Badanie polimorfizmu genu TGF-1

1. Wstęp teoretyczny

a) Mutacja i rekombinacja.

Zmienność dziedziczna jest podstawą procesu ewolucji. Głównymi mechanizmami różnicowania genomów jest rekombinacja DNA oraz powstawanie mutacji.

Rekombinacja polega na wymianie nici DNA lub fragmentów chromosomów i zachodzi w trakcie podziałów komórkowych, prowadząc do powstania różnych kombinacji genów oraz ich alleli. Dzięki takiej właśnie wymianie informacji genetycznej gamety danego osobnika nie są identyczne, a w konsekwencji u jego potomstwa ujawniają się różne cechy fenotypowe.

Mutacja natomiast polega na zmianie strukturalnej w obrębie danego genu, dzięki czemu dochodzi do powstania nowych alleli. Mutacje mogą dotyczyć sekwencji nukleotydów w cząsteczce DNA oraz struktury i liczby chromosomów. Powstają spontanicznie jako błędy w rekombinacji lub na skutek działania różnych czynników mutagennych, m.in. promieniowania jonizującego. Nie wszystkie mutacje podlegają dziedziczeniu. Dotyczy to mutacji somatycznych, czyli takich które zaistniały w komórkach nie będących komórkami szlaku płciowego oraz mutacji letalnych, czyli powodujących przedwczesną śmierć noszącego je organizmu. W odróżnieniu od nich mutacje germinalne występujące w komórkach, z których powstają gamety są potencjalnie dziedziczone.
Jednym z najbardziej rozpowszechnionych rodzajów mutacji są, tzw. mutacje punktowe, polegające na zamianie jednego nukleotydu na inny bądź insercji (wstawieniu) lub delecji (wypadnięciu) jednego lub kilku nukleotydów. Mutacje punktowe mogą być zlokalizowane w obszarze kodującym genu, zmieniając sens informacji genetycznej oraz w regionach regulacyjnych genu, prowadząc do zmiany jego ekspresji. Konsekwencją mutacji punktowej zlokalizowanej w obszarze kodującym może być zamiana nukleotydu i powstanie trójki nukleotydów kodujących inny aminokwas (mutacja missens) lub utworzenie jednego z kodonów stop (mutacja nonsens). W przypadku delecji lub insercji nukleotydu dochodzi do zmiany ramki odczytu informacji genetycznej (mutacja frameshift).
Na ogół skutkiem mutacji punktowej jest zmiana lub utrata funkcji genu, a co za tym idzie również kodowanego przez niego białka. Obserwowany w przypadku mutacji nonsens i czasem frameshift częściowy lub całkowity brak kodowanego białka jest rezultatem przedwczesnej terminacji translacji.

b.) Polimorfizm

Spośród przypadkowo wybranych ludzkich genomów około 99,9% sekwencji DNA jest identyczne. Za różnorodność 0,1% sekwencji nukleotydów odpowiedzialne są głównie tzw. zmiany polimorficzne. Za polimorfizm uznawana jest zmiana w sekwencji nukleotydów występująca w populacji z częstością większą niż 1% i na ogół nie prowadząca do zmian w sekwencji kodowanego przez dany gen polipeptydu. Polimorfizm może dotyczyć pojedynczego nukleotydu, lub dłuższej powtarzającej się wielokrotnie określonej sekwencji. Najczęściej występującym typem zmienności sekwencji DNA genomowego jest polimorfizm pojedynczego nukleotydu, tzw. SNP (ang. single nucleotide polymorphism), polegający na zastąpieniu pojedynczego nukleotydu innym. Stanowi on 90% wszystkich różnic w sekwencji.

Molekularny mechanizm powstawania zmian polimorficznych i mutacji jest identyczny; natomiast różnica między nimi oparta jest na dwóch kryteriach: częstości występowania oraz skutkach fenotypowych. Mutacje na ogół występują znacznie rzadziej w populacji, są zlokalizowane w regionach kodujących i powodują upośledzenie funkcji lub syntezy białka, co wpływa na modulowanie cech fenotypowych.

Nie w każdym jednak przypadku takie jednoznaczne rozróżnienie jest możliwe. W trakcie analizy molekularnej niejednokrotnie można mieć do czynienia z takimi sytuacjami, gdzie zidentyfikowany wariant molekularny stwarza trudności w zaklasyfikowaniu go jako mutacji czy polimorfizmu.

Zmiany polimorficzne powstały w przeszłości i powstają prawdopodobnie również obecnie, stanowiąc element zmienności genomu. Analiza polimorfizmów może służyć poznaniu ewolucji ludzkiego genomu oraz do śledzenia międzygatunkowych różnic w sekwencji DNA.

Polimorfizm genu TGF-1

Na poziomie genu zmianami polimorficznymi określa się jednoczesne występowanie w populacji różnych form allelicznych danego genotypu. Może to prowadzić do różnic w budowie białka kodowanego przez ten gen i powodować różnice w jego budowie i działaniu.

W odróżnieniu od mutacji, częstość występowania takiej zmiany polimorficznej w populacji musi być większa niż 1%.

Wysoką polimorficznością odznacza się gen TGF-1 kodujący transformujący czynnik wzrostu-1, który należy do szerokiej rodziny cytokin. Cytokiny to duża grupa niskocząsteczkowych białek (glikoprotein) wydzielanych głównie poprzez komórki układu odpornościowego. Regulują wiele funkcji organizmu na poziomie komórkowym: biorą udział w przenoszeniu informacji między komórkami, kontrolują procesy zapalne m.in. aktywując komórki uczestniczące w zapaleniu takie jak: makrofagi, neutrofile a także wpływają na wzrost, proliferację i pobudzenie komórek biorących udział w odpowiedzi odpornościowej i komórek hemopoetycznych. Do rodziny cytokin należą m.in. interleukiny, interferony i czynniki wzrostowe komórek szpiku kostnego. Czynnik TGF- jest zaangażowany w utrzymanie homeostazy immunologicznej w organizmie i związanych z tym procesami wzrostu, proliferacji i różnicowania różnych typów komórek. Odgrywa również kluczową rolę w komunikowaniu międzykomórkowym, ma zdolność do pobudzania syntezy białek substancji pozakomórkowej, co ma podstawowe znaczenie dla procesów bliznowacenia i rekonstrukcji tkanek. Szczególną rolę TGF- przypisuje się właśnie w procesach naprawczych i regeneracyjnych po uszkodzeniu tkanek. Pobudza fibroblasty i inne komórki do wytwarzania białek ECM takich jak: kolagen, fibronektyna i integryny.

Istnieje wiele danych pokazujących, że istnieje zależność między polimorfizmem genu dla TGF-1 a przebiegiem klinicznym niektórych przewlekłych chorób zapalnych. W aktywnej fazie choroby obserwuje się wzrost zawartości TGF-1 w jelicie oraz wątrobie, jak również zwiększoną ekspresję mRNA dla TGF-1 w tkankach objętych procesem zapalnym.

Do tej pory zostało wykrytych 8 polimorfizmów genu TGF-1:

pozycja -988 - substytucja cytozyny w argininę, występuje w rejonie promotorowym

pozycja -800 - substytucja guaniny w argininę, występuje w rejonie promotorowym

pozycja -509 - substytucja cytozyny w tyminę, występuje w rejonie promotorowym

pozycja +72 - insercja C, występuje w rejonie nietranslacyjnym

pozycja +869 - substytucja tyminy w cytozynę, występuje w egzonie 1, kodon 10

pozycja +915 - substytucja guaniny w cytozynę, występuje w egzonie 1, kodon 25

pozycja +788 - substytucja cytozyny w tyminę, występuje w egzonie 5, kodon 263

pozycja +713 - delecja C, występuje w intronie 4

Rysunek Lokalizacja znanych polimorfizmów w genie TGF-

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest analiza polimorfizmu genu TGF-1 metodą PCR-RFLP. Technika PCR-RFLP polega na amplifikacji fragmentu DNA, a następnie jego trawienieniu enzymami restrykcyjnymi. Technika ta prowadzi do wykrycia defektu genu.

Przebieg doświadczenia:

1. Amplifikacja fragmentów egzonu 1 metodą PCR.

Primery:

TGF1 5'-TTC CCT CGA GGC CCT CCT A-3'

TGF2 5'-GCC GCA GCT TGG ACA GGA TC-3'

Produkt PCR: 294 p.z.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

2,5 μl bufor

2,5 μl dNTP

0,25 μl primer 1

0,25 μl primer 2

0,5 μl RedTaq polimeraza

5 μl matryca DNA

14 μl woda

Sprawdzenie wyniku PCR: Do 5µl produktu dodać 2µl buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzić w 2% żelu agarozowym w buforze 0.5x TBE z bromkiem etydyny przy napięciu 100V 40 min.

2. Analiza restrykcyjna produktów PCR.

Amplifikowane fragmenty genu TGF-β1 poddano trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi w celu wykrycia polimorfizmów tego genu.

MspA1I - 37˚C, noc

2 μl buforu

0,2 μl BSA

0,2 μl enzymu MspA1I

10 μl DNA

7,6 μl H₂O

żel agarozowy 3%

BglI - 37˚C, noc

2 μl buforu O⁺

0,5 μl enzymu BglI

10 μl DNA

7,5 μl H₂O

żel agarozowy 2.5%

Sprawdzenie wyniku trawienia: Do 20µl mieszaniny reakcyjnej dodać 5µl buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzić w 2.5 -3% żelu agarozowym w buforze 0.5x TBE z bromkiem etydyny przy napięciu 100V 60 min.

Zagadnienia do samodzielnego opracowania:

1.Rodzaje mutacji i ich skutki.

2.Wykrywanie mutacji i polimorfizmów metodą PCR-RFLP.

3.Polimorfizm pojedyńczych nukleotydów (SNP).

4.Polimorfizm mitochondrialnego DNA człowieka.

5. Enzymy restrykcyjne.

Literatura:

Biologia Molekularna w medycynie. Pod redakcja Jerzego Bala.

Genomy. Terry A., Brown. Wydawnictwo PWN.

Egzon 1

Egzon 5

-988

-800

-509

+1

+840

Intron 4

G>A

C>A

C>T

+72

Kodon 10

CTG>CCG

Kodon 25

CGG>CCG

Kodon 263

insC

713-8 del C

Region promotorowy

Region kodujący

---