryp
zawsze jest większy niż to co jest zbudowane przez transkrypt. Więc w tym regionie musi się gdzieś
rozgrywać to czego poszukujemy, czyli inicjacja transkrypcji. Pytanie jest takie w którym miejscu
ta inicjacja się zaczyna- tu , tu, może gdzieś tutaj. I to próbujemy w tym eksperymencie z nukleazą
S1 określić. I teraz w szczegółach jak to robimy. Frag, któy tutaj widzicie jest wybrany w jakiś
sposób. Mianowicie wybrany jest przez miejsca restrykcyjne. On ma długość 400 bp. No i to jest
pewna wskazówka. W tym eksperymencie ten fragment, który wybieramy z tego rejonu
analizowanego powinien mieć właśnie długość 300-400 bp. No i jak go wyciągnąć? No są różne
sposoby, najprostrzy jest tutaj pokazany, np. przez wycięcie go w oparciu o jakieś miejsca
restrykcyjne. W tym konkretnym przypadku to są miejsca rozpoznawane przez nukleazę Sau3A.
Równie dobrze można sobie wyobrazić, że można by go zamplifikować przez PCR tak zwany. Ale
do tego wrócimy. Teraz fragment jest następnie wklonowywane do wektora M13. Po co? O tóż
wektor M13 pozwala nam, jak Państwo pamietacie, pozwala nam otrzymać DNA w postaci
pojedynczej nici. I to bardzo ułatwia dalszy przebieg eksperymentu. Są warianty trawienia nukleazą
S1, gdzie nie klonuje się w M13. Ale tak jak mówię, takie postepowanie bardzo ułątwio otrzymanie
dobrego wyniku. A więc otrzymujemy ten fragment, proszę poparzeć na schemat, ten który
wybrany jest przez miesjca rest., otrzymujemy go w wektorze M13. Po przejściu przez M13
otrzymujemy kolisty DNA wektora zawierający nasz frag. W postaci pojedynczej nici. W
następnym etapie ekpserymentu z tą kolista cząsteczką DNA, zawierającą fragmenty danego genu,
jest hybrydyzowany z mRNA. Ten mRNA dodajmy, nie musi być oczysczony, to może być preparat
heterogenny. Ale przecież, z tą konkretną sekwencją w warunkach eksperymentu hybrydyzują tylko
właściwe cząsteczki mRNA. Jasne? Do tej pory wszystko jest jasne proszę Państwa? Jak nie, to
pytajcie mnie... (cisza na sali)
To nie jest prosty eksperyment, ale starałem go się na tyle na ile mogłem go... Jeszcze raz szybko
podsumujmy co się stało: wyjęliśmy fragment z genu, poprzez wycięcie go enzymem
restrykcyjnym; on obejmuje część sekwencji, która jest sekwencją kodującą, transkrypcja biegnie
prawda, z któregoś miejsca tutaj, w tym kierunku, ten frag. Został wklonowany do wektora M13, co
posłużyło do otrzymania, DNA w postaci pojedynczej nici, po to aby ona łatwo mogła
hybrydyzować z transkryptem. To jest wyjaśnienie dlaczego przejście na pojedyńczą nić. Jasne? No
i cał szczęście..
Dalej. To co widzicie państwo na samej górze, to już widzieliśmy w trakcie. Czyli mamy kolistą
cząsteczkę DNA z frag. Wyciętym z sekwencji genu, i ona jest zhybrydyzowana z naszym
transkryptem. Następnie, taki cały konstruk jest trawiony nukleazą S1. Przypomnijmy sobie jeszcze
raz co jest substratem nukleazy S1? Pojedyncze nici DNA i RNA. Więc co zostanie strawione?
Zostaną strawione- ta cała struktura, popatrzcie na schemat, czyli cały ten frag. Wektora, plus ten
frag, tego frag wklonowanego, czyli ta cała pojedyncza nić. Oprócz tego mRNA, to co nie jest
zhybrydyzowanym fragmentem. (PROBLEMY TECHNCZNE) No więc jeszcze raz. Nukleaza S1
trawi ten cały jednoniciowy odcinek DNA i również jednoniciowy odcinek RNA. Bardzo dziękuję...
(PROBLEMY TECHNICZNE, CIĄG DALSZY) I teraz wracamy do schematu. Zatem po trawieniu
otrzymujemy taką cząsteczkę hybrydową. W któej mamy zhybrydyzowany RNA, z tą nicią DNA
pochodzącą z genu. Teraz proszę Państwa zastanówmy się co to jest tak naprawdę i czemu
odpowiada ta cząsteczka. Otóż, to jest nic innego jak fragment RNA przyłączony poprzez
oddziaływania komplementarne, do sekwencji genu, o jakiej długości ten fragment? Otóż długości
ograniczone z jednej strony miejscem restrykcyjnym, a z drugiej strony ograniczona długość tego
fragmentu jest czym? Tym, skąd zaczęła się jego transkrypcja. Czy to jest jasne? Obawiam się, że
nie. Ale popatrzcie Państwo jeszcze raz jak jest określony ten odcinek. Poprzez samo graficzne jego
przedstawienie- tutaj mamy cienki fragmencik, tą cienką linię; i to co jest grube pochodzi z genu. Z
sekwencji kodującej. Transkrypt jak biegnie? On się zaczyna gdzieś o w tym obszarze i w tą stronę
przebiega transkrypcją. Tu mamy ten fragment transkryptu, który jest niekodujący i potem już jest
to co koduje. To widzicie to, tak? I teraz proszę popatrzeć od razu na tą część schematu. Widzimy
tutaj transkrypt przyłączony. W tą stronę, to jest ta część transkryptu, która obejmuje obszar
kodujący. Natomiast tutaj, jest ten fragmencik, który, jest poza tym gruby frag DNA i ono
odpowiada tej sekwencji. Widzicie to? Zatem jeżeli teraz byśmy sobie to tak wyobrazili obracając
tym obrazem dalej, to znów mamy to samo pokazane. Teraz jeżeli to odtrawimy to wszystko i
odtrawimy to, to dostanie po prostu.. no właśnie.. to dostaniemy ten fragmencik w postaci
komplementarnej struktury DNA i RNA. Widzicie to Państwo? Teraz, zatem, to miejsce, to jest
miejsce startu transkrypcji na cząsteczce RNA. Tu jest ta sekwencja Rozumiemy to? Teraz trzeba
sobie odpowiedzieć na jedno pytanie, jak ją poznać? Otóż wiemy, jaka ta cząsteczka jest, gdzie ona
zhybrydyzowała, a teraz chcemy wiedzieć jaka to jest sekwencja. To się poznaje w sposób pośredni,
ale bardzo sprytny. Mianowicie, popatrzcie Państwo na schemat. Jeżeli mamy hybrydową
cząsteczkę, to dalej co się z nią dzieje? Ją się denaturuje i jednocześnie przeprowadza się hydrolizę
RNA w środowisku alkalicznym. I po tym traktowaniu dostajemy DNA, nić DNA, która jest czym?
Która jest dokładnie komplementarną nicią tego odcinka, który był z nią wcześniej związany. I teraz
jaka jest długość tej nici? Czyli jaką inf. możemy otrzymać na podstawie tej długości? Popatrzcie
państwo, długośc tej nici dokładnie odpowiada czemu? Temu odcinkowi RNA/tego schematu (ale
nie ma pewności) Jasne? A co to jest innymi słowy? To jest odległość pomiędzy miejscem
restrykcyjnym, bo przecież jeden z końców tego fragmenciku DNA został określony przez miejsce
restrykcyjne, a miejscem startu transkrypcji. Czy to jest jasne? To jest jeden z wariantów metody
S1. Dobrze, nie będę tego wariantu pokazywał, by Państwu nie mącić. Może potem. To jest
mapowanie przy pomocy nukleazy S1. Mapowanie 5' końca transkryptu. Istotą tego mapowania jest
to, że po całym eksperymencie otrzymujemy fragment DNA, którego długość dokłądnie odpowiada
długości między miejscem restrykcyjnym, a miejscem startu transkrypcji i teraz długość tą
wyznaczamy za pomocą elektroforezy oczywiście. I teraz z sekwencji genów możemy określić
dokładnie miejsce startu transkrypcji. No bo przecież odczytujemy wtedy po prostu sekwencję,
pomiędzy miejscem restrykcyjnym, a sekwencją w odległości dokładnie takiej jaka odpowiada
wielkości wygenerowanego fragmentu. I w ten sposób poznajemy miejsce startu transkrypcji 5'. Tę
samą metodę oczywiście trochę inaczej zaprojektowany jest eksperyment; Można używać do
wyznaczania końca sekwencji transkryptu. Można używać jej też do mapowania granicy
intron/egzon, ale o tym już nie będę mówił. Kolejna metodą, która jest używana do wyznaczani 5'
końca transkryptu, jest metoda, którą nazywamy metodą mapowania 5' końca poprzez wydłużanie
startera „locating and transkription start point a primer extension”. Primer extension to jest właśnie
wydłużanie tego startera, albo primera. Ta metoda jak zobaczymy, z jej historii wynika, jest metodą,
która nie nadaje się do mapowania 3' końców transkryptu, ale 5' koniec może być przy
wykorzystaniu tej metody bardzo dobrze zmapowany. Metoda jest tak prosta, że aż dziw bierze, że
przez jakiś czas stosowano inne metody, np. mapowanie S1. I tutaj trankrypt jaki używany jest nie
musi być dostarczony w formie oczyszczonej. Można mieć po prostu mieszaninę transkryptów,
czyli mRNA z komórki. Specyficzność określana jest nie przez oczywszczenie transkryptu, a przez
starter. Właśnie starter/primer. No i co widzicie Państwo? Mamy pokazany transkrypt, on jest
pokazany tu jako U1, no bo chodzi o to by pokazać to co specyficznie ma miejsce. A więc mamy
transkrypt i mamy starter. Czyli w tym przypadku musimy znać oczywiście sekwencję transkryptu,
przynajmniej w części, aby ten starter móc zaprojektować. I co dalej? Starter oczywiście wiąże się z
transkryptem i to jest starter, który używany jest przez odwrotną transkryptazę. Odwrotna
transkryptaza zatem syntezuje w tym kierunku oczywiście biegnie synteza, tu jest 3' koniec, tu
mamy ' koniec transkryptu, zatem starter jest w ten sposób przyłączony, że tu jest koniec 3', no i
począwszy od tego 3' końca, następuje synteza nici cDNA, komplemtarnej do transkryptu. I teraz
jaka jest długość tej nici? Długość tej nici jest oczywiście zdefiniowana przez dwa punkty. Przez
dwa fakty: 1) przez miejsce z któym komplementarny jest 5' koniec startera, to jest jeden punkt. A
drugi, jest to, jest po prostu koniec transkryptu. Jak się końćzy transkrypt, odwrotna transkryptaza
po prostu kończy syntezę. Zatem znów mamy produkt, o bardzo określonej długości, i ta długość
produktu wyznacza nam, jeśli ją odniesiemy do tego punktu przyłożenia startera, ta długość
wyznaczy nam w sekwencji genu, miejsce rozpoczęcia transkrypcji. I jak to się dalej robi? Dalej
denaturowany jest RNA, tak naprawdę w alkalicznych warunkach ulega hydrolizie i znów
otrzymujemy sam cDNA, którego długość jest wyznaczana precyzyjnie przez elektroforezę, i jeżeli
np. powiedziano tu jego długość to 239 nukleotydów, to znaczy że w odległości 239 nukleotydów
od miejsca przyłożenia startera tu już jest to na sekwencji genu pokazane, w tej odległości mamy
sekwencję która jest początkiem transkrypcji. Na dobrą sprawę w tej metodzie i poprzedniej, od
precyzji wyznaczenia długości, zalezy też precyzja wyznaczenia miejsca startu transkrypcji. No i
tutaj, przypomnę jeszcze raz, zwrócę państwa uwagę na to, że ta metoda już nadaje się tylko do
mapowania końca 5'. To wynika z istoty prawda, tego jak starter jest przyłączony. Nie można
takiego startera zaprojektować, że by po prostu wyznaczał 3' końca.
Kiedy weszła do codziennego użycia metoda PCR, to została opracowana metoda która w skrócie
również do mapowania transkryptu, 3' końca. Która nosi nazwę RACE (??) To jest akronim od
Rapid Amplification of cDNA Ends. RACE. Metoda, która na pozwala na zmapowanie 5' końca
transkryptu, jeżeli nawet jest go bardzo mało, dlatego, że tutaj inherentną cechą tego eksperymentu
właściwą jemu jest po prostu PCR. No i mamy schemat. Początek jest bardzo podobny do tego co
Państwo widzieli. Czyli do Primer Extension, techniki, mianowicie, znów mamy pokazany
transkrypt, który oczywiście siłą rzeczy nie jest oczyszczany tylko (…) on występuje ale jest w
bardzo małej ilości, więc z tym transkryptem, którego charakterystykę musimy znać, przynajmniej
części, sekwencji i ją możemy zgadnąć na podstawie biblioteki cDNA, albo biblioteki genomowej.
Zauważmy, że w jednej i drugiej bibliotece niekoniecznie musimy odnaleźć informację której teraz
poszukujemy, to znaczy cDNA. Siłą rzeczy, a w genomowej sama sekwencja niekoniecznie musi
nam mówić o miejscu startu transkrypcji. Zatem, ale dostarcza na informacji do miejsca w którym
starter powinien być komplementarny. No i teraz zatem widzą Państwo transkrypt. Z nim
hybrydyzuje starter. I odwrotna transkryptaza prowadzi syntezę nici cDNA. W zasadzie gdybyśmy
mieli dostatecznie dużo transkryptu, prawda i powstało by dużo produktu, to na tym miejscu
moglibyśmy zakończyć eksperyment Primer Extension. Ale RACE idzie dalej. Co dalej się dziej?
Pierwsza nić cDNA jest oddzielana od reszty transkryptu poprzez denaturację, RNA jest
hydrolizowany i następnie, do końca 3' otrzymanej nici cDNA, dodawane są reszty A. Dlaczego?
Otóż, proszę Państwa chodzi o to, by nić, cDNA, które przecież końca nie znamy i tą sekwencję
chcemy poznać, wyznaczyć, zatem nie wiemy jaka ona jest, i chcemy ten 3' koniec zaopatrzyć w
znaną sekwencję. To można zrobić, np. dodając ciąg reszt A. W jaki sposób? W reakcji terminalnej
transferazy. To co widzą Państwo na schemacie to jest pokazany ciąg resz N, to jest właśnie ta
nieznana sekwencja, którą chcemy poznać, by określić miejsce startu transkrypcji, zatem sekwencja
nieznana. Ale do niej, dokładamy ciąg reszt A, poprzez terminalną transferazę. Zatem otrzymujemy
nić cDNA, pierwszą, która posiada dwie znane bardzo dobrze sekwencje: po pierwsze... znaczy
przynajmniej jedna... po pierwsze- sekwencję która była sekwencją startera- ta jest znana. I po
drugie, to jest 5' koniec, po drugie, na 3' końcu mamy ciąg reszt nieznanych.. to jest to tych wiele N
pokazanych, i dalej ciąg reszt A. Co dalej się dzieje? No dalej to już wykonujemy PCR i w ten
sposób otrzymujemy produkt o ściśle określonej długości, którą możemy wyznaczyć i możemy też
zsekwencjonować ten produkt i w ten sposób poznać dokładnie to miejsce startu transkrypcji. No
PCR jest oczywiście trochę niestandardowe, gdyż matryca na początku jest nicią pojedynczą.
(38:28)
Ale to też nie stanowi większego problemu, dlatego, że do sekwencji 3' końca transkryptu możemy
przyłączyć starter, który jest oligo dT, ze względu na ciąg A. I teraz w pierwszej reakcji zostanie
zsyntetyzowana nic komplementarna, otrzymujemy cDNA typu ds, to już jest prawidłowa matryca
do dalszych reakcji PCR, których startery są określone w sposób oczywisty, ale może podkreślmy
to: Jednym jest sekwencja oligodT, a drugim jest sekwencja tego startera, który był używany w
pierwszej reackji odwrotnej transkryptazy. W tej sposób otrzymujemy 3' koniec zmapowany w
reakcji RACE, która czasem jest określana jako 5'-RACE, gdyż mapujemy 5' koniec. Kojarzą już
państwo teraz te eksperymenty? Jak są jakieś pytania, to zapraszam. A jeśli nie ma to... (CHWILA
PRZERWY)
No więc omówię teraz mapowanie S1, na podstawie innej ilustracji i też wykonywane troszszkę w
inny sposób. Chcę tutaj z jednej strony włąśnie pomóc Państwu zrozumieć istotę mapowania S1 5'
końca transkryptu, a z drugiej strony też pokazać jak różnorodne są te metody, przy tej samej
filozofii oczywiście. I zwrócić uwagę na pewne szczególne elementy tego eksperymentu. Więc
tutaj... Może w starym eksperymencie, który omówiłem wcześniej, mieliśmy istotny elementk,
którym było otrzymanie pojedynczej nici z faga M13, tutaj nie jest to potrzebne, dlatego, że
zastosowany będzie szczególny sposób znakowania cząsteczek DNA. Tam w ogóle cząsteczki
DNAnie były znakowane radioaktywnie. No wieć popatrzmy na ten rysunek. Znów musimy
dysponować genem, np. jakimś plazmidzie, i teraz to co widza P., to co mamy też z genu wycinany
jest jakiś fragment, on jest wycinany , w tym konkrenym, przypadku przy pomocy, enzymu
BAMH1, także dwa miejsca restrykcyjne, które właśnie pozwalają na wycięcie fragmentu genu. I
znów tutaj jest tak, że ten wycinanyfragment musi obejmować odcinek w którym potencjalnie
zaczyna się transkrypcja, to jest tu pokazanestrzałką. Oczywiście miejsce przyłożenia tej strzałki,
początek transkryptu, nie jest znane, na początku, musimy to jakoś oszacować. I fragmensekwencji,
która prawdopodobnie będzie sekwencją kodujaca, tu na tym schemacie nie jest zaznaczona. A więc
przy pomocy BamHI wycinamy fragment DNA, który następnie musi być zaznakowany w tym
postępowanieu, zaznakowany radioaktywnie. To znakowanie fragmentu w tym konkretnym
eksperymencie jest używana kinaza polinukleotydyowa, kinaza polinukleotydowa, pozwala nam,
przypomnijmy sobie, na znakowanie, czego? 5' końców DNA. Czyli na 5' koniec DNA, kinaza
polinukleotydowa transferuje, przenosi, reszty kwasu fosforowego. I jeśli te reszty są zaznakowane
radioaktywnie, przez izotop fosforu, np. P-32, to wtedy mamy znacznik na 5' końcu. I proszę
popatrzeć. Tu właśnie użyto kinazy polinukleotydowej. Jej substratem jest ATP. Nie dATP, a ATP,
już mówiłem kiedyś. I on jest zaznakowany w miejscu gamma-P32, ta reszta gamma jest
przenoszona na 5' koniec. Proszę jeszcze uważnie popatrzeć jeszcze na tę część schematu, co
jeszcze było użyte? Fosfataza alkaliczna. Czy ktoś z państwa zgadnie dlaczego? Wcześniej przed
znakowaniem? Ktoś ma jakiś pomysł? (z widowni: By defosforylować 5' koniec? Dalej
niewyraźnie) Bardzo dobrze... Ponieważ fragment, który jest wycinany enzymem restrykcyjnym
posiada reszty kwasu fosforowego na 5' końcach. A teraz aby kinaza efektywnie oznakowała ten
fragment, te reszty muszą być najpierw usunięte. Ja kiedyś mówiłeś, że fosataza i kinaza właściwie
dokonują podmiany. Jeżeli użyje my najpierw fosfatazy a potem kinazy, to na tym fragmencie nic
się nie dzieje, chyba że reszta kwasu fosforowego będzie oznakowana. A więc maym reszty kwasy
fosforowego na 5' końcach, na tym fragmencie. Zauważmy, że one są na obu końcach. To w tym
eksperymencie jak dalej zauważymy to nie jest zbyt korzystne. Więc trzeba zatem z jednego z
końców usunąć znacznik radioaktywny. Aby to zrobić w tym konkretnym przypadku skorzystano z
faktu, że w tym fragmencie istnieje jeszcze jedno dodatkowe miejsce restrykcyjne SaRI (??), ono
było na samym początku zaznaczone. Tu wracamy do niego. Jeżeli teraz SaRI , korzystają z niego,
odtrawimy ten fragmencik DNA, oddzielimy przez elektroforezę, to dostaniemy fragment, który
jest zaznakowany tylko na jednej nici. Oznakowanie jest potrzebne później, aby w elektroforezie
określić wielkość fragmentów. Zatrzymajmy się na moment w tym miejscu. Jak sądzicie Państwo,
czy można inaczej otrzymać ten fragment, zaznakowany na jednej nici na 5' końcu? Jakąś
alternatywną drogą do tej, która jest pokazana na schemacie. Ktoś ma jakiś pomysł? Powinniście
mieć jakiś. Nikt nie ma? Jak moglibyśmy inaczej otrzymać ten fragment, nie wysilając enzymów
restrykcyjnych? Dowolny fragment z dowolnie dużego fragmentu DNA, nie posługując się
enzymem restrykcyjnym. No jasne! No pewnie, że przez PCR. Czyli moglibyśmy nawet gdyby tu
nie było żadnych sekwencji rozpoznawanych przez BamHI, jakieś Hindy, Eco, i co tam jeszcze co
świat widział i nie widział, to moglibyśmy przez PCR, wybierając startery, zamplifikować sobie
dowolny fragmencik, który takiej analizie będzie służył. Teraz jak będziemy mogli wprowadzić
znacznik? Nie posługując się kinazą polinukleotydową? Ktoś ma jakiś pomysł? (widownia) Pani
powiedziała, żeby już starter był zaznakowany. No i bardzo słusznie byśmy wtedy sprawę
rozwiązali w jednej reakcji. A oczywiście PCR ze zaznakowanymi oligonukleotydami gdzie jest
eksperyment.. no trochę nerwowy(??), ale przecież są wykonywane z tym nie ma problemu. Czyli
byśmy po prostu otrzymali zatem fragment ze znakowanym jednym z końców, wybranym przez nas
przez wybór startera. No i dobrze. Czyli mamy dalej mamy fragment otrzymany przez PCR. Teraz
ten fragment jest denaturowany. Bo tu mamy ds cząsteczkę. Denaturujemy i hybrydyzujemy ją z
transkryptem. I akurat w tej ilustracji i akurat pomyślałem, że dobrze ją tak pokazać. Mamy bardzo
dobrze oddane co się dzieje podczas hybrydyzacji. Transkrypt, ten czerwony hybrydyzuje z naszą
sondą, naszą pojedyńczą nicią. Teraz popatrzcie tutaj, jak to doskonale widać na tej ilustracji.
Mamy tę część transkryptu, która odpowiada sekwencji na pewno nici kodującej, i mamy tę część,
która w części może odpowiadać kodującej, gdzieś tutaj, ale też części tej niekodującej. I zatem
powstaje taka cząsteczka, którą poddajemy nukleazą S1. Na skutek trawienia, odpada ten fragment
DNA i ten fragment haplotypu(??). Dostajemy dostajemy cząsteczkę typu ds, której odległość na
DNA z tego miejsca do tego, dokładnie odpowiada odległości między miejscem restrykcyjnym, czy
miejscem przyłożenia startera, jeżeli byśmy to robili PCR, a miejscem startu transkrypcji. I
następnie taka cząsteczka, jest denaturowana i jej wielkość wyznaczana jest przez elektroforezę.
Ponieważ DNA jest znakowany, łatwo go obserwować, w elektroforezie i możemy wyznaczyć
posługując się odpowiednimi markerami wielkość tego fragmentu, a zatem odległość od miejsca
restrykcyjnego, do miejsca startu transkrypcji i znów w ten sposób wyznaczamy sekwencję startu
transkrypcji. Ten eksperyment jest myślę, że już dopełni Państwa wiedzę o mapowaniu S1. Czy są
jakieś pytania tutaj? Nie widzę. Zatem przejdźmy z powrotem do wykładu w wersji nowszej.
Race mamy już umówiony. Przejdziemy zatem teraz do już nie analizy samego transkryptu, znaczy
wprost transkryptu ile do metod, które pozwalają w jakiś sposób badać regulację ekspresji genów.
Otóż metod jest wiele oczywiście i one są różne. Ta paleta... Zaczniemy może od tych, których
celem jest identyfikacja sekwencji kontrolnej, kontrolującej ekspresję genów. Mamy sobie zdać
sprawę, o co tutaj chodzi i czego tak naprawdę szukamy. Jest pokazany schemat. W którym mamy
pokazany gen jako sekwencja no kodująca jakiś produkt białkowy i ten gen ulega ekspresji, dlatego,
że co? Że istnieje promotor, czyli sekwencji, która wiąże polimerazę i inne dodatkowe białka w
systemie eukariotycznym. Ale oprócz tego istnieją sekwencje kontrolne. Sekwencje kontrolne to
jest nic innego jak sekwencje, które oddziałują z różnego rodzaju białkami. Których oddziaływanie
wpływa na poziom transkrypcji. I badanie czegoś co nazwaliśmy regulacją ekspresji genów, polega
między innymi na tym, że te sekwencje kontrolne poznajemy... poznajemy białka, które z tymi
sekwencjami tworzą kompleksy no i ta cała widza służy nam w zrozumieniu tego jak cała ta
ekspresja genów jest kontrolowana, od czego ona zależy na dobrą sprawę. Ta wiedza jest
oczywiście potrzeba w przypadku genów, które mają znaczenie jakieś w medycynie prawda, wśród
innych... czy w biotechnologii do regulacji ekspresji genów, tak, których produkty są ważne ze
względu gospodarczych, czy jakiś praktycznych. No więc ta wiedza jest bardzo podstawowa, no ale
te implikacje są bardzo konkretne. Chciałem teraz uwagę państwa skupić na metodach, które
właśnie służą najpierw identyfikacji tych sekwencji. Więc będziemy się powiedzieć, która to
sekwencja oddziałuje z jakimś tam interesującym nas białkiem. Pierwszą z metod jest metoda,
której nazwa, ja ją najpierw na slajdzie wyświetlę.. Która jest różnie podawana, ale jedną z nich jest
nazwa angielska Gel Retardation Experiment, albo Gel Retardation Assay. Czyli to jest tak opisowo
podając, eksperyment zmiany ruchliwości elektroforetycznej. Inna nazwa, inny skrót którym często
się posługujemy, to jest skrót EMSA, a pochodzi ta nazwa od: Electroforetic Mobility Shift Assay,
czyli Test Zmiany Ruchliwości Elektroforetycznej. EMSA. W laboratorium, jak ktoś mówi, to
wykonuje taki eksperyment, to nie mówi o żadnej EMSie, o zatrzymaniu, o żadnej zmianie
ruchliwości, tylko mówi o Shifcie... (dywagacje) A jak mu nie wychodzą te eksperymenty to mówi
o Shicie (żart), ale proszę tego nie zapisywać (akurat) Technika jest bardzo prosta, dlatego, że
właśnie jej istotą jest właśnie, że obserwujemy ten Shift, czyli zmianę ruchliwości, albo
zatrzymanie w żelu „Gel Retardation” Stąd bierze się przesuniecie, czy to zatrzymanie. To ilustruje
nam dobrze, schemat, widzą państwo żel. W podręczniku Browna często jest mowa o żelu
agarozowym w odniesieniu do, w kontekście do eksperymentu EMSA. I tak też się wykonuje ten
eksperyment. Ale z reguły jest to żel poliakrylamidowy, który ma wyższą rozdzielczość. Ale istota
jest taka sama w jednym i drugim przypadku. Widzą państwo dwa ślady, które różnią się czym? W
pierwszym śladzie, w tych samych warunkach jest eksperyment dla jednego i drugiego śladu, był no
elektroforezowany fragment DNA. Tu jest pokazany ten fragment, on sobie wędrował. Fragment,
musimy widzieć, to znaczy on jest z reguł zachowany w jakiś sposób. Np. radioizotopowo, przez
kinazę T4. Ale może być też w każdy dowolny sposób inny zaznakowany, dlatego, że w tej
technice, nie obserwujemy sekwencji, tylko widzimy fragment jako taki. Nie analizujemy
sekwencji. A więc fragment ma jakąś tam ruchliwość wynikającą z jego wielkości, ładunku. W
drugim śladzie był przeprowadzany rozdział elektroforetyczny, analiza elektroforetyczna, tego
samego fragmentu, ale wcześniej inkubowanego z białkiem. I teraz jeżeli białko, tworzy
specyficzny kompleks z sekwencją fragmentów, to wtedy co się dzieje? No powstaje ten kompleks,
powstaje cząsteczka, która jest jaka? Oczywiście większa, o większej masie jest, niż sam fragment,
wolny, niezwiązany z białkiem. Ponieważ powstaje kompleks, który jest większy niż fragment, to
ruchliwość tego kompleksu jest mniejsza. I stąd bierze się zmiana ruchliwości elektroforetyczne,
albo stąd bierze się to zatrzymanie w żelu. Technika jest konceptualnie bardzo prosta, oczywiście w
praktyce tak łatwo nie jest, ale jest to technika bardzo chętnie wykorzystywana do w odpowiedzi na
pytanie czy dany fragment, i dane białko, które badamy, tworzą specyficzny kompleks, czyli
kompleks jest specyficzny, to w określonych warunkach możemy widzieć tą zmianę ruchliwości.
Pokażę teraz państwu ilustrację jednego z eksperymentów, w którym technikę EMSA się wykonuje.
Czy wykorzystuje. Widzą państwo tutaj, jakiś fragment sekwencji, widzimy gen, a także sekwencję,
która jest położona upstream, w stosunku do tego genu, czyli tam z reguły są lokalizowane
sekwencje kontrolne i dla tego genu i sekwencji upstream, jest poznana mapa restrykcyjna,
dysponujemy mapą restrykcyjną. Przy pomocy jakiegoś definiowanego enzymu zatem trawiono tą
sekwencję i dowiedziono, że po trawieniu otrzymujemy fragmenty o ściśle określonej długości i
one odpowiadają określonym sekwencjom. Mamy fragment 1,2,3 ,4,5 i tak dalej. Ich lokalizacja i
tożsamość dokładnie znana. Czyli jeżeli po trawieniu enzymem restrykcyjnym, otrzymany
fragment o długości odpowiadającej trójce, to dokładnie wiemy, że to jest trójka i że dokładnie ona
jest z tego miejsca w sekwencji. Czy wszystko jasne jest? Teraz eksperyment wyglądał w ten
sposób, że chciano odpowiedzieć sobie na jakie pytanie? Czy któryś z tych fragmentów, tworzy
specyficzny kompleks z białkiem X, znaczy czy istnieje jakieś miejsce kontrolne. Do tego
zmierzano, prawda? Więc DNA poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym Tym R i otrzymano
oczywiście kolekcję tych fragmentów. Ponieważ nie wiedziano, który z nich może ma miejsce
kontrolne, to wszystkie te fragmenty zostały zaznakowane kinazą i następnie inkubowano je z
białkiem. I wykonano eksperyment EMSA i wytłumaczono, że powstaje specyficzny kompleks.
Potem można te DNA z kompleksu wyekstrahować określić jego masę cząsteczkową, i co wtedy?
Będziemy wiedzieli, który dokładnie z fragmentów w tworzeniu tych specyficznych kompleksów
uczestniczył no i okazało się, że to jest fragment trzeci. Jasne? W ten prosty sposób można było, po
pierwsze odpowiedzieć sobie na pytanie czy istnieje sekwencja kontrolna, a po drugie przypisać ją
określonej sekwencji w genie. Pokażę teraz Państwu eksperymenty EMSA, takie jak one w
rzeczywistości dają obrazy, pomyślałem sobie, że dlaczego nie. To są wyniki otrzymane w naszym
laboratorium, przed wieloma laty, przez Panią, wtedy magister, Anitę Niedzielę-Mańkę, która wtedy
miała na celu opisanie oddziaływania dwóch domen, wiążących DNA, z białek, które w skrócie są
oznaczone ECR i USP, to są receptory jądrowe, które tworzą aktywny kompleks heterodimeryczny,
który reguluje ekspresję genów zależnych ektyzonu(??), wielu owadów, głównie opisywanych dla
Drosophili. No i w czasie kiedy Anita te eksperymenty wykonywała, nie było wtedy w zasadzie...
niewiele wtedy było wiadomo o zasadzie oddziaływania z DNA tego heterokompleksu i nic nie
było wiadomo na temat architektury oddziaływania, jak wygląda w szczegółach molekularnych
powstający kompleks, jaka jest jego specyficzność, my byśmy postanowili, że otrzymamy domeny,
fragmenty obu receptorów, i zaczniemy działać oddziaływania tych domen, właśnie z DNA.
Domeny otrzymaliśmy w formie rekombinowanej, czyli nad ekspresjonowane były w komórkach
bakteryjnych, potem Anita je oczyściła i potem mając już czyste domeny, postanowiła zbadać ich
integrację z DNA. I pytanie było bardzo proste. Czy te rekombinowane białka, w ogóle wiążą
DNA. I jeśli tak, czy jest to oddziaływanie specyficzne. No i te wcześniejsze eksperymenty, ja
wykonywałem, pokazywały, że taką dobrą, sekwencją jest sekwencja pochodząca z regiony,
promotorowego tego Hsp27, tu jest ta nazwa podana, i tą sekwencję żeśmy sekwencjonowali i
zaznakowali radioizotopem. No i teraz wyniki, które państwu pokazuję, są pierwszą analizą
oddziaływania tych rekombinowanych domen, zaznakowanych tych fragmentów Hsp27. Widzą
Państwo 3 panele. 1,2,3. które są czym? To są wyniki miareczkowania fragmentu Hsp27, najpierw
białkiem UspDBD, czyli domeną wiążącą DNA białka USP, botem białka ECR, a na końcu
mieszaninę obu. Po mieszaninach, odpowiada sytuacji, jak się nam wtedy wydawało, zresztą
okazało się to prawdą, sytuacji, w której obie domeny integrują z sekwencją DNA. No i proszę
popatrzeć w tym kierunku, to co jest zaznaczone tu na górze schematu wzrasta, czyli mamy kolejne
ślady, które odpowiadają, wzrastającemu stężeniu czego? Domeny DBD-USP, no i widać, że w
miarę wzrostu stężenia, pojawia się tutaj pasmo, bardzo silne, które jest czym? Skutkiem,
zatrzymania, skąd ono się bierze? Zatrzymania ruchliwości wolnego DNA. Tu jest wony DNA, na
skutek czego? Na skutek powstawania kompleksu. Dodatkowe, eksperymenty, zresztą zaraz
Państwu pokażę jeden z serii, pokazały, że to pasmo jest specyficzne. W drugim eksperymencie
mamy pokazany wynik, analizy w której badała koleżanka oddziaływanie z z domeną ECR, widać,
że zachowanie jest zupełnie inne. W tym samy zakresie stężeń, domena dawała dwa różne pasma,
które świadczyły o powstawaniu dwóch klas kompleksów, myśmy to zinterpretowali jako kompleks
monomeryczny, a potem homodimeryczny. I wreszcie trzeci eksperyment, w którym były oba
białka obecne. Też powstaje jeden kompleks, o bardzo już zmienionej ruchliwości. Zauważcie
państwo, że ten kompleks i jego ruchliwość różna od tego, a to jest kompleks samego ECR-DBD, a
także różna od ruchliwości samego USP-DBD, zatem, jeśli są obie domeny obecne w roztworze i
DNA, powstaje kompleks, który posiada zupełnie inną charakterystykę ruchliwości niż każdy z
osobna i jest to kompleks specyficzny. Czyli tutaj, jest ilustracja, do techniki EMSA, która pozwala
na eksperyment w którym po prostu obserwujemy oddziaływanie, które jest oddziaływaniem białko
DNA, eksperyment EMSA można też wykonywać w różnych bardzo ciekawych wariantach.
Mianowicie można np. badać oddziaływanie z wariantowymi sekwencjami DNA. To znaczy, takimi
sekwencjami, w których wprowadzane są mutacje, tak? Jeżeli już określimy miejsca oddziaływania,
mamy wyobrażenie, które dokładnie reszty mogą być zaangażowane, jak to się robi, później o tym
powiem. To możemy te reszty zmienić, jakoś, poprzez prowadzanie mutacji w sposób definiowany,
i możemy w ten sposób zbadać wpływ na oddziaływanie tych zmienionych reszt. Możemy też
wprowadzać, mutacje niejako od drugiej strony- do białka. I teraz wprowadzając mutację do białka,
możemy wnosić, które reszty w białku są istotne, dla oddziaływania,a które nie. Tego rodzaju
eksperyment, właśnie budowania białka, jest pokazany na tym schemacie. To jest również
eksperyment EMSA, który był wykonany przez inną osobę, a mianowicie, przez panią podówczas
Panią mgr inż. Ilonę Graf, która otrzymała wówczas całą kolekcję mutantów, USP-DBD. Kolekcję,
otrzymano w sposób bardzo systematyczny, a mianowicie poddano mutagenezie. Wszystkie reszty,
które znajdowały się w taki obszarze, który nam się wydawał takim krytycznym, dla tworzenia
specyficznych kontaktów z sekwencją Hsp27 i poszczególne reszty i ich numery są tutaj podane:
glu, gly, itd. były wymieniane na ala. Czyli przeprowadzono tzw scannig alaninowy. No i proszę
popatrzeć, mutacje niektórych reszt nie wpływały na oddziaływanie, ale niektórych, jak np. lys22
wpływały, czy arg26, całkowicie znosiły oddziaływanie, czyli to były te reszty krytyczne, dla
tworzenia kontaktu. Badaliśmy też oddziaływania heterokompleksie tych mutantów, no i
wyciągnęliśmy odpowiednie wnioski. Tego rodzaju eksperymenty są, dostarczają oczywiście
bardzo dużych, i dość szczegółowych informacji w momencie gdy nie jest znana jeszcze struktura
krystalograficzna. Otrzymanie struktury często wiąże się z wieloma próbami, często kończącymi się
zupełnym niepowodzeniem, w czasie kiedy analizy EMSA były prowadzone, struktura nie była
znana, ale później otrzymano dwie struktury kompleksu ECR-DBD, USP-DBD i Hsp27. W tym
jedna w pełni w naszym laboratorium. Głównym jej autorem był Pan Doktor MJ, w ścisłej
współpracy z Doktorem MO. I który wykonał też cześć testów biochemicznych, które tą strukturę
potwierdzały, I te eksperymenty w rozdzielczości molekularnej, potwierdziły, to co Państwo tu
pokazywałem, na podstawie tych eksperymentów, tych jeszcze dodatkowych, myśmy
zaproponowali architekturę kompleksu. Zgadliśmy, że na 5 ' końcu elementu Hsp27 powinien być
zlokalizowany, domena wiążąca ECR, a na 3' końcu domena wiążąca USP. To wynikło właśnie z
prostych eksperymentów EMSA, w których my właśnie mutowaliśmy te reszty DNA. Nie chcę
wchodzić, tutaj w szczegółu, chciałem państwo opowiedzieć o tej metodzie, jak ona duży potencjał
niesie, o ile jest też odpowiedni potencjał intelektualny, powiedzmy sprytu u eksperymentatorów.
Myśmy wtedy z Anitą zaryzykowali, powiedzieliśmy, że na podstawie naszych analiz EMSA,
prawdopodobnie struktura jest taka, że na 5' końcu jest ECR, a na 3' końcu USP i ku naszemu
zdziwieniu, a także uldze, struktura krystalograficzna dokładnie to potwierdziła, że taka jest
architektura, i ona była wyjątkowa, żaden inny receptor jądrowy, nie ma takiego dimerycznego,
układu, także byliśmy szczęśliwi. Eksperyment ten EMSA zatem bardzo prosty, dostarcza nam dużo
radości, o ile jest dobrze wykonany. Teraz zrobimy sobie przerwę...
(KONIEC!!)