Ćwiczenie nr 6.

Analiza aminokwasów.

Aminokwasy są jednostkami strukturalnymi peptydów i białek. W swojej cząsteczce mają co najmniej 2 grupy funkcyjne: grupę aminową NH₂ i grupę karboksylową COOH. Wzór ogólny aminokwasów to:

W obrębie ugrupowania R mogą występować inne grupy funkcyjne jak: OH, SH, Ar, NH₂, COOH albo ugrupowania heterocykliczne.

W białkach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego występuje powszechnie 20
α-aminokwasów.

W środowisku organizmów żywych (pH ok. 7,4 - 7,1) aminokwasy występują w postaci jonu obojnaczego:

W roztworach wodnych aminokwasy występują w 99,9 % w postaci zjonizowanej. W zależności od pH środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy lub zasadowy.

Punktem izoelektrycznym pI nazywamy takie pH, przy którym cząsteczki aminokwasu występują w formie jonu obojnaczego. Jon obojnaczy aminokwasu - amfolit - jest formą amfoteryczną, bo proton może być przyłączony do grupy karboksylowej, jak i oddysocjowany od uprotonowanej grupy aminowej. Ładunek sumaryczny amfolitu jest równy zeru. Proton może ulegać przyłączeniu lub odłączeniu od grup karboksylowych i aminowych związanych z węglem α, jak i od dodatkowych grup funkcyjnych.

Ćwiczenie praktyczne

Cel ćwiczenia: zapoznanie się z reakcjami charakterystycznymi aminokwasów.

1. Reakcja ninhydrynowa.

Zasada: Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do aldehydów z jednoczesną dekarboksylacją, a potem deaminacją. Powstały amoniak daje z ninhydryną barwny związek - fioletowo-niebieski produkt zwany purpurą Ruhemanna.

Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia α-aminokwasów, dlatego reakcja ninhydrynowa stanowi podstawę metody kolorymetrycznej, ilościowego oznaczenia wolnych α-aminokwasów.

Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę α-aminową, np. sole amonowe, aminocukry, amoniak, aminy I-rzędowe, peptydy i białka po hydrolizie.

Reakcja aminokwasów z ninhydryną stanowi podstawę metod gazometrycznych ilościowego oznaczania aminokwasów na podstawie ilości wydzielonego CO₂ lub NH₃.

Aminokwasy takie jak prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy α-aminowej, dają w reakcji z ninhydryną produkt o barwie żółtej.

Sprzęt i odczynniki:

• probówki szklane

• łaźnia wodna

• 1% wodne roztwory aminokwasów: glicyny, proliny

• 0,1% roztwór ninhydryny w 50% etanolu

Wykonanie:

1. odmierzyć do probówek po 1 cm³ roztworów aminokwasów: glicyny i proliny

2. do probówek dodać po 0,5 cm³ etanolowego roztworu ninhydryny

3. próby ogrzać do wrzenia we wrzącej łaźni wodnej

4. zaobserwować pojawienie się charakterystycznego zabarwienia.

2. Reakcja ksantoproteinowa.

Zasada: Aminokwasy aromatyczne (tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan) ulegają reakcji nitrowania. Reakcja ta zachodzi dla aminokwasów wolnych jak i związanych w białku. Czynnikiem nitrującym jest jon nitroniowy NO₂⁺ , powstający w wyniku katalitycznego uprotonowania kwasu azotowego kwasem siarkowym, a następnie odszczepienia cząsteczki wody. Mieszanina nitrująca, zawierająca stężone kwasy azotowy i siarkowy (w stosunku objętościowym 1:3) nitruje wszystkie aminokwasy, natomiast stężony kwas azotowy ma zdolność nitrowania związków zawierających aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz fenyloalaninę. Produkty reakcji nitrowania mają barwę żółtą. Alkalizacja roztworu prowadzi do otrzymywania soli sodowych charakteryzujących się barwą pogłębioną, aż do żółto-pomarańczowej.

Sprzęt i odczynniki:

• probówki szklane

• łaźnia wodna

• 1% roztwory aminokwasów: tyrozyny i tryptofanu w 0,1 M HCl

• 1% wodny roztwór glicyny

• 1% wodny roztwór albuminy

• stężony kwas azotowy (V)

• 10% roztwór NaOH

Wykonanie:

1. do probówek odmierzyć po 1 cm³ roztworów: tyrozyny, tryptofanu, glicyny i białka albuminy

2. do wszystkich probówek dodać pipetą pasterowską po 1 cm³ stężonego kwasu azotowego (V) (pod dygestorium)

3. 5 minut ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej

4. probówki oziębić pod bieżącą wodą i dodać po 4 cm³ 20% roztworu NaOH (reakcja silnie egzotermiczna)

5. zaobserwować, w których probówkach roztwór zabarwi się na kolor żółto-pomarańczowy

3. Wykrywanie grup tiolowych.

Grupy tiolowe -SH obecne w aminokwasach wolnych i związanych w białkach reagują z nitroprusydkiem sodu. Reakcja zachodzi w środowisku amoniakalnym, a otrzymany związek kompleksowy charakteryzuje się barwą czerwono-fiołkową.

Sprzęt i odczynniki:

• probówki szklane

• 0,1% świeże roztwory aminokwasów: cysteiny i cystyny w 0,1 M HCl

• 1% wodny roztwór albuminy

• stężony NH₃ aq.

• 1% wodny roztwór nitroprusydku sodu Na₂[Fe(CN)₅NO]

• siarczan amonu in subst.

Wykonanie:

1. do 3 probówek odmierzyć po 1 cm³ roztworów: cysteiny, cystyny i albuminy

2. do wszystkich probówek dodać po 1 ml 1% roztworu nitroprusydku sodu, a następnie siarczanu amonu in subst. do nasycenia roztworu

3. zalkalizować próby, dodając pipetą pasterowską ok. 1-2 ml amoniaku (pod dygestorium)

4. pojawienie się czerwono-fiołkowego zabarwienia prób oznacza dodatni wynik na obecność grup tiolowych.

4. Deaminacja aminokwasów kwasem azotowym (III).

Zasada: Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się wg reakcji pierwszej - in statu nascendi, ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas.

Reakcja nr 1:

Deaminacja α-aminokwasu przebiega zgodnie z drugą reakcją, przedstawioną poniżej:

Reakcja nr 2:

Reakcja ta jest podstawą w gazometrycznej metodzie ilościowego oznaczania
α-aminokwasów metodą van Slyke'a.

Sprzęt i odczynniki:

• probówki szklane

• łaźnia wodna

• 10 % roztwór NaNO₂

• 2M roztwór CH₃COOH

• 1% wodny roztwór glicyny

Wykonanie:

1. w probówce zmieszać 1ml NaNO₂ z 1 ml roztworu CH₃COOH

2. 1 minutę ogrzewać w łaźni wodnej, odczekać, aż zmniejszy się wydzielanie gazu o żółtej barwie (tlenki azotu), po czym dopiero dodać do probówki 2 ml roztworu glicyny

3. trzymając probówkę w drewnianej łapie wytrząsać i obserwować wydzielanie się azotu - produktu gazowej reakcji deaminacji.

5. Wykrywanie pierścienia indolowego w tryptofanie.

Zasada: W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem glioksalowym lub aldehydem mrówkowym dając barwne produkty kondensacji.

Sprzęt i odczynniki:

• probówki szklane

• łaźnia wodna

• 1% roztwór tryptofanu w 0,1 M HCl

• 1% wodny roztwór glicyny

• 1% wodny roztwór albuminy

• 40% roztwór aldehydu mrówkowego (formalina)

• stężony H₂SO₄

Wykonanie:

1. do trzech probówek odmierzyć kolejno po 1 ml roztworów: tryptofanu, glicyny, albuminy

2. do wszystkich probówek dodać 0,5 ml formaliny i wymieszać

3. do każdej probówki dodać powoli pipetą pasterowską - po ściance lekko pochylonej probówki - 1ml stężonego H₂SO₄. Nie należy jej wstrząsać!

4. ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej

5. pojawienie się ciemnoczerwono-brunatnego pierścienia na granicy faz oznacza dodatni wynik na obecność tryptofanu

6. Reakcja biuretowa.

Zasada: Biuret (dimocznik, H₂N-CO-NH-CO-NH₂ ) tworzy w środowisku zasadowym fioletowy kompleks z solami miedzi (II). Reakcja ta jest charakterystyczna dla związków zawierających więcej niż jedno wiązanie peptydowe w cząsteczce (peptydy i białka).

Biuret, dimocznik.

Sprzęt i odczynniki:

• probówki szklane

• palnik gazowy

• łaźnia wodna

• 1% wodny roztwór albuminy

• 1% wodny roztwór glicyny

• 20% roztwór NaOH

• 0,25 M roztwór CuSO₄

• mocznik

Wykonanie:

1. do suchej probówki nr 1 wsypać szczyptę mocznika, ogrzać nad palnikiem gazowym. Mocznik topi się, a następnie rozkłada. Po skrzepnięciu otrzymanej masy probówkę należy ochłodzić i dodać około 1 ml wody destylowanej. Poczekać aż skrzepnięta masa się rozpuści.

2. do kolejnych dwóch probówek dodać po 1 ml roztworów: albuminy oraz glicyny

3. do roztworów: biuretu (probówka nr 1), albuminy i glicyny dodać po 1 ml roztworu NaOH, wymieszać starannie

4. wkraplać wodny roztwór siarczanu miedzi (II), w wyniku czego powstaje związek kompleksowy o fioletowym zabarwieniu.

Literatura:

• J. Bober, B. Dołęgowska „ Ćwiczenia z chemii” dla studentów I roku Pomorskiej Akademii Medycznej, Wydawnictwo Akademii Medycznej w Szczecinie, 2009

• I. Żak „ Praktikum z chemii medycznej” Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001

• E. Białecka Florjańczyk, J. Włostowska „Chemia organiczna”, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2007

• J. Bojarski „ Chemia organiczna” Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2006

• M. J. Korohoda, J. R. Paśko „Ćwiczenia z analizy i preparatyki organicznej” Wydawnictwo Naukowe Akademii Pedagogicznej, Kraków2005

---