Wykład 1.
11.10.2012

Biologia molekularna z biotechnologią
prof. UG. dr hab. Anna Herman- Antosiewicz
punkty ECTS: 5

egzamin- test z pytaniami otwartymi

Biologia molekularna- nauka podstawowa zajmująca się biologią na poziomie molekularnym. Bada w jaki sposób funkcjonowanie żywych organizmów uwarunkowanie jest właściwościami budujących je cząsteczek, zwłaszcza biopolimerów, jakimi są kwasy nukleinowe i białka.

Inżynieria genetyczna - nowoczesne metody biologii molekularnej, genetyki i biochemii. Umożliwiające manipulacje genetyczne poza komórką ( rekombinowanie DNA In vitro)

Embriologia- biologia rozwoju ( regulacja ekspresji genów w rozwoju embrionalnym)
Cytologia -Biologia molekularna komorki
Taksonomia- taksonomia molekularna
Ewolucjonizm - Ewolucjonizm molekularny, Genomika
Medycyna- medycyna molekularna
Genetyka- genetyka molekularna ( biologia molekularna genu)

Biologia molekularna ( genetyka, fizyka, chemia, fizyka, biochemia)

Biotechnologia- zespół technologii, służących do wykorzystania lub wytwarzania użytecznych, żywych organizmów lub substancji pochodzących z organizmów lub ich części.
nauka interdyscyplinarna- obejmuje różne kierunki technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych.

Podręczniki:
Lewin B. Genes VII 1999 http://pl.scribd.com/doc/11465672/GENES-VII
Krebs J.E . Goldstein E.S Lewin's Essentials genes (wyd 2)
Lodish H, Berk A. Molecular Cell Biology 2004
Alberts B. Molecular Biology of the Cell 2002
Albert I wsp. Podstawy biologii komórki. 1999. PWN Warszawa
Węgleński P. Genetyka Molekularna 1995 PWN Warszawa

odkrycie kawasów nukleinowych - 1871
DNA jako materiał genetyczny - 1944

Grzegorz Mendel - opisuje zjawisko dziedziczenia cech, które są zależne od zawiązkow dziedziczności - 1865

Hunt Morgan - geny zlokalizowane są na chromosomach ( D. melanogaster), sprzeżenie genów i rekombinacja - 1910

Fred Griffith- transformacja bakterii zapalenia płuc - Pneumococcus -1928

Afery, McLeod, McCarty - czynnikiem, któr może przywracać infekcyjność bakterii jest czynny DNA -1944

Hershey i Chase - DNA jest materiałem genetycznym (fag T2) -1953

Marice Wilkins & Rosalind Franklin - obrazy dyfrakcji promieni X -struktura DNA - 1940

Erwin Chargraff - alfabet DNA i regulacja Chargraff'a - skład nici Dna, liczba zasad piramidowych w DNA jest równa liczbie zasad purynowych -1950

James Watson i Francis Crick - prezentuje DNA jako helise złożoną z dwóch powiązanych wiązaniami wodorowymi. W 1962 roku J. watson, F.Crick i M. Wilkins otrzymują nagrodę nobla -1953

Struktura B - w roztworach fizjologicznych ( klasyczna budowa)
skręt - 0,34 nm - 34A
prawoskrętna
grubość - 2 nm
Struktura A- odwodnione środowisko
12par zasad na skręt
prawoskrętna
Struktura C- roztwory soli
9 par zasad
prawoskrętna
Struktura Z- LEWOSKRĘTNA, 12 par zasad, rozciągnięta

Zadanie:

Dysponujesz odcinkiem ds. DNA o sekwencji 5: GAAGGTTCTGAGATATTA3' oraz dNTPs ( PO4-, PO3-PO3-d-ryboza-zasada) w której jedna z reszt fosforanowych (alfa, beta lub gamma) Posiada radioaktywny izotop 32P,
Którego nukleotydu użjesz , by wyznakować koniec 5'DNA

, a którego by otrzymać taki sam odcinek DNA , ale z radioaktywnym nukleotydem adeninowym w łańcuchu.

gamma- na koncu nukleotydu
alfa- wbudowywany


prekursor- trifosforany

Tyjo i Levan - dokładnie zbadanie ludzkiego kariotypu i podanie właściwej liczby chromosomów ludzkich (46) - 1956

Bekadle, E. tatum i J Oedenberg otrzymują Nagrodę Nobla za ustalenie podstawowych prawideł rządzących genetyką bakterii i grzybów -1958

Joshua Oedenberg- zajmował się badaniem zjawiska koniugacji i transdukcji u bakterii

Esther Oedenberg - odkrycie bakteriofaga lambda ( 1950 ), plazmidu F

George Beadle, Edward tatum, jeszcze w 1941 byli autorami stwierdzenia jeden gen- jeden enzym

Artur Kornrberg- wyizolował i opisał działanie polimerazy I DNA , syntezy DNA In Vitro - 1956


Matt Mesels on i Frank Stahl - replikacja semikonserwatywna DNA 1958

Wirowanie w gradiencie CsCl -gęstość cząsteczek = gęstość roztworu

Paul Doty i jay Marmur - efekt hiperchromowy DNA, zjawisko hybrydyzacji DNA -1960

Tm, A260

Tm- temperatura topnienia- połowa struktury DNA ulega denaturacji, zależy od ilości par C=G, od składu buforu

A260- absorbancji, przy długości fali 260 nm.

Zadanie:
1. w doświadczenie przeprowadza się chromatografię bibułową mieszaniny zasad azotowych. Jak można wykryć ich położenie na chromatografii

po zaświeceniu ultrafioletem- brak świecenia ( zasady DNA)

Efekt hipochromowy- pochłanianie większej ilości światła przez DNA

mamy preparat DNA, dla którego A260/A280 = 1.2 Czy jest to czyste DNA

A260 =1
ds.= dwuniciowe
ss= jednociowe
50 ug/ml dsDNA
40ug/ml ssDNA lub RNA

a260/A28- = 1.8 czysty DNA
A 260/A280 < 1,8 zanieczyszczenie białkiem
A260/280 > 1,8 zanieczyszczenie RNA

1961- J.Monod, A.M Wolff i F. KJacob przedstawiają operonowy model ekspresji genów prokariotycznych, za swoje badania otrzymują Nagrodę Nobla w 1965 roku

19620 W, Albert udowadnia występowanie enzymów restrykcyjnych, zaś w 1967 Gellert odkrywa ligazy DNA-

1961- M. Delbruck, A.D harshey i S.E Luria otrzymuja Nagrodę Nobla za badania nad genetyką wirusów i mechanizmami regulacji ekspresji genów.
1970 Herbert Boyer odkrywa endonukleazy restrykcyjne
1972- Boyer, Cohen i P. Berg- wprowadzają pierwsze techniki klonowania genów. ( Berg,-zrekombinowane Dna- SV40 i E.coli, Nobel 1980)
1975 D. Baltimore, R, Dulbecco i H. M Termni otrzymują nagrode Nobla za odkrycie retrowirusów i odwrotnej transkryptazy. Southen wprowadza teoretyczne podstawy hybrydyzacji kwasów nukleinowych - Kohler i Milsteun jako pierwsi produkują monoklinalne przeciwciała
-Richerd Roberta i Philips sharp - identyfikują geny nieciągłe
1977
Kary Mullus- założenia metody PCR
Sidney, Toma - katalityczne właściwości RNA
Frencz Anderson - pierwsza kliniczna próba terapii genowej, Leczenie SCID ( ciężki, złożony niedobór immunologiczny) przez wprowadzenie prawidłowej kopii genu
ADA(deaminaza adenozyny) - FRENCH Anderson
1996-jan Wilmut-klonowanie ssaków, Dolly
James Thomson -1998-hodowla In vitro komórek macierzystych
Craig Center - kompletna sekwencja Drosophila -1999
2000- zsekwencjonowanie genomu Arapidopsis thaliana
2000- craig Venter0 ogłasza ukończenie sekwencjonowania genomu ludzkiego ( opublikowany szkic)
2001 -prace 3 zespołów o mikrona
2002-zsekwencjonowanie genomu ryżu
2006- Andrew Fire i Craig odkrycie si/sRNA
19570 jednokierunkowy przepływ informacji genetycznej

ncRNA- niekodujące RNA, kontrola ekspresji RNA, kontrola stopnia upakowania chromatyny ,
rola: katalityczna, strukturalna

2007-zasady modyfikacji genów u myszy przy użyciu embriologicznych komórek macierzystych
2008-HPV przyczynia się do rozwoju raka macicy/za odkrycie HIV
2009 - w jaki sposób chromosomy są chronione przez telomery i telomerazy
2010 - za badania na zapłodnieniem In vitro
2012- odkrycie, że dojrzałe komórki można uczynić pluripotitencjalnymi ( odróżnicować)



Wykład 2.18.10.2012

Replikacja DNA

Replikon - jednostka replikacyjna posiadająca origin ( ori) replikacji
- ori- kontrola inicjacji i częstości replikacji
- elementy kontrolne replikacji działające w cis :
ori
ter (terminus)

Prokaryota- genom = 1 replikon, dodatkowe replikony - plazmidy i DNA fagowe
Eucariota- genom ma b.wiele replikonów
( u ssaków -50,-100 tys./kom), każdy jest aktywny nie więcej niż jeden raz w cyklu komórkowym dodatkowe - replikony mitochondriów i plastydów.

plazmid płciowy -F
plazmidy płucowe-P19PPR

wielkość chromosomów prokariotycznych:
0,6 Mpz (Mycoplazma)- 30 Mpz (Bacilluus megaterium)
i eukariotycznych ( 550250 Mpz - ludzie)

Różnorodność replikonów:
-koliste
- liniowe (Borellia burggdorferi, Streptomyces coelicolor A3, chromosomy organizmów euakriotycznych)
-ds.
-ss

Więcej niż 1 replikon na komórkę ( Aagrobacterium -L i CC i Eucaryota )

Różnorodność typów relikacji
- dwukierunkowa ( teta na kulistym replikonie)
-jednokierunkowa
-replikacja 1 nici (sigma, rolling circle)

Eubakterie -
rejon ori- 180-1000 pz
liczba ori - 1

Sekwencje wiążące białka inicjatorowe
- 9 metrowe sekwencje DnaA
- białko inicjatorowe - DnaA (poj. Białko)
- dostarczenie helikazy - DnaC ) poj, białko)
- rozwijanie ds. DNA- DnaB ( poj białko)- heksametr
Długość fragmentów okazaki - 1-2 kz
szybkość syntezy DNA 20-50 kz/min

Eukariota (S.cerevisiae)
rejon ori- 150-200 pz
liczba ori - kilka-kilkadziesiat tysięcy
sekwencje wiążące białko inicjatorowe - 11 metrowe sekwencje domeny A

Białko inicjatorowe - ORC (Orcl-6) kompleks 6
Dostarczenie helikazy - Cdc6, Cdt1 w kompleksie ORC
rozwijanie ds. DNA- MCM ( Mcm2-7)
Długość fragmentów <125z
szybkość syntezy DNA- 0,5-5 kz/min

fragmenty okazaki- nić opóźniona
nic wiodąca - 5'3'

Helikaza- rozplatanie DNA
białka ssb- stabilizowanie nici (tetrametr, pokrywają 36 nukleotydów) - wiążą jednoniciowy DNA
kompleks polimerazy (rdzeń złożony z wielu pomierz, podjednostek )- katalizowanie reakcji polaryzacji, regulowanie poprawności włączania nukleotydów
zacisk - pomaga załadować rdzeń
primer okazaki -RNA
enzymy koregujące superzwinięcie (rozplatanie nadaskrętów)
-gyrazy (2 nici)
-topoizomerazy (1 nic)

procesywność enzymu - im bardziej procesywny tym dłużej trzyma się na matrycy bez odpadania, bez zdysocjowania

polimeraza I - gen polA FUNKCJA NAPRAWCZA, USUWANIE PRIMERÓW, aktywność egzopolimeraza ( 5'3') znakowanie DNA nić translation
polimeraza II - gen polB RESTART REPLIKACJI
polimeraza III - gen polC - cześć katalityczna, REPLIKACYJNA
polmeraza IV - dinB- naprawa uszkodzonego DNA (3'5 `)
polimeraza V - emuD'2C- aktywność korektorska ( 3' 5')

Ligazy -łączenie fragmentów DNA , zawsze potrzebuje kofaktora i ATP/NAD+
(ATP- eukariota, NAD+ -prokaryota)

białko beta (p) i PCNA (e) zwiększenie procesywności enzymu

Eucariota:
polimerazy:
alfa - synteza starterów (tetrametr)
delta - syntetyzowanie nici wiodące (tetrametr)
epsilon - syntezowanie nici opóźnionej (tetrametr)
gamma - mitochondralne
beta- funkcja naprawcza


Specjalny system naprawczy
- niska aktywność samokorekcji

Genomy koliste:
- replikacja w obie strony
- 2 pary widełek

Czy oczko replikacyjne ma 1 czy 2 widelki replikacyhne / czy replikacja zachodz w 1 czy w 2 kierunkach?
MAPOWANIE ori:
1.Zdefioniowana liniowa cząsteczka DNA- EM
2. Nieznany rejon genomu:
- podwójne pulsowe piętnowanie (indukowanie replikacji, podanie nukleotydów z izotopem radioaktywnym. wypiętnowanie silniejszym izotopem, obserwacja za pomocą kliszy rendgenowskiej)
-elektroforeza dwukierunkowa ( fluoroscencyjnie znakowany chlor, elektroforeza dwukierunkowa

znakowanie aktywności replikonów
- znakowanie jodkiem piperydyny
- bromodezoksyurydynowe przeciwciała

CZESANIE DNA:
- izolacje komórek
- mapowanie origin ( jododezoksyurydyninę- mapowanie)
- badanie ruchu widełek replikacyjnych
- określenie prędkości replikacji
- kontrola jakości replikacji


Genom bakteryjny
orin- min 245 pz, widełki typu teta
ter- 23 pz consensus , Kierunkowość

sekwencja ter E,D,A - terminate fork 1
sekwencja ter C,B - terminate fork 2 track - pułapka na widełki replikacyjne

Genomy liniowe :
polmeraza nie przeczypia się do końca DNA , DNA musi mieć wolny koniec 3'OH
luka występująca po usunięciu startera

Problem końców
Sposoby radzenia sobie z tym problemem:
- liniowy - kolisty (lambda) lub multimetryczny (fag T4)
- forma szpilki do włosów na końcu tak, ze wolny koniec zanika ( DNA liniowy mitochondriów Paramecium)
- koniec nie jest precyzyjnie zdefiniowany - zmienna liczba kopii sekwencji powtórzonych na końcach Chronosów eukariotycznych ( nie ma potrzeby replikacji do samego końca)
- białko kowalencyjne związane z 5' koncową zasadą ( adenowirusy, fag 29, poliowirusy)


AD-binding protein A :
- dostarcza nukleotyd cystydyny = primer
- Asocjuje z polimerazą DNA


typy inicjacji replikacji:
1. nacięcie jednej nici,
- duża ilość obrotów
- przechodzenie z formy teta na replikację toczącego się koła
- przykład : rDNA ooctytach Xenopus, bakteriofag x174, późna replikacja faga lambda
- przecinanie i dosyntetyzowanie drugiej nici

bakteriofag x174
białko A0 nacina, związane z 5' koncem,
liguje z 3' koncem

cis- acting

Białka gospodarza:
SSb, rep helikaza (odsuwa nić+)
pol III.

Koniugacja:
plazmidy typu F - episomy, duży 100 kpz

epison - może występować w formie wolnej w DNA, lub może integrować z genomem.

oriT -inicjacja transferu
pilin- tworzy pile płciowe

białka wykluczające kontakt z inną bakterią

bakteriofag M13 - atakuje bakterie zawierające plazmid ( F +), wytwarzające pille

szczep Hfr - mogą różnić się pozycją integracji, przekazywanie genomu bakteryjnego
- duża częstość rekombinacji

Związek inicjacji replikacji z bakteryjnym cyklem komórkowym - inicjacja replikacji dostosowana do tempa wzrostu

C- czas replikacji =40 min ( jezli nie ma przeszkód i są stale warunki, V= 50 tys pz/min)
C- czas miedzy ukończeniem rundy replikacyjnej a podziałem = 20 min
C+D =60 min
Jeżeli komórki dzielą się szybciej niż co 60 min, to replikacja jest inicjowana przez koncem poprzedniego podziału.

Stosunek masy komorkowej do liczby chromosomów jest stały
Kontrola:
1. Akumulacja aktywatora inicjacji replikacji (bialko DnaA)
2. Rozcieńczenie inhibitora inicjacji replikacji

SegA- więże się hemimetylowanym ori, zapobiega powstawaniu kompleksu otwartego
Mutanty dam- metylaza
Mutanty seqA- duże powinowactwo do hemimetylowanych ori, łączy ori błonami komórek, intonowanie podziałów komórka posiada wiele genomów

wzrost temperatury zahamowanie podziałów

Segregacja chromosomu bakteryjnego
-DNA jest tak samo zaangażowane w swój rozdział
- bezjądrowe komórki stanowią 0,03% populacji bakteryjnej

Poprawna segregacja zachodzi gdy:
1) potomne chromosomy zostają rozdzielone pod siebie po terminacji replikacji ( mutacje w genach topoizomeraz)
2) Elementy cis- acting ( sekwencja DNA) i trans - acting ( białka do segregacji) są obecne

Cis - elementy dotyczące danej cząsteczki

zaczątki przegrody w podziałach chromosomów

Rozdział chromosomów do komórek potomnych - hipoteza zakotwiczenia chromosomów w błonie po przeciwległych końcach septy
Defekt w podziale komórki - filamenty z wieloma nukleoidami
FtsZ- mutacja- filamenty - nadprodukcja - minikomórki

Minikomórki - septa tworzona za często lub w złym miejscu, niektóre komórki potomne nie mają nukleotydu

Komórki bezjądrowe - septym tworzone normalnie, komórki potomne są normalnej wielkością ale nie mają chromosomu ( mutanty par)

funkcje związane z rozdziałem DNA do komórek potomnych były odkryte w plazmidach

ATP-aza wiąże ParB
pars - fukcja centromeru

Taki system - prawdziwy system do rozdziału - plazmidy 1 kopijne ( F,R1, P1)

O tym jak plazmidy sobie roadzą z utrzymaniem się komórek bakteryjnych:
Plazmidy utrzymywane są w komórce gospodarza w charakterystycznej liczbie kopii
- Jednokopijne ( mechanizm rozdziały - jak nukleoidu)
- Wielokopijne 10-20/ chromosom bakteryjny - wtedy nie musi istnieć specjalny system segregacji . Losowy podział do komórek potomnych jest wydajny

Rekombinacja pomiędzy wielokopijnymi plazmidami redukuje jednostki segregacji : Grozi to utratą plazmidu z komórki .Plazmidy często mają systemy rekombinacji miejscowo- specyficznej

rozdział plazmidów przed podziałem
system rekombinacji miejscowo- specyficznej - incis - rekombinazy ser rozpoznanie dif wycięcie od siebie półek monomerycznych

SYSTEM UZALEŃIENIA ( addiction system)
- plazmid koduje toksynę ( killer) i antytoksynę ( białko bądź RNA) białko krótkotrwałe

- brak odziedziczenia plazmidu śmierć komórki

Niezgodność plazmidów - niemożność występowania w jednej komórce
Nie mogą być odróżnione od siebie w pewnym momencie ich utrzymania
Np., -ich ori w momencie inicjacji replikacji

jeżeli plazmidy mają taką samą sekwencję w miejscu inicjacji - nie mogą współwystępować w komórce

Plazmidy ColE1 ( ok. 20 kopii/kom) System ich utrzymania opiera się na kontrolii inicjacji replikacji .
RNA I- dba o częstość replikacji, antysensowne do primer'a RNA

odsycjonowanie DNA - brak rozpoznanie DNA

białko ROM- zwiększenie częstości replikacji

mutacja punktowa w plazmidzie II - nierozpoznawalnie przez RNA I w pierwszym plazmidzie

wektor wahadłowy - może się replikować w bakteriach ( pUC ori)


Inicjacja replikacji w komórkach eukariotycznych

ARS- autonomously replicating sequence - jest z nią związany kompleks białek zw. ORC ( origin recognition complex) 6 b. 400 kDa + rejon A i B1

ori - duża ilość sekwencji ATTTA
mutacje w domenach B1-B3 - osłabiają fukcje ori
Domena A- core- consensus
- promotory dla polimerazy DNA


Cdc6 - b. niestabilne ( T1/2,5 min), umożliwia wiązanie białek Mcm= kompleks pre- replikacyjny

Inicjacja replikacji - uwolnienie Cdc6 ( jego degradacja zapobiega reinicjacji) i Mcm
-> kompleks proreplikacyjny , ochrona przed ponownym użyciem ori

zależy od topologii DNA- jak bardzo jest zwinięte

Post- replikacyjny kompleks- ORC
ABF1+B3 - aktywacja transkrypcyjna + inne funkcje

1. Tylko 1 runda replikacyjna
2. Sprzężenie zwrotne - inicjacja replikacji zależy od przejścia cyklu
S. cerevisiae- MCM2,3,5 do jądra Wchodzą podczas mitozy
U zwierząt - MCM kompleks - jest w jądrze zależnie od obecności białka Cdc6 - niestabilny składnik

DNA mitochondrialne :
ssaczy mtDNA -16.5 kb, 2-10 kopii w organellom i 1000 - 10000 kopii/komorkę somatycznych
koduje 15 białek, 2 rRNa i 22 tRNA
- brak intronów ( tylko ssaki)
S. Cerevisiae 0k, 80 kb, 4 kopie/organellom, 22 mitochondria/komórkę ; koduje białek
replikacja mRNA:

- odsłonięcie nici H polimeraza RNA syntetyzuje transkrypt endonukleaza, specyficzna dla hybrydu DNA- RNA
- powstanie kompleksu D ( ss D-loop - ok. 500-600 p.z)
- rozdział losowy bialak kurczliwe ( odcinanie 2 komórek) - DYNEINA

Telomery:
- stabilizują i chronią końce DNA przed nukleazami i łączeniu się chromosomów między sobą ( mają lepkie końce)

- zawijanie końca chromosomu
- wiele razy powtórzone sekwencje
T- loop -TRF2 - telomere- binding
In vivo- Protein + inne = kompleks, stabilizujący telomer
człowiek ma 96 telomerów
-koniec 3'- powtórzenia bogate w guanidynę
Ludzkie telomery ( TTAGGG)n
Telomery ludzkie - 5 000-15 000 pz
u drożdży- 300 par zasad

obszar subtelomerowy - w tym obszarze nic nie jest kodowane

Biorą udział w terminacji replikacji, zapewniają utrzymanie niezmiennej długości właściwych genomów
komórki nowotworowe/ komórki szpiku /komórki macierzyste brak limitu hatwicka brak skracania telomerów, może się dzielić w nieskończoność

telomeraza- odbudowywanie telomerów - znacznik długowieczności komórek
nukleotyd ( 200-500 KDa) - w centrum aktywnym ma matrycę RNA 159 -192n odwrotna transkrypcja , sekwencja bogata w C-A

sekwencje repetywne - zdeterminowane przez RNA enzymu

Druga nić ( C-A) jest dosyntetyzowana, jest krótsza od nici G-T o sekwencję startera

Cykl komórkowy:
G0 - nie przechodzi do cyklu, specjalizacja komórki
G1
S- synteza DNA, podwojenie ilości ( 6-8 h)
G2 - przygotowanie do mitozy, reorganizacja mikrotubuli i jądra kom.
Mitoza- zatrzymanie syntezy DNA
interfaza- ciągła synteza białek

2n 4n cytometr przepływowy ( zliczanie komórek ), barwienie,
znakowanie jodkiem priopidyny określenie fazy rozwoju komórek

faza G1 - najwyższy pik ( faza trwa najdłużej)
faza G2 - ½ piku
faza S- pomiędzy fazą G1 a G2

check point -> punkt kontrolny - chroni przed postępowaniu cyklu , jeśli poprzednie etapy nie są owocnie zakończone , sprawdzanie czy można przejść do kolejnego etapu cyklu .
Warunek - prawidłowo zakończony etap poprzedni

Warunki , by komórka się podzieliła
1. Replikacja DNA , kontrolowana przed „licencing factor”
2. Rozpoczeta replikacja musi się zakończyć
3. Podzial nie może nastąpić, jeżeli nie jest skonczona replikacja -checkpoint

Odkrycie regulatorow cyklu komórkowego - fucje komórek będących w różnych fazach = hybrydy, heterokariony


tam gdzie jest materiał genetyczny podwojony komórka nie jest podatna na czynnik S

G1- traci otoczkę jądrową i ma częściowo skondensowaną chromatynę - PSEUDOMITOZA

Za kolejne fazycyklu komórkowego odpowiedzialne Pu: Cdk-cy: kompleksy typu - CDk- cyklina

Cdk- cyklin - podjednostka katalityczna
Cyklina- niestabilne podjednostki regulatorowe
Aktywność kompleksów regulowana jest na wieli poziomach :
- poziom komponentów ( synteza i degradacja)
- zdolność do tworzenia kompleksu
- odwracalna fosforylacja
- inhibitory białkowe
- lokalizacja

podobne białka regulatorowe występują we wszystkich organizmach eukariotycznych

Kompleks cdk-cyclina w komórkach ssaczych

G2 ,M - Cyklina A- CDK1 i cyklina b- CDK1
G1 - Cyklin D- CDK4, Cyklin D- CDK6
punkt restrykcji - Cyklin E- CDK2
Cyklin A- CDK2 - Synteza


Czynniki wzrostu zawarte w surowicy są odpowiedzialne za wznowienie cyklu komórkowego z G0 poprzez stymulację transkrypcji wielu genów

poziom mRNA dla wczesnych genów - RNA nie ulega translacji, brak ekspresji późnych genów

Cyklina D jest konieczna, aby przejść przez punkt R
jest syntetyzowana po stymulacji przez czynniki wzrostu
ma b. krótki T ½
BrdU -bromodeoksyurydyna, analog tyminy

Brd U - wchodzą wyłącznie w fazę S, brak barwnika barwiącego do cykliny D
regulacja syntezy cykliny D ( zachodzi w optymalnych warunkach)

Fosforylacja Rb ( retinoblastoma ) jest konieczna do wejścia w fazę S

Regulacja aktywności Rb i E2F w środkowej fazie G1
Fosforylacja Rb przez kolejne kompleksy prowadzi do odblokowania E2F
E2F stymuluje transkrypcje genów , których produkty potrzebne są do replikacji DNA
cdk2-cyklina E - konieczne wejście w fazę S
Cyklina E- regulacji podlega jej akumulacja ( NIE DEGENERACJA)
Do kontynuacji fazy S potrzebny jest kompleks Cdk2- cyklina A

Cyklin D ( CDK4/6) + Rb/E2f Rb/E2f PPP + Cyklin E (CDK2)
Mid G1 Late G1


Rb/E2f - ekspresja genów

kompleks cylina A-cdk2 aktywuje kompleks pre- replikacyjny :
inicjuje replikację DNA, Jego aktywność kontrolowana jest przez fosforylację, inhibitory CDK ( CIPs - Cdk inhibitory proteins) oraz proteasomalną degradację

rodzina Kip (p21,p27.p57) hamują aktywność cykliny A- Cdk2 ( oraz inne kompleksy z inna specyficznością)

rodzina INK4 ( inhibitor of kinase 4; p16,p15,p18,p19) reagują z CDK4 i Cdk6 i blokują ich wiązanie z cykliną D oraz progresję fazy G1 ( są supresorami nowotworów)


p16 -hamuje łączenie się cykliny D z kinazami
p 27, p21 - hamują tworzenie kompleksu . hamowanie aktywacji cdk2/cycline E
p16 - hamuje oddziaływanie z substratem


MPF - maturation promotin factor -mitosis promoting factor-M phase kinasepowduje dojrzewanie oocytu pod wpływem progesteronu, przejście z fazy G2 M

w jajach cyklicznie wzrasta ilość MPF czynnik powodujący mitozę

Czas pierwszego podziału jest stosunkowo długi (90 min)
Po pierwszym podziale wzrost ilości MPF
11 faz ( co pół h)
brak fazy G1 i G2

MPF:
1.Cdc 2 ( Sm pombe) - cdc28( S, cerevisiae )= cdk1 ( reszta)- podj katalityczna
2.Cykliny A i B ( B1 i B2 - Xenopus, ssaki)- podj. Regulatorowe
na końcu N- konca jest „cyklin destruction box”- po ubikwitynę jest rozpoznawane przez proteasom
3.Aktywacja- poprzez modyfikację Cdc2
4.Inaktywacja - poprzez degradację cyklin w mitozie
5.Fosforyleuje Ser lub Thr ( Ser- Pro - X- Lys)
6.Substraty ( in vitro) : histon H1 ( kondensacja chromatyny ? S cerevisiae, do testów na aktywność kompleksu ,laminy jądrowe ( rozpad otoczki jądrowej) nukleoliny ( do zatrzymania syntezy rybosomów)
7.Reorganizacja mikroszkieletu

mitoza:
laminy - tetrametry laminy
MPF - Cdk1+ cyklina A/B fosforylacja na końcach rozpad tetrameru na dimery ( BRAK CAŁKOWITEJ degradacji/ depolaryzacja)


zamiana Ser na alaninę zmieniony gen Laminy A
brak ułożenia w strukturze równikowej
występuje otoczka jądrowa
mitoza nie dochodzi do końca

Regulacja aktywności kompleksu MPF:
Cdc1/2 cyklina A/B
Cdc1/2 fosforylacja w Tyr 15, Thr 14
inaktywacja kinazowej aktywności cykliny ( hamowanie aktywności)
kompleks nie jest aktywny - występowanie grup nieaktywnych -> działanie fosfataz (Cdc25c) usuwanie grup hamujących UAKTYWNIENIE -> progresja do fazy M do momentu anafazy ( zakończenie mitozy , degradacja cykliny) , przestaje działać w czasie uszkodzenia DNA

Degradacja cykliny:
kompleks APC ( anafaze promoting complex )
- aktywny podczas mitozy
-ligaza ubikwityny ( przyłącza do siebie reszty ubikwityny)

pds1p =seciurina - degradacja razem z cyklinami
CDC20- białko regulatorowe

Kohezymy (Scc) - białka scalające chromatydy siostrzane
Separyny (separazy) - białka tnące kohezymy , przecina chromatydy ( anafaza)
Sekuryny ( Pds1) - białka hamujące heparyny i anafazę

Metafaza= degradacja cykliny A
Anafaza - degradacja cykliny B ( Psp1p)

uszkodzenie DNA ATM, ATR; ATRIP+RPA+ssDNA Chk2,Chk1 Cdc25 A-C
(hamuje cykl komórkowy )

ATM= wykrywa podwojne pęknięcia / promieniowanie gamma, dimer, fosforylacja subtratow, białek checkpoint'ów ( faza G2)
ATR = potrzebuje innych białek aby znaleźć pęknięcie

Wynik:
- apoptoza
- uaktywnienie białek naprawczych
- zatrzymanie cyklu

Supresory nowotworu /onkogeny # ( czynniki hamujące onkogenezę* supresory)
- Rb *
- cyklina E #
- p16*
- ATM *

- Cdc25#
- Chk1 *

EKSPRESJA GENÓW - ETAPY
przepisywanie informacji genetycznej z DNA na RNA a następnie na białka

Eucaryota:

1. Kondensacja chromatyny ( brak u Procaryota)
2. Rozpoznawanie promotora (polimeraza RNA plus szereg białek / u procaryota - samo RNA )
3. Modyfikacja RNA - usuwanie intronów, łączenie egzonów
czapeczka na 5' końcu , poly A na 3' końcu
4. Translacja

INICJACJA replikacji:
Promotory i enhancery ( u bakterii - utylizacja azotu) ( w sekwencji in cis)
białka ( w sekwencji in trans)

transkrypcja:
nić kodująca - sensowna -odzwierciedlona w transkrypcji ( RNA )
nić matrycowa - nonsensowna

promotory: ( procarota)
-35 - TTGACA -10 - TATAAT box 5-9 pb - start transkrypcji

eucaroyta
- 200 pb przed miejscem staru transkrypcji ( kilkanaście krótkich sekwencji)
- enhancery - 100 pb - wzmacniają promotor , mogą leżeć jak i za i przed promotorem, rozpoznawane przez aktywatory transkrypcji

U procaryota - jedna polimeraza RNA
rpoD sigma 70 - TTGACA - start transkrypcji
rpoH - sigma 32 - w czasie szoku cieplnego
proN - sigma 54- utylizacja azatu
filiA - sigma F - syntetyzowanie flagelli
sig H sigma H - zahamowanie wzrostu i podziału

u Eucaroyta brak jednostki sigmy, białka nie są częścią polimerazy
- czynniki bazalne ( podstawowe) - przyciągają do sekwencji promotora
- aktywatory - wiążą i zaginają DNA, oddziaływaniu z czynnikami bazalnymi, wiążą się w enhancerach

Prokaryota :
Polimeraza - duży enzym, złożona z jednostek sigmy , dodatkowo

alfa- rpoA - budowa enzymy
beta- aktywnośc katalityczna, wiązanie się do DNA
beta' - polimeryzacja nukleotydu
sigma - inicjacja transkrypcji w promotorze

Eucariota:
3 polimerazy:
I- transkrypcja rRNA, w jąderkum alfa- amanityna ^R
II -transkrypocja mRNA ( raczej hn RNA), w nukleoplażmie, alfa amanityna^S
III- transkrypcja tRNA i innych małych RNA, nukleoplazma , alfa amanityna ^R ( drożdże i owady) lub ^S (przy wysokich stężeniach inne)

hn- heterogenne

Eucaroyta :
na początku sekwencja powtórzona 25(26) razy CDC ( YSPTSPS)
dalej są jednostki wspólne

sekwencja promotora określana na podstawie mutagenezy foot printing ( wolne miejsce - nie zadziałała DNA'aza gdyż była tam polimeraza )

geny dla rRNA -1 jednostka transkrypcyjna ( 18; 5,8 ; 28 S rRNA ( czytane przez polimerazę III)
wiele kopii przedzielonych nie transkrybowanych przekładkami ( spacers)

Jednostka transkrypcyjna- zawiera poszczególne geny ( bakterie, czytanie ciągnem)
Jednostka transkrypcyjna - zawiera jeden gen ( eukariota)

rRNA
Inr ( -10) bogate w TAATA -

GC- rich ( -40)
położenie -170 pb - UPSTREAM PROMOTER ELEMENT
białko UBF zapętlanie DNA
Czynniki SL1 ( TBP- jeden z elementów budowy) wskazuje miejsce polimerazy I , ukazywanie miejsca startu

POLIMERAZA III
1.type I
startpoint - box A ( rozp. przez TFIIIA) box C ( rozp. Przez TFCIII)

2.type II
startpoint - box A box B ( rozp. przez TFIIIB)

3.polimeraza III
OCT (snRNA) + TATA + PSE


tRNA ( ?) = TFIIIIC

polimeraza II
-TATA BOX ( -20)*
YYCA (start transkrypcji) YYYYY InR
lub
- AGAC ( DPE)
YYCA (start transkrypcji) YYYYY InR

zestaw podstawowych czynników- inicjacja transkrypcji
TBP - rozpoznaje TATAA*
TFIIB + TFIIF +TFIIA

TFIIF - tetrametr, polimeraza II

-aktywność ATP'azy, rozdzielanie wiązań wodorowych pomiędzy nukleotydami,

-aktywność helikazy, stopienie odcinka w promotorze, łączenie się z polimerazą II RNA

Sposoby wiązania czynnika pozycjonującego do promotorów
białka TDP dla innych polimerach niż II ( III i I)
- nie wiążą się DNA, nie rozpoznają RNA dla polimerazy I i III
- wiążą się w promotorach ( rozpoznawanie TFIIIA i TFIIIC, UBF1)
polimeraza II- rozpoznawanie sekwencji TAATA

zaginanie się helisy - lokalne rozplecenie DNA ( TDP)

TFIIH:
- przechodzi do kompleksu z TFIIJ
- inicjacja transkrypcji i opuszczanie promotora
- aktywność katalityczna
- aktywność kinazowa - fosforylacja innych białek ( fosforylacja C-domeny dużej podjednostki cDNA)
- 5 białek tworzy rdzeń + dodatkowe białka kompleksowe
- obróbka transkryptu ( czapeczkowanie 5” koniec transkryptu)
- składanie intronów, dodawanie ogonka poli A * dzięki fosforylacji końca C

Transkrypcja : bakterie :

- naprawa genów ulegających transkrypcji
- MFD - rozpoznawanie uszkodzenia, usuwanie polimerazy, odnajdywanie przez białka naprawcze ( system UvrA)
Eucarioyta:
TFIIH -aktywność kinazy, inicjacja i ELONGACJA transkrypcji, oddysocjowanie polimerazy
- geny XP - Xeroderma pigmentosum - zaburzona jest naprawa nici DNA w wyniku braku genów Xp wrażliwość na światło UV
Cockayne syndrom - choroba, zaburzenie transkrypcji i naprawy DNA

Aktywatory transkrypcji:
- rozpoznają specyficzne sekwencje w promotorze ( - 200 pz) lub w enchanserach
CAAT box -75:
- wiąże czynnik aktywizujący
- rozpoznaje białka represorowe

- usuwana białka aktywatorowa w histonie H2B, za pośrednictwem represora
GC box - 90

-> gen kinazy thymidynowej
-> geny histonowe H2B

- różna ilość w promotorach
- mogą działać w orientacji odwrotnej

Elementy odpowiedzi: wszystkie sekwencje rozpoznawane przez aktywatory, odpowiedni poziom transkrypcji, NIE SĄ SPECYFICZNE lub specyficzny bodzieć
GGGCGGG

ENHANCERY- wzmacniacze - duża odległość od promotora
UAS- upstream actibattor segeunces - u drożdży przed promotorem
- wiążą białka aktywatorowe
- dużo na małej powierzchni
- AP4, AP1, Ap3, Ap2 -> mało specyficzne
- wzmacnia aktywność promotora ( lecz nie wciągu - zbyt duża odległość) zagięcie DNA aby zbliżyć białka oddziałujące
- aktywatory oddziałują na miejsce promotora
GEN metalotioninowy:
- usuwanie jonów metali ciężkich - MRE

elementy odpowiedzi są zlokalizowane w promotorach lyb i/enhancerach:
- HSE- heat Srock response element
- GRE - glucocortycoid response element
- SRE - serum response element

- BLE - basal level element
- TRE- odpowiedź na czynniki rakotwórcze, TPA response element
działają w wyniku stresu

izolatory: sekwencje SNA działające jako bariera w aktywacji/inaktywacji transkrypcji
- izoluje od wpływów negatywnych ( od oddziaływania heterochromatyny (nie dochodzi do transkrypcji genów) na promotor (bardziej zwinięta niż euchromatyna)

D.melanogaster
Scs - spieciealized chromatin structures, wzór wrażliwości na cięcie przez DNAazę I
- odporność na trawienie 87A7
- sekwencje regulatorowe dla hsp70 i hsp70'

- rejony oporne na końcach 87a6 i 87a8 200bp i 350 bp samoczynna regulacja
rozpoznaje rejony będące potencjalnym miejscem ekspresji genów

regulatorowa domena chromosomalna
zabezpieczenie przed przechodzeniem sygnału, łączenie się z otoczką jądrową
MAR - matrix attamchment site przyłączenia dmeny na peryferiach jądra kom
LCR - locus control region - do ekspresji 1- kilku genów domeny
- promotory enhanserów

Transfekcja - wygaszanie genów:
- liposomy, jony wapnia , elektroporacja ( różnica napięć)

- obce DNA inkorporuje do chromosomów ( nie jesteśmy w stanie sprawdzić, w które miejsce) ;( :C ;__;
oddzielanie izolatorami - oflankowanie sekwencjami izolatora - sekwencja jest kontrolowana

stopień metylacji:
eucaryota - gdzie jest cytozyna i guanina - nieaktywne transkrypcyjnie wyspy CPG ( 1000-2000 par zasad, gęsto zawieszone w białkach metabolizmu podstawowego, w melanocytach , adenozyna w ADP )

House keeping - nigdy nie są metylowane

Metyzacja DNA
- MSPL - nie wrażliwy, tnie zawsze
-HPall - tnie tylko wówczas kiedy sekwencja jest niezmetylowana
analiza czy jest aktywny w transkrypcji

Czynniki podstawowe wiążą się wraz z pol. RNA w okolicy startu transkrypcji i w TATA box
aktywatory - czynniki transkrypcyjne rozpoznające krótkie sekwencje consensus w promotorze lub enhancerze ( elementy odpowiedzi) zwiększają efektywność wiązania czynników podstawowych do promotora kontrola wzoru i czasu transkrypcji

Koaktywatory - same nie wiążą się z DNA, łączą aktywatory z czynnikami podstawowymi
( łączniki, mosty)
regulatory struktury chromatyny ( acetylazy, deacetylazy)

Co robią aktywatory? BUJAJĄ SIĘ =D

bariera fizyczna - regulacja wejścia do jądra
Czynnik rozpoznający sekwencje odpowiedzialną za stres cieplny - FOSPFORYLACJA duże powinowactwo do elementu odpowiedzi
- przyłączanie ligandy (czynniki transkrypcji, wiązanie hormonu)
- działanie inhibitorów ( NF- kB)
- działanie dimerów - HLH ( helisa- pętla- helisa)
- działanie i wiązanie błon - sterole

Czynniki tranksrypcyjne:
- białka z dwóch domen , domena wiążąca z DNA i domena aktywująca się z aparatem podstawowym ( polimeraza DNA)
- fałdują się niezależnie od siebie
- domeny białek współdziałają ze sobą
- LexA - hamowanie genów S.O.S

HIV:
- aktywator , wiąże się rejonie promotora, zwiększa wydajność inicjacji transkrypcji
- wiąże się z transkryptem, musi być w sąsiedztwie promotora

wiązanie białek z domeną DNA- klonowanie genów +fuzja + gen danego białka ( tubulina)

CDK - łączenie z domeną aktywującą - klonowanie genów + fuzja

transferaza chlormafennikolu - bakterie nie giną , mają odpowiedni gen działa domena aktywująca domena DNA + domena aktywizująca fuzja genów SYSTEM DWUHYBRYDOWY

reporterowe geny:
- beta GAL (beta-galaktozydazę) badanie kolorymetryczne (wydajność ekspresji genu)
- lucyferaza

Klasyfikacja aktywatorów:
- palce cynkowe
-altywatory indukowane ligandem ( receptory steroidów, hormonu tyroidowego i kw. Retinojowego

- Helix - turn- helix - rozpoznanie DNA
- helix- loop - helix - działanie dimerów
-zamek leucyny

PALEC CYNKOWY:
- pętla cynkowa- pętla ok. 23 aminokwasy ponad miejscem wiązania Zn utworzony przez 2 His i 2 Cys . łącznik 7-8 aminokwasów

cześć: alfa- helisa
beta harmonijka
motyw w alfa helisie- rozpoznaje daną sekwencję

odmiana palców cynkowych - receptory hormonów steroidowych czynniki transkrypcyjne - muszą przyłączyć steroid
również:

- Glikortykoidy
- steroidy sexu
- wit D
- Kwas retinojowy
- trójodotyronina i tyrozyna
- adrenalina
- estrogen

Receptory - mają silną domenę wiążącą się z DNA
każdy czynnik ma 2 palce, nie mają histydyn lecz tylko 4 CYSTEINY, odległość determinuje odległość między sekwencjami , działają jako homodimery , rozpoznają sekwencje palindromową ( symetryczną )
odległość pomiędzy sekwencjami zależy od sekwencji palca i odległości
- wiąże koaktywatory ( acetylujące )
- działają jako homodimery
- rozpoznawanie miejsc an androgeny, progesteron, glikortykoidy

Homeodomena - Domena wiążąca DNA, ok. 60 aa, 3 alfa -helisy ( aminokwasy typowo zasadowe) ułatwia oddziaływanie z DNA , 3-helisa rozpoznaję sekwencję docelową,
selekcjonowana w dużej bruździe, kontakt zależny od sekwencji
- występuje u robaków i u muszek, rzadko u kręgowców ( oct-1)

HOMEOBOX - sekwencja kodująca homeodomenę
czytają geny ontogeniczne

HOX - rola aktywatora
eve - represor-> spowodowana strukturą chromatyny, hamuje TF2D

HLH- helisa- pętla-helisa , 2 helisy oddzielone pętlą, 15 aminokwasów, helisa amfipatyczna - z jednej strony aminokwasy z ładunkiem z drugiej o właściwościach hydrofobowych, tworzy kompleksy z drugim białkiem tego typu, dimeryzacja

bHLH -mają zasadowe aa w sąsiedztwie HLH, wiążą się z DNA , b- Basic region - bogaty w zasadowe aminokwasy

Id - czynnik nie wiążący się DNA, homo lub heterodimery,
MyoD - ulegają ekspresji w komórkach mięśni, czas ekspresji wyznaczany przez czynnik Id , brak aktywacji genów w kierunku ekspresji genów mięśniowych, w degradacji Id- aktywacja ekspresji

E12 - ulega ekspresji we wszystkich tkankach
MyoD/E12 aktywacja czynnika
E12/Id brak aktywacji

zamek leucytowy - do dimeryzacji ( AP1= jun +fos)
bZIP - obok zamka leucytowego ma zasadowy regon wiążący DNA
c koniec- helisa ampifatyczna, co 7 aminokwas - leucyna, po zwinięciu występują Leucyny w środku (wygląd spinacza) czynnik AP1, ( onkogeneza)
jun +jun = brak reakcji
fos+fos = brak reakcji

odwrócenie powtórzenia bez przerwy między nimi

DOJRZEWANIE TRASKRYPTU :
u bakterii: białko RO - pomaga polimerazie oddysocjować, tworzy szpilkę
eucariota:
Pol. RNA III -terminacja w drugim U(urydyny) serii poly (U)4 zawartej w rejonie bogatym w pary G-C ,przypominają bakteryjne terminatory

Pol. RNA I- terminacja > 100bp downstream od 3” końca dojrzałego transkryptu - ten jest generowany przez cięcie.
Terminacja - rozpoznawanie 18n sekwencji przez białek towarzyszące

Pol RNA II - systetyzowanie wszystkie mRNA, oprócz RNA histonu. przechodzi poniżej oryginalnego końca do 1000pb, poliadenylacja (AAUA) - kompleks bardzo niestabilny, nigdy nie przedostaje się do cytoplazmy ,

obróbka końca 5':
- polimeraza poli (A) - stymulacja cięcia
- CPSF - endonuklazy tnące 30 nukleotydów poniżej sekwencji tnącej
- Cstf - stymulacja cięcia
- reszty adeninowe 200-250
- PABP- stymulacja poli A polimerazy ( pol (a) trzyma się nici, nieoddysocjowuje)

powstawanie czapeczki - zanim działa poli A, 7 metyloguanozyna, wiązanie 5'-5'trifosforanowe , metylacja adeniny i ryboz - nie musi być pełna

GTP - łączenie grup fosforanowych,
CBP - comlex rozpoznający czapeczkę, transport mRNA do cytoplazmy

Funkcje modyfikacji:
- ochrona końców przed nukleazami
- rozpoznawanie przez białka transportowe - PORY
- stabilność transkryptu
- inicjacja translacji
- znakowanie mRNA ( ogonki poli (T))

Geny nieciągłe - cecha organizmów eukariotycznych

Typowy gen ssaczy ma 7-8 egzonów ( o długości 100-200bp) na przestrzeni ~16kb (pre-mRNA) oraz dlugie introny > 1kb . Po ich usunięciu mRNA ma ok. 2,2 kb

introny - wycinanie

hnRNA- hererogeneous RNA- transkrypcja pol II RNA, różnorodne co do wielskości, o niskiej stabilności
hnRNP - kompleksy hnRNA z białkami w jądrze komórkowym, rybonukleoproteiny
białka mogą się zastępować, stabilizacja mRNA, eksponują obszary mRNA na enzymu aparatu cplicingowego, rozplatają uwypuklone struktury,

RNP - rybonukleinowy kompleks

Systemy usuwania intronów:
1Przy pomocy wieloskładnikowego aparatu do splicingi (spliceosom), który rozpoznaje krótkie sekwencje consensus na granicy egzon -intron i w obrębie intronu . Reakcje transestryfikacja katalizowane przez RNA i białka.

2.Autonomiczne wycinanie intronów - 2 grupy intronów ( inna struktura 2-3 rzędowa) Reakcje transestryfikacji katalizowane przez RNA , RNA organelli -chloroplasty, mitochondria, u pierwotniaków i drożdży

3. Usuwanie intronów przez enzymy przecinające i ligujące - jądrowe prekursory tRNA drożdży

1klasa:
- krótkie sekwencja na obrzeżach intronów
- sekwencje bogate w pirymidynę, w środku adenina
- reguła GU-AG
- branch site- 18-40 nukleotydów powyżej 3” miejsca splicingu - bardzo konserwowane u drożdży
ciąg pirymidyn blisko końca 3” intronu

właściwość danego RNA, że rekacja odbywa się na końcach danego regionu
Miejsce 5” jest łączone z najbliższym miejscem 3”

Konformacja RNA wpływa na dostępność złącz i kolejność usuwania intronów
- tranksrypt nie idzie po kolei , lecz w nie

dowolnej kolejności zależy od tego ilość swatch ( GU-AG) parowanie cząsteczek RNA



Zasada usuwania intronów klasy I ( w jądrowym RNA)
- przy 5” końcu GU , rozpoznawanie UACUAAC
- przy 3” - cecha bogata w pirymidyny + reszta adeniny

- utworzenie wiązania 5'-2' - grupa hydroksylowa w rybozie - obrączkowanie
- rozdzielone intronu na kocu 5” egzonu
- forma lassa
- ulega przecięciu utworzenie formy liniowej
- utworzenie wiązania egzonu z egzonem

grupa hydroksylowa - atak egzon jest uwolniony, a wiązanie przeniesione w obrębie intronu

Exon 1-OH OPOExon 2


białka i czynniki splicingowe :
snRNA - małe jądrowe RNA zaangażowane w splicing i obróbkę RNA
snRNPs -snurps - małe jądrowe rybonukleoproteiny
Spliceosom - kompleks snRNPs ( U1, U2, U5, U4, U6) i dodatkowych białek. Wszystkie snRNPs za wyjątkiem U6 mają sekwencję konserwowaną ( Sm epitop) Rozpoznawaną przez specyficzne przeciwciała.
od 6-10 białek przypada na cząsteczkę DNA

splicosom - sekwencja rozpoznawania jedno-niciowa, na końcu 5' intronu
parowanie - zamiana nukleotydów - brak splicingu
GU-AG - silnie niekonserowane

5” GU - białka towarzyszące U1 snRNP, U2AF65, rozpoznanie miejsce Py-AG , zbliżanie miejsc do siebie UACUAAC


SF1- spinanie RNA
rozpoznanie kolejnego intronu
UACUAAAC -Py- Ag-GU rozpoznawanie przez U1 , wskazywanie miejsca brithside,
U1- miejsce splicingu
u2 - rozpoznawanie miejsca brithside, rozpoznawanie adeniny
dołączanie U2, U4, U5, U6
u5- bardziej w egzonie 1, (5”)
U6- rozpoznaje U2
oddysocjacja U1
U4-> oddysocjowanie U2+U6 katalizowanie transestryfikacji
hydroliza ATP -zmiana konformacji w snerpsach
zmiana konformacji 2rzędowej
U6+U4 hamowanie działania U2 z U6

EJC- exon junction complex > 9 białek - białka wykrywające złącza egzon - egzon , są rozpoznawane przez białka transportujące

Dojrzewanie mRNA :
- 2'OH wewnętrznego nukleotydu adeninowego
- autosplicing : bakterie i mRNA organelli ( gr 1, - też w jądrze niższych eucariota)
-3 `OH nukleotyd adeninowy

G-OH- rozpoczynanie reakcji

Wykrywanie intronów:
-wyizolowanie mRNA
- identyfikacja mRNA
- hybrydyzacja/ komplementacja mRNA z DNA
- odkrycie sekwencji nie pasujących do transkryptu

Splicing tRNA - sukcesywne reakcje cięcia i ligacji
GAA - kodon
2 pętle - 1 intron

brak reakcji transesowe

OH- grypa 3”
grupa fosforanowa - grupa 5”

Alternatywny splicing- daje różne produkty RNA z jednego substratu poprzez zmianę w użyciu złącz splicingowych

Szacuje się, ze do 75% genów ludzkich daje transkrypty podlegające alternatywnemu składaniu.

INFORMACJA-WIELE SPOSÓBÓW JEJ EDYCJI

Dscam (D.melanogaster) gen ma 116 egzonów, 17 podostaje w dojrzałym transkrypcie, Teoretycznie może dać 38 016 różnych białek, (do tej pory zidentyfikowano 18 tys)


Typy:
1. Pominięcie egzonu ( Exon skipping) -Dsx D. melanogaster
2. Użycie alternatywnych miejsc 3' lub 5” Tra D.melanogaster / antygeny T/t wirusa SV40
3. Zatrzymanie intronu ( intron retention)
4. Wzajemnie wykluczanie się egzonów -tropomiozyna szczura

Splicing a choroby
defekty składania
- pierwotnie
mutacje punktowe -wpływaja na proces skąłdania ( ataxia telangiectasia, nerwiakowłóczność), otępienie czołowo-skroniowe
-wtórne : Syndrom pradera Williego ( składanie mRna receptora serotoniny)
choroba Alzheimera i Parkinsona - 3 wersje splicingowe ( składania mRNA esterazy acetylocholiny, nieprawidłowa metyzacja DNA)
dysftrofie mięśniowe Ducjenne, Beckera (dystrofia), degeneracja rdzenia kręgowego (tau)

Jak możemy zbadać czy dany gen ulega splicingowi alternatywnemu.
- hybrydyzacja
- sondy ( odcinki DNA będące komplementarne do egzonów lub połączeń intron- egzon)
określenie poziomu alternatywnego i wzoru ekspresji genów

Splicing alternatywny :
- koniec transkryptu taki sam (3”) ale przy 5” inny rodzaj połączeń - T/t SV 40
t daje krótkie białko , kodon stop translacji
T dłuższe białko

- E1A - kilka wariantów składania
koniec 3” ten sam, różne warianty przyłączenia egzonu przy 5”

- alfa tropomiozyna szczura - alterantwyny splicing egzonów
- koniec 3” i 5” mają różne warianty

- d.melanogaster:
- k. somatyczne - włączanie egzonu, obecny kodon stop translacji - 66k
- k. gametyczne - wyłączanie egzonu , 87 k

Różnicowanie się much
- białko Tra - inny wzór u samców i samic
- samiec - kodon stop
- samice, wyłączenie egzonu - białko 200 aminokwasów - kontrola składania następnych czynników białko DSX

DSX - samice - krótsze białko

Samica - dłuższe białko - drugorzędowe cechy płciowe

szlak składania alternatywnego składania. D. melanogaster
Sex-lethal splicing alternatywny brak u samców

u samic egzon pominięty
powstanie aktywnego długiego białka, transkrypt Tra - transformer pomieciecie gzonu , kodon stop translacji ( samice) , u samców inne białko

doublesex u samic/u samców wyrażenie cech genotypowych

TRANS SPLICING - splicing pomiędzy dwoma różnymi RNA
(klasyczny w formie in cis)
- introny mają odwróconą komplementację

- RNA pochodzą z dwóch różnych organizmów - wymieniają się sekwencją
- SL RNa ( sp;Icek leader RNA,, 35 n ) male RNA dające egzon w trans - splicingi
- u Nematoda i Trypanosoma , ma strukturę przypominającą miejsca wiążące Sm w U Sn RNA
- białko 35 base leader GU -> left intron
mRNA - AG—prawy intron
następnie UG A --- AG


- np. geny aktyny u Nematoda

Eukariota:
18 S- mała podjednostka rybosomy
5,8S , 28 S - duża podjednostka rybosomy
- działają
egzo i Endo nukleazy
SnoRNA - małe nukleonarne ( jąderkowe ) RNA - wskazują nukleazo,m gdzie mają ciąć

Prokaryota
- pomiędzy !6S , 23S 5S rRNA znajduje się transkrypt dla t RNA


modyfikacje r RNA:
- metylacja rybozy w pozycji 2 ` - > działanie snoRNA wskazują miejsce metyzacji
BOX C ( GUGAUGA) - NNNNNN - BOX D ( CUGA)
NNNNNN- sno RNA
- pseudourydyna - nie łączy się z rybozą przez N1 tylko przez pozycję C5

klasa małych jąderkowych RNA:
- H box - ANANNA
- ACA box - ACANNN
tworzenie spinki - hybrydyzacja z docelowym RNA

EDYCJA RNA- informacja zmienia się na poziomie m RNA

zmiana jednego nukleotydu w transkrypcie - aucariota

ssaki - apolipoproteina B ( 29 egzonów) składanie 1 rodzaj mRNA
lecz dwa różne produkty
- w wątrobie produkt długi - 4000 aminokwasów
- w jelicie - 2000 aminokwasów

zmiana na poziomie mRNA
- w wątrobie - kodon CAA - nonsens - STOP
- w jelicie - UAA

apolipoproteina B - transport lipidów ( cholesterolu)
- dłuższa wersja - transportuje i dostarcza do komórki

receptor kwasy glutaminowego w mózgu

- 2 produkty ( podstawienie A-I) zmiana przewodnictwa kanału :
- glutamina
- arginina

Przykłady u niższych eucariota :
- potężne zmiany


urydyna - włączona po transkrypcji - 4 ! nie 3 więc przesunięcie transkryptu
- w podjednostce 2' oksydazycytochromowej C

CoxIII - dodanie sekwencji urydyn do 7 zasad zaotowych
do tego potrzebne nowe RNA ( GUIDE RNA)

Guide RNA - ma sekwencję dokładnie komplementarną do obrobionego mRNA

Jest matrycą, która wskazuje, gdzie mają być wstawione dodatkowe U

zachodzi od 3'- 5” każdy rodzaj edycji

TUTase - przyłączanie nukleotydu z U
___________________________________________________________________________
Rybozym - cząsteczka RNA o właściwościach katalitycznych ( może przeprowadzać reakcję ciećia i /lun ligacji wiązań fosfodiestriowych w obrębie tej samej cząsteczki RNA lub dwóch różnych RNAS
Rybozymy: bardzo specyficzne, lecz wolniejsze od białkowych
Rybonukleaza P - część białkowa i cześć RNA ( rola katalityczna )=> cięcie
Introny z grupy I i II
Toroidy i wirusoudy
RNAase P

Najszybsze - enzymy białkowe, mało specyficzne
RNAaseT1
beta- galaktozydaza


Wiroidy - małe infekcyjne RNA - 350 n ( bez białkowego kapsydu), roślinne pasożyty
Wirusoidy - satelitarne RNA - też, ale korzystają z kapsydu innego wirusa roślinnego

replikacja - według modelu toczącego się koła , tworzenie multimerów
multimery- wycinane są same, Hammer head :
- nić dolna ma właściwości katalityczne ( autokatalityczne zdarzenie)
- potrzebne są jony Mg2+

___________________________________________________________________________
Wyciszenie ekspresji genów

teoria RNA - sprawdzić w domu

1. regulacja ekspresji przez antysensowny RNA

- koduje ekspresje określonych genów
- potrzebny jest RNA o przeciwnej orientacji
- promotor jest indukowany
- wycisza ekspresję genów

- nie muszą parować na całej długości
- rejony nieulegające translacji wiązanie z rybosomami zasłonięcie przez antysensowne RNA brak ekspresji genów
- parowanie zmusza endonukleazę do przecięcia nukleotydu
-

u prokaryota - inne mechanizmy usuwania ekspresji genów

u ludzi

- wprowadzanie plazmidow , pod promotorem antysensowny gen wbudowywanie do DNA
zapobiega to ekspresji
hybrydy rozpoznawane przez nukleazy
parowanie zapobiega transportu RNA do cytoplazmy

Riboswitch - ryboprzełącznik, część która wiąże ligand i reguluje ekspresję tego mRNA
- część mRNA wiąże ligand ( końcowy produkt szlaku metablicznego szlaku gdzie mamy operon)

regulacja na poziomie RNA, przyłącza się metabolit - regulator sensowanie otoczenia

GlcN6P
glmS mRNA --------- region kodujący translacja GlmS aktywacja enzymu Fru6P->
GlcN6P - łączenie fosfoglukozy

Końcowy produkt dołącza się do ryboswitcha i aktywacja rybozymu - odcięcie miejsc łączenia RNA z rybosomom - wyłączenie dalszej ekspresji

AUG- inicjacja translacji ,
glukozo6fosfataza - uaktywnia cięcie

kontrola syntezy:

- guaniny
- tiaminy
- donory grup metylowych
-
Inny sposób regulacji
- RNA nie koduje lecz nie znajduję się żaden terminator transkrypcji - więc transkrypcja przechodzi przez gen lub operon zapobiega to składaniu kompleksów 2 promotora -> zapobieganie transkrypcji

Klasy małych RNA:
- sRNA - small RNA - regulują ekspresję genów bakteryjnych
- siRNA - small interfering RNA
- miRNA = micro RNA - mogą parowac na końcu 3” - wpływają na dalszą ekspresję

regulony
w bakteriach regulowane przez sRNA
OxyS - nie koduje białka , RNA regulujące Ekspresję ok. 10 genów ( m.in. rpoS i flhA)

stres - woda utleniona

działanie regulonów
- rozbudowana struktura II rzędowa - część sekwencji paruje na 5” końcu
oxyR - wyłącza ekspresję rpoS ( czytanie genów w fazie stacjonarnej)
- białka regulujące stężenie Fe

Eucariota:
- odpowiednik microRNA - krótkie 21-24 nt
lin14 - odpowiada za przejście z fazy larwalnej nr 1- nr 2 , w fazie n2 znika, kiedy pojawia się lin4 nie ulega zanikowi i translacji, działa jak RNA - lecz nie dochodzi do ekspresji

u ludzi homologi lin4

Dotąd zidentyfikowano 4175 microRNA ( rośliny, zwierzęta, wirusy)
- liczbę genów miRNA w genomie ssaczym ocenia się na 1000
- zidentyfikowano 474 ludzkich miRna
- oszacowano, że regulują 30 % genów w ludzkim genomie
- 12% zidentyfikowanych mikro Rna- sekwencje konserwowane ewolucyjnie

Biogeneza i działanie:
- normalne transkrypty polimerazy II
- powstają jako długie transkrypty i są do siebie komplementarne -> tworzą szpilki
- obróbka: w jądrze komórkowym ( mikroprocesor - obcinanie fragmentów RNA ) premikroRNA- transport do cytoplazmy

DICER - odcinanie skrajnej pętli
Helikaza - degradacja i rodzielenie nici
ARGONAUTA- endonukleaza
kompleks RISC ( microRNA incluced silening Complex) - -> uaktywnienie
100% parowanie ( rośliny)
Argonauta przecina degradacja mRNA
NIE 100 parowanie
- represja translacji, wyłączenie translacji ( zwierzęta)


geny miRNA :
- oddzielne geny i promotory czytane przez różne aktywatory , tandemowo ułożone, jako jedna jednostka transkrypcyjna
- 40 % wewnątrz intronów
- obróbka mikroRNA
- bardzo mała cześć w egzonach

miRNA:
- proliferacja i różnicowanie
- apoptoza
- szlaki metaboliczne
- ochrona genomu

-embriogenza i organogeneza
-utrzymywanie i różnicowanie komórek macierzystych
-transformacja nowotworowa

Przykłady ssaczych miRNA
mir-1 profileracja i zróżnicowanie mięśni szkieletowych i serca - HAND2;HDAC4
miR10a - megakariocytopoeza = XOXA1
miR015a - granulupoeza = BCL2, regulatory wzrostu
miR16-1 - Przeżywalność limfocytów B
mir - 221 0 Erytropoeatza = C Kit

miR027b 0 regulacja enzymów leków= CYP1 B1

mir -32 Obrona przed wirusami

Nieprawidłowa ekspresja miRNa może prowadzić do chorób związanych z zaburzeniami proliferacji komórek

Nowotwory :
1. Ponad 50%genów miRNA jest w rejonach chromosom związanych z nowotworami
2. Nietypowy wzór ekspresji miRna u chorych an nowotwory
3. profile miRna z prób pochodzących od pacjentów chorych na raka dają zestaw 21 reg.

miRNA jako supresory lub onkogeny nowotworów - tzw. ONKOMIRY
- jako onkogeny - wyciszają ekspresję supresora

Interferacja RNA - powoduje degradację docelowego mRNA ( komplementarnego do którejkolwiek nici)

podwyższenie ekspresji mikrona wyciszające supresor nowotworu gen supresorowy obniżenie ekspresji genu supresorowego Skutek : poliferacja, inwazyjność, angiogeneza i spadek apoptozy
miR -155,
miR -17-92
miR -21
miR 221

obniżenie ekspresji mikrona wyciszającego onkogen onkogen podwyższenie ekspresji onkogenu skutek : proliferacja , inwazyjność, angiogenaza , wzrost apoptozy
np.:

let -7

mir- 145
mir- 15a
mir - 16-1
mir - 143

Interferencja :
siRNA- - podwójne RNA , na końcach 3” - dwa niesparowane nukleotydy, zazwyczaj jest wprowadzone do komórek, pierwotnie w odpowiedzi na zakażenie wirusami, retrotranspozony ( RNA) przepisane na cDNA lub powstaje dwuniciowe RNA mechanizm wyciszania przycinanie powstanie siRNA ( dwunicowe, z brakiem dwóch nukleotydów an końcu 5')

dsRNA
aktywność nukleazy, przecina dwuniciowe DNA
aktywność ATP'azy

• powstanie siRNA + kompleks RISC ( powstanie jest indukowane przez siRNA)
  

Argonauta- aktywność endonukleazy

Jedna z nici ulega degradacji przy obecności ATP-- > argonauta odcina koniec 5' siRNA ( bardzo krótkie)

siRNA- parują z początkiem 5' transkryptu

miRNA- parują po stronie 3' transkryptu

Porównanie:

miRNA - kodowane przez komórkę
transkrypty bardzo długie
enzym Drosha - powstanie szpilki
Dicer - obrabia, usuwa pętelkę, zmontowanie kompleksu wyciszającego
kompleks RISC
docelowe jest degradowane ( np., przez hamowanie translacji ) transport do ciałek P


siRNA - początkowo długie, dwuniciowe cząsteczki
Dicer- przycinanie
utworzenie kompleksu RISC/ RITS
- lepienie się do końca transkryptu
RITS = alternatywny kompleks, znajduje RNa w jądrze komórkowym
- metyzacja DNA
- tworzenie heterochromatyny
- wyciszanie ekspresji na etapie całego chromosomu

dsRNA > 26 nukleotydów - przy wprowadzenie do ciała ssaków - usuwanie związku z reakcją podobna jak przy zakażeniu wirusem
degradacja
zatrzymanie syntezy białek

dsRNA - uaktywnia kinazy elF2a

- uaktywnienie RNA'azy L


należy wprowadzać krótsze siRNA , lub w postaci genu


Wykorzystanie:
- badanie funkcji genów
- terapie
- genomika funkcjonalna
np.:
wprowadzanie uszkodzonego genu rekombinacja zamiana zdrowej kopii na niewłaściwą ( z kasetą oporności) bardzo niska wydajność
alternatywa :
siRNA - wprowadzanie z pomocą liposomów

Polipleks siRNA
spłaszczanie liposomów, powinowactwo do membran komórkowych, powinien posiadać przeciwciało przeciwko danemu receptorowi, internalizacja endosomalna,


Struktura chromatyny i jej wpływ na ekspresję genów

DNA - 2,5 m

pierwszy stopień upakowania - zmniejszenie rozmiaru 6x
2 stopień - solenoid - zmniejszenie rozmiaru 40x
domeny DNA o długości 10-300 tys pz - zmniejszenie rozmiaru 1000 razy
przejściowe zmiany w chromatynie interfazowej

zespół doemn tworzy grona - upakowanie zmniejsza się do 10. 000 razy

podczas mitozy - brak transkrypcji

stopień upakowania - zalezy od histonów
histony oktamerowe :
budowa globularna, Ogonki bogate w lizyny i argininy - charakter zasadowy - wystają poza nawiniętą nic DNA - łatwo dostępne dla enzymów modyfikujących , wprowadzajacych

dodatkowe grupy
2 x (H2a, H2b , H3, H4) = oktamer - nawinięcie nici DNA na oktamer


czynniki bazalne + polimeraza zmiana struktury chromosomów , przesunięcie rdzenia
promotor nieaktywny - heterochromatyna, brak miejsca na przyłączenie się enzymu
promotor aktywny - poluzowanie struktury , dojście enzymów do sekwencji

wyczyszczenie rdzenia chromosomu - proces energochłonny - hydroliza ATP

Typy remodelingu: ( zmiana ułożenia oktamerów względem DNA)
- ślizganie się oktameru - slide'ing( nuklosomu)- ślizg rdzenia względem DNA, ścisłe połączenia (14) zostają zniszczone, oktamer obraca się względem DNA eksponacja innych sekwencji
- zmiana spacingu ( odległości między histonami ) - wyrzucenie histonu H1 ->energia

przesunięcie łącznika

rdzeń + łącznik ( najbardziej wrażliwe na cięcie nukleazami, tworzy się solenoid) - 200 pz
- nukleonom jest wyłączany z DNA - nagie, wolne DNA

przykłady kompleksów

SWI/SNF RCS - kompleksy demodulujące chromatynę - powoduje slide'ing

ISW - usuwanie rdzenia z DNA

RCS - bezwzględnie potrzebne, inaczej sa letalne

Początki remodelingu:
- czynnik poznający specyficzną sekwencję - ściąganie kompleksu remodelującego ( Kiss and run)

histony:
- pomagają w odpowiednim rozpoznaniu DNA
- receptory dla hormonów sterodowych (przyłączenie 3 dimerów, na nagim tylko 2 i brak NF1 jeżeli brak histonów)
- pomagają rozpoznać NF1 , OTF-1
- łatwiejsze rozpoznawanie danych czynników
- prawidłowa ekspozycja DNA


heterochromatyna - bardziej zwinięta niż euchromatyna - brak ekspresji ,
heterochromatyna - rejony genomu, gdzie chromatyna jest bardziej skondensowana ,

zmiany w strukturze chromatyny - zmiana ogonków histonów,
w pozycji N- końca Argininy i lizyny - > metyzacja i acetylacja , fosforylacja ( Ser)

aktywna chromatyna - grupy ecetylowe
nieaktywna - grupy metylowe

Acetylacja - zapobiega metyzacji
metyzacja - w telomerach ( struktura heterochromatyny, brak ekspresji)
H4- acetylacja ( lizyn) lub metyzacja sprzyja aktywności aktywacji chromosomu X

ACETYLACJA
- enzymy HAT ( histone acetylotransferaze ) -grypa B -> acetylacja ogonków histonowych podczas fazy S, neutralizacja tych samych ładunków acetylacja - usuwanie i odtwarzanie rdzeni replikacja
- enzymy HAT - grupa A - modyfikacja ogonków pistonowych poza fazą S - acetylacja w czasie ekspresji

Kooaktywatory transkrypcji - mają funkcje acetylztransferazy ( p300/ CPB) H3 lub H4 - acetylacja

molekuła rozpoznaje docelowe DNA / aktywator zwabianie acetylach lub deacetylazy ( HDAC) - inhibitory HDAC kw. Masłowy i trichostatyna wyciszenie

nowotwory :
duża aktywność HDAC - wyciszanie supresorów nowotworowych przyspieszony wzrost nowotworu leki wyciszające - kw. Maslowy ( z błonnika w jelitach) rzadsze nowotwory

rozpoznanie --> demodeling kompleks acetylaz acetylacja histonów transkrypcja

METYLACJA
- usuwanie grup przez deacetylazę rozpoznawanie przez metylazę DNA metylacja
- rola w kontroli ekspresji genów
=> większe upakowanie struktury chromatyny

fosforylacja histonów - rozluźnianie chromatyny

Zmiany epigenetyczne - mają wpływ na fenotyp bez zmiany genonotypu. Składają się na nie wszelkie zmiany we właściwościach komórki, które mogą być dziedziczone, ale nie są efektem zmian an poziomie DNA
Właściwości genu sa zdeterminowane przez ( self - perpetuatung) strukturę chromatyny.

Zmiana ekspresji genów w zależności od położenia = PEV= wyciszenie ekspresji genu w wyniku sąsiedztwa z heterochromatyną .

gen warunkujący gen czerwony oczu u Drosophila melanogaster. -obszar blisko heterochromatyny migracje heterochromatyny =>wygaszanie genu => we wczesnych etapach rozwoju - brak ekspresji genów -> białe łatki na oku - EPIGENETYCZNE DZIEDZICZENIE = powstanie z pierwszej komórki, gdzie doszło do przemieszczania heterochromatyny


heterochromatyny - modyfikacja histonów -> wstawienie grup metylowych +
białka heterochromatyny HP1 -lączy się z podjednostką metylową

heterochromatyna :
- zwinięcie ( kondensacja)
- rozpoznanie białka
- opłaszczenie fragmentu DNA
brak możliwości przyłączenia jakiegokolwiek enzymu

Silincing complex - drożdze - telomeric silencing

odpowiedniki HP1 - białak SIR herochromatyna - niekatywna transkrypcyjne

Rodzaje heterochromatyny :

konstytutywna - często sekwencje niekodujące ( zazwyczaj satelitarny DNA), w centromerach i telomerach . Jest ZAWSZE nieaktywna ( wynika to jej z natury)

fakultatywna - dotyczy całych chromosomów, które sa nieaktywne w danej lini komórkowej, a w innej mogą ulegać ekspresji , np. ssachy chr. X

oba chromosomy X mają tę samą sekwencję, ale gdy eden z nich w danej komórce zostaje inaktywowany- ten stanm przekazany jest do komórek pomnych - dziedziczeni epigeniczne
Inaktywacja ( utworzenie heterochromatyny ) zachodzi losowo ( u łożyskowców) w komórkach podczas embriogenezy

Regulacja ekspresji genów - chromosomy płci - całe ulegają regulacji
Kompensacja poziomu ekspresji genow chromosomów X przy różnej ich liczbie

muszki - u samców chromowy X ulegają wzmożonej ekspresji
ssaki : inaktywacja losowego chromosomu X
heterozygota - mozaika obydwu cech, komórki z inaktywowanym chromosomem, na poziomie Blastuli - dziedziczenie epigenetyczne

wymagany jest rejon XIC - RNA nie jest przepusywane na DNA (?) -- > XIST RNA
nawet jak 3 chromosmy X XXX ( zawsze dwa zostają inaktywowane), tak aby zawsze jeden chromosom był aktywny
dziedziczenie epigeniczne ( brak zmiany sekwencji, zmiana stopnia upakowania- modyfikacje białek i modyfikacje DNA)

Metylacja DNA

metylacja adenin - regulacja częstości replikacji

wzór metylacji : cytozyny w CG - metyzacja
5-7% cytozyn jest metylowana - np.pozwala na zmienność genetyczną u bliźniąt jednojajowych
ustalany na poziomie embriogenezy, może zmieniać w okresie życia osobniczego

po replikacji jedna z nici jest metylowana - METYLOTRANSFERAZA ( przenosza grupę metylową z donora na cytozynę) ,
przekazanie wzoru z nici matczynej na nić potomną
jest potrzebny Dnmt1 - utrzymuje wzór metylacji na nici potomnej
U ssaków:
- Dnmt3A
- Dnmt3B
wprowadzają wzór od nowa


Usuwanie grup metylowych - do drugiego tygodnia życia zarodka - czyszczenie wzoru metylacji
- DEMETYLAZA
- usuwanie całego nukleotydu i następnie reperowane przez enzymy naprawcze

- usuwanie grupy metylowej

Imprinting
IMPRINTING - rodzicielskie piętno genomowi
Różny stopien metylacjia w komórkach jajowych i plemnikach
Inaczej zachowują się allele dziedziczone po ojcu inaczej po matce
Nie podlega prawu mendla

Specyficzny wzór metyzacji w komórkach - imprinting - różne zachowanie allelu dziedziczonego po matce od allelu dziedziczonego po ojcu (METYLACJA powoduje wyciszenie genu)
np. u myszy GF - II - ten odziedziczony po ojcu - ulega ekspresji, po matce - nie IGF- IIIR - Odwrotnie -

GF
Wzór metyzacji jest ustalony podczas gametogenezy
W plemniku - ojcowskie DNA nie jest metylowane - ulega ekspresji
podział zygoty podział na tkanki , lecz część z nich bd produkować gamety jak DNA jest zmetylowane jest ZALEŻNE OD PŁCI dziecka ( nie zależy to od wzoru metyzacji odziedziczonego po rodzicach)

samiec - zawsze niezmetylowane
samice - zawsze zmeTylowane niezależnie czy wzór metyzacji pochodzi od ojca czy od matki


ICR - działa w cis - imprinting control region - ulega imrintingowy - ma blisko położony rejon

ojciec - rejon kodujący imprinting - jest metylowany - wygasza ekspresję pobliskiego genu
matka - rejon kontrolny nie jest metylowany - jest ekspresja, wspomaga enhancer,
do NIEZMETYLOWANEGO regionu przyczepione jest białko działające jako izolator
ICR- białko izolujące

zdrowy gen - nie jest METYLOWANY
epigenetyczne zmiany - zmiany sekwencji METYLACJI
- zespół Algelmana - upośledzenie umysłowe, osobniki o marionetkowych ruchach - brak wersji matczynej - ulega zaburzona ekpresja genów, różny stopień metylacji

Wzór metyzacji zmieniania w czasie życia osobniczego - zmiany w życiu płodowym
- CH3 / +CH3 - ten sam gen warunkuje barwę futra . Kolor futra zależy od stopnia metyzacji DNA tego genu

Donor CH3 - S-adenozylometionina
w czasie rozwoju płodowego jest potrzebna odpowiednia ilość przenośników CH3 - np. kwasu foliowego, cholina, metionina

brak metyzacji DNA - sprzyja rozwojowi nowotworów, nadwadze, skraca życia


DZIEDZICZENIE EPIGENENETYCZNE- zmodyfikowanego DNA ( imprinting ) lub /i białkowych struktur ( PEV)

dziedziczenie za pośrednictwem zmian w białkach (np., w histonach )
brak acetylacji ogonków H3, H4 - nic jest podobnie zmetylowana jak histony

= segregacja - stary kompleks zostaje na starej nici, na nowej tworzy się nowy kompleks

= część kompleksu jest na starej nici a część na nowej

białko wymusza wprowadzenie modyfikacji

histony są acetylowane replikacja
dziedziczenie poprzez białka :
_________________________________________________________________________
Prion - białkowy czynnik infekcyjny, dziedziczony
Sup 35- stan Psi - drożdze
PrP^Sc - owce ( scrapie ) i krowy ( bosine spongiform encephakopathy)
u ludzi - choroba kuru , Creutzfeldta - Jakoba, Gertsmanna - Strausslera

=> zwyrodnienia układu nerwowego

Drożdze
Psi - / Psi (+) - PRION
zalezy od białka Sup 35 ( ten sam gen)

Psi-
mRNA- translacja Sup 35 ( monomer, podatne na wyższą temperaturę i detergenty) pomaga zakończyć translację

Psi+
Sup 35 ( brak alfa helis, beta harmonijka , nie jest rozpuszczalne, brak aktywność , inna funkcjonalne wymusza na zdrowym białku zamianę w chore ) nie konczy translacji

zmienia konformację zdrowego białka Sup35 , może być przekazane komórkom potomnym


U ssaków czynnik PRP^Sc
PRP^c - zdrowy czynnik ( c- cytoplazma)

PRP^Sc - czynnik infekcyjny (S - srapie)

infekcja myszy czynnikiem - jeżeli mysz posiada zdrowy gen to po zainfekowaniu prion wymusza zmianę zdrowego białka na infekcyjne

jeżeli mysz nie ma zdrowego czynnika - mysz przeżywa, gdyż nie mamy co modyfikować
żeby zachorować trzeba mieć odpowiednik genu kodującego czynnik

















MUTAGENEZA I NAPRAWA

mutageneza - proces powstawania mutacji
Mutacja- dziedziczona zmiana sekwencji kwasu deoksyrybonukleinowego

Mutacje spontaniczne - rezultat błędów w replikacji lub działania czynników środowiska ( losowych)

Poziom tła mutacji - tempo z jakim zmiany w sekwencji akumulują się w genomie danego organizmu. Jest stanem równowagi między powstawaniem mutacji spontanicznych, a ich usuwaniem przez systemy naprawcze.
Charakterystyczny dla danego gatunku.

Mutacje indukowane - rezultat działania mutagenu - który zwiększa częstość mutacji poprzez bezpośrednia lub pośrednią indukcje zmian sekwencji.

zmiana dziedziczona w sekwencji 1000 p/z raz na 10^5 - 10^6 generacji

Bakterie
Podjednostka alfa pol. III DNA myli się się 1/10^4 nukleotydów podczas polimeryzacji
IN vitro ( to było spowodowało mutację w co 10 genie ) lecz ma aktywność KOREKCYJNĄ ! w kierunku 3'-5'

Lacl - częstość mutacji ( spontanicznych ) w poszczególnych pozycjach genu
Często w tych miejscach są zmodyfikowane zasady np. 5- metylocytozyna

Różne mutageny mają różne „ hot spot” mutacji
Eukaruota : wyspy CpG, tam 5 -MeC ( stanowią tylko 1 % zasad ludzkim DNA, ale te miejsca stanowią 30% wszystkich mutacji punktowych

poziom tła dosyć niski - elementy naprawcze

Mutacje spontaniczne:

Spontanicznie Cytozyna ulega deaminacji - uracyl
Systemy naprawcze usuwają uracyl ( nie występuje w DNA)
URACYLO- DNA- GLIKOZYDAZA

5- metylocytozyna ulega deaminacji zamienia w tyminię.
Nie zawsze system naprawczy DNA usunię tyminę ( normalnie występuje w DNA)


Sekwencja pierwotna - niesmutowana - wt (Wild type)
Mutacja postępowa - zmienia sekwencję genu

Mutacje punktowe ( chem, modyfikacja lub bład w replikacji, analogi zasad) :
-Substytucja ( tranyzcja G-C - A-T ) , transwersja A-T - T-A lub C-G)
-delecja
- insercja ( transpozony, itp.)

Mutacje chromosowme :
-Inwersja
-dupliakcja

-delecja
- translokacja

Mutacja wsteczna :
-Rewersja - prawdziwa lub w innym miejsc genu kompensująca mutację pierwszą ( secon - site reversion)
- Supresja : mutacja w innym genie, która zapobiega efektom mutacji danego genu ( np., w genie tRNA)

MUTANTY DELECYJNE NIE REWERTUJĄ !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Rewertanty - u bakterii ( nie może być DELECJI)

Mutacje utajone
- dla 20 z 22 aa istnieje 206 kodonow ( degeneracja kodu genet.)
Mutacje:
- zmiany sensu
- nonsensowne ( UAG, UAA, UGA)
- zmiany fazy odczytu

Mutacje :
- Loss- of - function - eliminuje lub redukuje aktywnośc genu. Białka: często recesywna
- Gain of - function- powoduje wzrost aktywności genu/ białak; często dominująca
- null - kompletnie eliminuje funkcje genu

Mutageny :
I klasa- działanie bezpośrednio na zasady w DNA
Deaminacja : Kwas azotawy HNO2 - ułatwia deaminacja zasad

CG deaminacja U-G T-A
A-T deaminacja HIPOKSANTYNA - C G- C

pirymidyny
cytozyna
tymina
utacyl

puryny:
adenina
guanina

metylocytozyna tymina
C-G -------------T-A

( CAG ------------ TAG = UAG- amber)

Czynniki alkilujące - dawcy grup METYLOWYCH
- Iperyt siarkowy, azotowy
- tlenek etylenu
- siarczan dwumetylu ( DMS)
- nitrozoguanidyna
- nitrozomocznik

- sulfonian metanometylowy ( MMS)
- dimetylonitrozamina


odkształcanie helisy

Alkilacja zasad w pozycji N lub O
najczęściej alkinowana jest G ( 7NmeG, 7NetG, 6OmeG)
spontaniczna DEPURYNACJA, w wyniku błędnej syntezy DNA - naprzeciw AP - miejsca preferencyjnie włączana A ( G-C- T- A)

Czynniki o 2 grupach alkilowych mogą powodować powstawanie wiązan poprzecznych między dwoma nićmi DNA
Crossbridge formation

alkilacja reszty fosforanowej - hydroliza między dezoksyrybozą a fosforanem

ANALOGI ZASAD:
- Bromodeoksyurydyny (BrdU), Analog T, paruje z A lub G
- N4- hydroksycytyna ( OH 4Cyd)0 zastępuje C lub T ale nie tworzy par z żadną z puryn)
- 2 aminopuryna ( n2Pur) paruje z A lub C

BRAK JEDNOZNACZNOŚC PRZY TWORZENIU KOMPLEMENTARNYCH PAR


Czynniki interkalujące :
Pochodzne akrydyny ( proflawina, akryflawina)
Bromek etydyny


interkalują między warstwowo ułożone pary zasad oraz na zewnątrz helisy DNA ( utrwalając strukturę szpilki ) - delecje i incesrcje w czasie syntezy DNA. Zmiana odczytu

czynniki fizyczne

UV
- przerwanie wiązań między sąsiednimi pirymidynami
- tworzenie dimerów pirymidynowych ( TT- 90% ; 6-4 TC - 10 %)


Promieniowanie jonizujące
Produkuje rodnik hydroksylowy
- reaguje z T ( wysycenie wiązan 5,6 pierścienia ) - AP
- otwarcie pierścienia pirymidynowego i imidazolowego - AP
- ss i ds. pęknięcia ( rozerwanie wiązań fosfodiestrowych)


Addukty DNA - odkształcenie helisy
Cis- platinum intercalation

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne ( WWA)

- benzopiren

- dimetylo- benzoantracen ( DMBA)

Powstają w wyniku niepełnego spalania materii org , ( smażenie, pieczenie na ruszcie0 piroliza tłuszczu ) dym wędzarniany, zanieczyszczenie środowiska

Reagują gł , Z purynami ( G- w C8 lub N2: A- w N6)
Zaburzenia konformacji DNA


Toksyny środowiskowe :
heterocykliczne aminy aromatyczne

Wiele kancerogenów staje się mutagenami po uprzedniej aktynwości metaboliczne w komórce
- AFLATOKSYNA B

Reaktywne elektrofile
Niereaktywne , nierozpuszczalne w wodzie, Wymagają bio- aktywacji ( w organizmie ulegają aktywności - reagują z DNA

Systemy naprawcze :
Naprawa źle sparowanych zasad (mismatch repair)
Bezpośrednia : fotoreaktywacja, O6 metyloguanino-DNA metylotransferaza
Przez wycięcie zasad ( base excision repair)
Przez wycięcie nukleotydów ( nucleotide - excision reapir)
Rekombinacyjna naprawa - zdarza się po momencie replikacji

NHEJ - niehomologiczne łączenie końców
indukowalne -error-prone ( SOS bakteryjny system , niekiedy - łączenie końców)

Nie każde uszkodzenie kończy się mutacją .
aktywność konstytucyjna - brak mutacji , bezbłędność
systemy mniej dokładne np., SOS- naprawa nie jest bezbłędna, wprowadza błędy

Aktywność korektorska polimeraz DNA ( proofreading)

Podjednostka alfa pol III DNA myli się 1 na 10^4 nukleotydów podczas polimeryzacji.
To spowodowałoby mutacje w co 10 genie
Tymczasem czesctość mutacji w komórkach bakteryjnych wynosi <1 na 10^5 - 10^6 genów/ generację

Jest to duża zasługa aktywności korektorskiej 3”-5” polimeraz DNA

Mutacja w podjednostce epsilon pol III DDNA coli - brak aktywności korektorskiej częstość mutacji spontanicznych wzrasta 1000 krotnie

aktywność mutatorowa - podwyższa częstość mutacji

Inne mechanizmy sprawdzające wierność replikacji
- naprawa źle sparowanych zasad
Skanowanie DNA, rozróżnianie nici starej od nowej, naprawa przez wycinanie

W E. coli, metylaza Dam, mutH endonukleaza ; mut L; mut S,. helikaza II, SSB, pol III DNA, egzonukleaza, egzonukleaza I , ligaza

podczas replikacji mismatch - brak aktywność korektorski polimerazy
ważną rolę - metylacja - wskazuje która nic jest stara ( matczyna) - w nowej nastąpiło błędne wcielenie , po pełnej rundzie replikacyjnej - hemimetylacja ( jedna nic ( stara) jest zmetylowana)
enzymy rozpoznają niezmetylowaną nic - nową tutaj został wstawiony błędny nukleotyd - naprawa korektorska

GATC - metylaza Dam


mut- geny kodujące białka systemu naprawy błędnie sparowanych zasad

murator- mutacja lub zmutowany gen powoduje wzrost tempa mutacji ponad poziom tła,w genach kodujących białka replikacyjne i systemów naprawczych

System mut SHL

jeżeli błędnie sparowane zasady odkształcenie helisy MUT S - rozpoznaje mismatch Mut H - rozpoznaje metyzację
MutL- łączy się z mismatch i część z chemizmetylozowaną ( łączenie Mut S i MutH) --
wydobycie energi z ATP przyłączanie endonukleaz , wycinanie odcinków nowej nici aż do odcinków mismatch

MutH- endonukleaza- przecinan nić NIEZMETYLOWANĄ , Jest ona usuwana od GATC do miejsc austerski ( 5'-3- RecJ lub egzoVII : 3'-5'- egzonukleaza I)

Heliasza UvrD, pol III DNA


naprawa bezpośrednia- fotoraktywacja
UV tymina z drugą tyminą tworzą pierścień cyklobutanu -> usunięcie , gdyż jest to przeszkoda w dostępności dla enzymów przecięcie wiązań ( FOTOLIAZA DNA ( światło 310-480 nm) - niszczy wiązania przy świetle widzialnym

przez wycinanie zasad (base 0 excision repair)
białka u E. coli
- DNA glikozydazy
- AP nukleazy ( purynowe lub apirymidowe miejsce rozpoznają miejsce bez zasady, nacinają łacuch DNA po stronie 5” od miejsca AP
- pol I DNA ( przyczepia się do wolnej nici OH, trawi starą nić)
- ligaza

naprawa pośrednia
GLIKOZYLAZA URACYLOWA ( ung E. coli)- aktywność dedykowany tylko do usuwania uracylu, przyłącza się do miejsca gdzie jest uracyl - obrót - zamiana uracylu - powrót do odpowiedniego kształtu

Przez wycięciec nukleotydów
w Ecoli
-system uvr A, B, C
-pol I
-ligaza


Np. chemicznie zmodyfikowane zasady - gr alkilowe, addukty, uszkodzenie fotochemiczne ) - zaburzenie struktury 2- rzędowej

uszkodzenie - endonukleaza wskazuje miejsce z uszkodzeniem, nacina ( niesymetryczne, obejmuje duży fragment) , helikaza rozrywa wiązania wodorowe, polimeraza syntetyzuje nowy fragment, ligaza spaja

Kompleks skanuje DNA , gdy natrafia na uszkodzenie, zmiana konformacji DNA -Uvr AB
-hydroliza ATO do uwolnienia Uvr A
-7-8 nukleotydów od str 5'
-4-5 nukleotydow od 3” ( w przypadku dimerów tymidynowych )
-Hydroliza ATP
-poli I DNA usuwa nacięta nić i syntetyzuje nową

Short - patch repair - usunięcie nisi, ok. 12 n - 99% napraw w E. coli
Long - patch repair - usunięcie ok. 1500 n ( czasem do 9000 n ) - 1 %


Kom. eukariotyczne - naprawa przez wyinanie inicjowana jest usunięciem zasady z DNA
Glikozydaza- usuwa uszkodzoną zasadę następnie liaza Otwarcie pierścienia deoksyrybozy

Glikozydaza - endonukleaza AP1- ( tnie po stroenie 5' - kompleks replikacyjny z pol delta/ epsilon - Nick translation ( 2-10n)
endonukleaza FEN 1 usuwa
Odciętą nić, ligaza 1- łączy

Short partch repair
Liaza- endonukleaza AP1 + pol Bera- usunięcie tylko 1 nukleotydu
XRCC1 / ligaza - 3 łączy

Naprawa rekombinacyjna
1. Luka w jednej nici- uszkodzenie nie zostało usunięte przed replikacją, kompleks replikacyjny „omija: to miejsc,e co w nowej nici generuje przerwę ( ang, gap)
2. ds. pęknięcia ( powstają na skutek promieniowania, skracanie telomerów lub problemów podczas replikacji )- inicjują wymianę odcinków homologicznych ( rekombinacja) lub NHEJ ( niehomologiczne łączenie końców)
Jest to naprawa postreplikacyjna


Wymiana jednej z nici - gdy an przeciw uszkodzenia po replikacji zostaje luka i 1 z nici drugiej dupleksu uzupełnia lukę ,a uszkodzenie jest usunięte

( produkty genów rec : recA, rec BC, rec F)

Rec BC - zaangażowane w restartowanie widełek replikacyjnych, RecF - w replikację przerw. Umożliwiają asocjację recA z ss- DNA

rec - rekombinacja

recA- uniwersalne białko, replikacja homologiczna ,


pęknięcie helisy ( pod wpływem promieniowania) -m naprawa przez rozszerzanie enzymow endonuklazy, wolny koniec 3” oh - atakuje zdrową helisę - parowanie , odsuwanie kawałka i zalepianie uszkadzanej helisy primer dla wypełnienia luki, inny jest matrycą dla drugiej pekniętej nici

homologiczne fragmenty- wymiana nici aby zdrowa helisa dostarczyła informacji helisie w której doszło do pęknięć



szczepy E. coli poddane dzialaniu Uv i mające defekty w naprawie przez wycinanie ( mutanty UVR- ) mutacje w genie recA- podczas replikacji akumulują fragmenty DNA o długości równej odległości między dimerami pirymidynowymi, ( letalne ). Takie mutanty nie tolerują więcej niż 1-2 dimery w całym genomie ( wt- toleruje ok. 50)

S.O.S - odpowiedz komórek E. coli na trwałe uszkodzenie DNA zagrażające jej życiu - REGULON ( nie operon)

skoordynowana indukcja wieli enzymów ( też systemów naprawczych) w odpowiedzi an uszkodzenie DNA (UV, sieciowanie, alkilacja) lub zahamowanie systenzy DNA ( głodzenie tymidowe)

LexA- represor, SOS box, sekwencje ok. 20 pz w operatorach genów tego operonu latentna proteza, gen lexA pod kontrolą 2 SOS- boxów

RecA - inducer0 aktywuje autoprotolizę lexA , ekspresja genu też pod kontrolą Lex A ( poziom podstawiwy - 1200 cząsteczek/ komórkę , po indukcji - 50 x więcej)

indukacja zatrzymanie replikacja
recA- stabilizacja, właściwości proteolityczna transkrypcja genów opuszczenie promotorów

In vitro-do aktywacji recA - ssDNA i ATP

Geny SOS:
uvrABC, uvrD - naprawa przez wycinanie
uvrB- 2 promotory , 1 pod kontrolą SOS

umuCD - błędna naprawa ( mutageneza)
recA ,lexA, rec F - naprawa postreplikacyjna
recABC - naprawa 2- niciowych pęknięć
nysfiA - filamentacja

inne procesy :

- indukacja profaga (cl)
- mutageneza kierowana ( plazmidowe mucAB - analogi umuCD)
Produkcja kolicyn

Większośc mechanizmow naprawy jest pod kontrolą SOS, koeljnośc aktywacji zależy do powinowactwa LexA od operatorow SOS. Najpierw aktywowane mechanizmy bezbłędnej naprawy.


Rec A kontroluje proteolizę
- LexA
- Cl - represor faga lambda - ( wycinanie profaga po naświetleniu UV)
- UmuD - UmuD' - terror prone repair

UmuD2UmuC - wiąże się do filamentów RecA
blisko miejsca uszkodzenia, RecA - aktywuje kompleks przez cięcie UMuD
kompleks UmuD'2UmuC ma aktywność polimerazy DNA( pol, DNA V), syntetyzuje DNA, zastępując sekwencje uszkodzoną ( w E.coli - to jedyny enzym mogący ominąć dimery pirymidynowe spowodowane przez UV lub addukty - replikacja translezyjna



Mutacje w umuC, D - UV jest letalne dla Komorek
Error prone - zaobserwowano gdy komórki E. coli naświetlone UV infekowana fagiem lambda , fagowe Dna - indukacja mutacji

odpowiedz adaptacyjna :
niskie dawki czynników alkilujących , czas potrzebny an syntezę białka ( glikozydaza 3MeA, gen alk, O6 - alkilo- guanino- alkilotransferaza )

Populacja zyskuje oporność na wyższe dawki mutagenu

EUKARIOTA:
RAD- drożdze- mtacje w tych genach - wrażliwość an promieniowanie, Rad 51- homolog recA
XP - Xeroderma pigmentosum - choroba u ludzi spowodowana mutacjami w genach systemu naprawy przez wycinanie ( geny XP-A - XPG, holowi RAD u drożdzy)
Dimery pirymidynowe ( i in. Uszkodzenia) nie sa wycinane. Choroa recesywna ( GL. Skóry) - nadwrażliwość na światło słonczen ( UV)

Ludzki system naprawy przez wycinanie do kompleks XP bialek i TFII H
Preferencyjnie naprawiane są geny


Kompleks transkrybujący
czynniki TFIIH - aktywność kinazy, wymiana podjednostek na kinazy naprawcze

Non - homologus end joining - ( NHEJ)- dominije w organizmach wielokomrkówych, hdy ds. break ( promieniowanie jonizujące, leki - bleomycyna) , naprawa przez łączenie końców

białka KU80/KU 70- wiązanie się na końcach uszkodzeń ,aktywnośc helikazy, rozpoznawany przez kinazę proteinazę zależną od DNA - PK-DNA ( sama z siebie nie ma aktywności kinazy )

Ku - heterodimer , rozpoznaje końca pęknieć, wiąże je
DNA- PK- aktywowana przez DNA , fosforyzuje m.in. Artemis ( EGZONUKLEAZA- przycina wystające końce )
Pol DNA- uzupełnia luki

Ligacja - ligaza IV + XRCC4
Trimming - Artemis + DNA- PK

Pol DNA - uzupełnia braki

Przykłady chorób spowodowanych mutacjami w genach białek systemów naprawczych
- Blooms' syndrom - mutacja w genie helikazy ( BLM), homoga rec. Q z E. coli, zwiększona czestość pęknięć chromosomów i wymiany odcinków DNA pomiędzy siostrzanymi chromatydami. BLM asocjuje z unnymi białkami, m.in. hMLH1 ( homolog MutL)
- nihmehan breakage syndrom - mutacja w genie kodującycm Nibrin ( p95, NBS1) 0 w reperacji pęknięć ds., Promieniowanie- ds. pęknięcia - kinaza ATM - NBS1 - aktywacja kompleksu wiążącego się z pęknięciami - włączanie punktu kontrolnego i na prawy


Mutacje mutatorowe

/………………../

ONKOGENEZA
choroba nowotworowa jest chorobą genetyczną
podstawą kancerogenezy są zaburzenia funkcji genów
Zmiany w genomie: mutacje somatyczne + niestabilność genetyczna ( zmiany w liczbie kopii genów

nowotwory - skutek wielu niezależnych zmian. Zdarzeń ( 4-10)
proces wieloetapowy - wzrasta pod koniec życia,
choroby powstają na proces mutacji <>

Selekcja mutacji, które dają określone cechy, tu : możliwości nieograniczonego, ekspansywnego i agresywnego wzrostu

1. inicjacja - mutacja w 1 lub większej liczbie genów, których produkty kontrolują kluczowe szlaki regulujące procesów komórkowych

musi działać kancerogen - mutagen ( np., związki tworzące addukty,)

2. etap promocji - akumulacja uszkodzeń, tworzenia klonów komórek zmienionych

podziały preferencyjne, ekspozycja na czynniki: hormony i czynniki wzrostu ( częste podziały komórkowe) zła dieta, otyłość napędzanie cyklu komórkowego

czynniki hamujące - karotenoidy
bakterie w jelitach - produkcja kwasu mrówkowego

im szybsze podziały - tym szybciej akumuluje zmiany w DNA

3. progresja
enzymy reparacyjne, działanie systemu immunologicznego lecz komórki produkują czynniki wzrostu naczyń krwionośnych produkcja metaloproteinazy odrywanie się do macierzy METASTAZA |
kom rakowe są odporne na sygnały kontrolowanej śmierci


Komórki nowotworowe :
- wzrost niezależny od czynników zrostu

- niewrażliwość na sygnały ograniczające proliferację
- upośledzony program samobójczej śmierci
- zdolność do nieograniczonej liczby podziałów
- angiogenzeza - unaczynienie
- inwazja sąsiednich tkanek i przeżuty

---