Wojciech Kluźniak Szczecin, dnia 18-01-10

Grupa 2b/ rok IV/ Biotechnologia

Ćwiczenie laboratoryjne nr 2

Konspekt

Temat: Wytrawianie produktów reakcji nested-PCR z żeli agarozowych (2%) - zestaw Gel-Out (A&A Biotechnology) i prowadzenie reakcji nested-PCR z zastosowaniem starterów B i NSP. Amplifikacja prowadzona była dla dwóch różnych rodzajów matryc DNA.

Cel ćwiczeń: Określenie występowania mutacji punktowych przy zastosowaniu techniki nested-PCR i następnym rozdziale badanych prób na żelu agarozowym w procesie elektroforezy.

Istota zastosowanej metody badawczej: Metoda ta polega na amplifikacji mniejszego odcinka DNA, zawartego w obrębie wcześniej amplifikowanego dłuższego fragmentu Oczywiście w tej drugiej reakcji stosowane są inne startery. Za pomocą tej metody możemy także zwiększyć czułość reakcji, dzięki dodatkowej amplifikacji produktów wcześniejszej reakcji. Stosowana jest w przypadku braku pewności, że zamplifikowany został właściwy fragment DNA. Metoda ta polega na zastosowaniu wewnętrznej pary primerów w stosunku do preegzystującego produktu amplifikacji (dwuetapowa amplifikacja).

Produkt tej reakcji może być stosowany jako:

1. sonda molekularna w hybrydyzacji,

2. kontrola specyficzności amplifikacji matrycy.

Amplifikacje PCR badanych materiałów przeprowadzono w oparciu o niżej zamieszczony protokół - skład mieszaniny reakcyjnej.

Matryca DNA:

1. OT-1-3

2. 153/79xOT1-3

3. 153

4. OT 0-6

5. OT-0-6xOT1-3

6. OT-1-3

	x1 [μl]	x7 [μl]
H2O	10,3	72,1
10x bufor	2,5	17,5
MgCl2	2,0	14
dNTPs	2,5	17,5
Starter A	2,5	17,5
Starter B	2,5	17,5
DNA	2,0	14
Taq Pol	0,7	4,9
suma	25	175

Elektroforeza produktów PCR i krótkie omówienie wyników analiz:

Przed przystąpieniem do etapu amplifikacji z 2% żelu agarozowego należy wyciąć 2 prążki-produkty poprzedniej reakcji PCR przy użyciu zestawu Gel-Out firmy A&A Biotechnology.




Reakcja nested (startery B i NSP) - układ matryc 6 (produkty PCR) + 2 („z prążka”)







Warunki reakcji:

• układ matryc 6 (produkty PCR) + 2 („z prążka”)

• 2% żel agarozowy,

• 1X TBE,

• czas trwania elektroforezy - 1:45 h

Podsumowanie/Wnioski

Metoda nested- PCR służy do identyfikacji mutacji punktowych, jednakże po uzyskaniu produktów i rozdziale ich w procesie elektroforezy agarozowej, nie zauważyliśmy żadnych specyficznych prążków, które mogły by wskazywać na występowanie jakichkolwiek mutacji.


---