Techniki biologii molekularnej

Marcin Kurowski

P C R

Celem reakcji łaocuchowej polimerazy jest

wykonanie

jak największej liczby kopii

fragmentu DNA.

„molekularna kserokopiarka”

Zastosowanie PCR

• Diagnostyka bakteriologiczna i wirusologiczna
• Medycyna sądowa
• Kryminalistyka
• Ustalanie ojcostwa/pokrewieostwa
• Typowanie HLA

SEKWENCJONOWANIE

CEL:

określenie porządku

(sekwencji)

nukleotydów

w danym genie

(= fragmencie DNA)

SEKWENCJONOWANIE

• Kopiowanie określonej sekwencji (polimeraza

DNA I)

• Mieszanina inkubacyjna zawiera 4 trifosforany

deoksyrybonukleozydów oraz 2’,3’-
dideoksyanalogi

• Wbudowanie analogu uniemożliwia dalsze

wydłużanie łaocucha DNA

• Powstają fragmenty o różnej długości

kooczące się różnymi dideoksyanalogami

SEKWENCJONOWANIE

• Fragmenty DNA wykrywa się na podstawie ich

fluorescencji - znacznik fluorescencyjny emituje
światło o odmiennej barwie dla każdej reakcji
termiancji

• Elektroforeza żelowa w automatycznym

sekwencjonerze

• Laser wzbudza świecenie znaczników
• Detekcja świecenia
• Konwersja do chromatogramu

Metoda Sangera

QIAGEN Sequencing Guide

Chromatogram

ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE

• Rozpoznają specyficzne sekwencje zasad w

dwuniciowej helisie i zrywają obie nici w
dokładnie zdefiniowanych miejscach

• ‘precyzyjne skalpele’
• Syntetyzowane przez wiele różnych

organizmów Procaryota

C) RFLP

PRZYKŁADOWE ENZYMY RESTRYKCYJNE:

Eco47I (AvaII) NcoI

5'...G

↓

G T C C...3'

5'...C

↓

C A T G G...3'

3'...C C A G

↑

G...5'

3'...G G T A C

↑

C...5'

RFLP – wizualizacja produktów

trawienia

W

1

2

3

4

5

6

497 pz

353 pz

144 pz

Badane DNA

400 pz

300 pz

500 pz

200 pz

100 pz

Wzorzec masy

W

1

2

3

4

5

6

497 pz

353 pz

144 pz

Badane DNA

400 pz

300 pz

500 pz

200 pz

100 pz

Wzorzec masy

Wykorzystanie

• Badanie struktury chromosomów
• Analiza (sekwencjonowanie) krótkich

fragmentów DNA

• Izolowanie genów
• Tworzenie nowych cząsteczek DNA