TERAPIA GENOWA

- leczenie przyczyn, a nie objawów

- wprowadzanie genu terapeutycznego lub oligonukloetydu

gen terapeutyczny ---> wirusowy DNA ---> w kompleksie lub nagi DNA

---> plazmidowy DNA ---> zrekombinowany DNA

- germinalna: eliminacja defektu genetycznego w komórkach rozrodczych lub we wczesnym okresie zarodkowym (zakazana ze wzgl. moralnych)

- somatyczna: pierwotny efekt nie jest usuwany, lecz ma charakter zachowawczy

Za pomocą terapii można:

- uzyskać przywrócenie lub wzmocnienie utraconej w pełni lub częściowo funkcji zmutowanego genu

- uzyskać supresję działania takiego genu, którego produkt zmieniony w wyniku mutacji jest odpowiedzialny za wystąpienie choroby

Przywrócenie utraconej funkcji genu polega na uzyskaniu ekspresji wprowadzanego „funkcjonalnego” genu w ściśle określonej tkance.

Gen funkcjonalny = gen pozbawiony intronów (same eksony), jest to cDNA

Efekt celowania można osiągnąć:

- zaopatrująć wprowadzany gen w odpowiedni system regulacji

- wprowadzając prawidłowy gen bezpośr. do tkanki, w której ma ulec ekspresji

Gen musi się utrzymać w komórce jak najdłużej (bo czas ekspresji zależy od długości życia komórki), przy czym stopień ekspresji zależy od ilości produkowanewgo białka (kodowanego przez ten gen funkcjonalny)

Terapeutyczny gen, uzyskiwany efekt:

>> kompensacja defektu genetycznego

>> eliminacja „złych” komórek

>> nowe cechy fenotypowe

>> hamowanie ekspresji zmutowanego genu

Terapię genową zastosowano po raz pierwszy 14.09.1990 o 8:59, była to kompensacja niedoboru ADA

Kompensacja defektu genetycznego

- metodę stosuje się najczęściej w mutacjach recesywnych

- nie usuwa się defektu, lecz kompensuje jego skutki biologiczne

- np. geny kodujące globiny, czynniki krzepnięcia, deaminazę adenozynową

1. wielkość genu (do kilka tys. par zasad)

2. wydajność transferu genu do komórek docelowych- konieczne jest zainfekowanie jak największej ilości komórek

3. przypadkowa losowa integracja transgenu z genomem komórki- mutacje insercyjne

4. czas utrzymywania się transgenu w kom.docelowych

5. wektory- najlepiej wysokowydajne, łatwe w stosowaniu i bezpieczne

1. przygotowanie geny (wycięcie intronów)

2. przygotowanie wektora

3. wybór i przygotowanie kom.docelowych

Sposoby wprowadzania transgenu:

np. domięśniowo, doguzowo, dożylnie, czyli bezpośr. do organizmu

wykorzystuje się tu swoistość transdukcyjną, tj.:

- naturalny tropizm wirusów do konkretnych tkanek (np. neurotropizm wirusa opryszczki)

- za pomocą nośników z odpowiednimi ligandami, które rozpoznają swoiste receptory (np. ligand asjaloorozomukoidu --> hepatocyty)

- pobranie komórek od pacjenta

- hodowla i modyfikacja genetyczna

- wprowadzenie z powrotem do organizmu pacjenta

ważne jest, żeby transgeny wprowadzać do określonych komórek, z pominięciem komórek rozrodczych

Wybór komórek docelowych zależy od typu schorzenia (np. nabłonek oddechowy w mukowiscydozie). Nie zawsze trzeba wprowadzać transgen do „chorej” tkanki (np. w hemofilii transgen jest wprowadzany do mięśni. Mięśnie zaczynają produkować czynnik krzepnięcia i uwalniają go do krwioobiegu).

Hamowanie ekspresji zmutowanego genu

- w mutacjach dominujących

- ekspresję genu hamuje się na poziomie transkrypcji lub translacji, za pomocą antysensów

ANTYSENSY = oligonukleotydy (20-30 par zasad, deoksyrybo- lub rybonukleotydy), których sekwencja jest komplementarna do mRNA lub do sekwencji DNA genomu lub jego promotora.

Antysensy hybrydyzując z:

- mRNA tworzą duplexy; duplex uniemożliwia połączenie się mRNA z rybosomem

- promotorem uniemożliwiają replikację

- DNA tworzą triplexy; do triplexów nie mogą przyłączyć się czynniki transkrypcji, uniemożliwiając transkrypcję

Skuteczność terapii antysensami zależy od:

>> stabilności antysensów

>> ich ilości w komórce

>> metod wprowadzenia antysensów do komórki

Korekta zmutowanego genu

- zarówno choroby dominujące, jak i recesywne

- korekta jest trwałą, a wielkość genu nie ma znaczenia

Do naprawy wykorzystuje się oligonukleotydy, rybozymy i oligonukleotydy chimeryczne (tj. zbudowane z deoksyrybo- i rybonukleotydów na raz).

Udział w procesie biorą:

- enzymy naprawiające błędne sparowania

- enzymy wycinające nukleotydy

- enzymy biorące udział w homologicznej rekombinacji

- powstawanie dodatkowych mutacji

- niska wydajność procesu

Eliminacja „złych” komórek

- zastosowanie w nowotworach i HIV

Zabijanie komórek nowotworowych:

1. bezpośr.: gen kodujący toxyczne białko jest wprowadzany do komórki nowotworowej i ulega ekspresji (tylko tam!), zabijając komórkę

>> geny samobójcze: kodują białka, które przekształcają podawany i.v. prolek do tox. metabolitów, zabijających komórkę

>> geny proapoptyczne: indukują apoptozę

2. pośr.: uaktywanienie komórek immunologicznych do swoistego zabijania komórek nowotworowych

Modyfikacja genetyczna komórek -> nadawanie nowych cech fenotypowych

>> geny kodujące białka aktywujące komórki ukł.immuno. (geny immunomodulacyjne)

>> geny kodujące czynniki proangiogenne (do terapeutycznej angiogenezy w chorobach niedokrwiennych)

>> geny kodujące czynniki antyangiogenne (np. angiostatyna, do terapii nowotworów)

>> geny wielolekowej oporności MDR (transfer do szpiku pozwala osłonić komórki prawidłowe przed działaniem cytostatyków, stosowanych w nowotworach)

>> szczepionki DNA (wprowadza się in vivo wektora kodującego antygen i wywołuje oporność)

>> szczepionki RNA (wprowadza się samoreplikujące się wirusy RNA, które zawierają geny kodujące antygeny )

PODSUMOWANIE STRATEGII

- zmiana „złośliwego” fenotypu

- protekcja komórek prawidłowych

- eliminacja komórek nowotworowych

- hamowanie ekspresji zmutowanych genów

Choroby monogenowe AD:

- hamowanie ekspresji zmutowanych genów

Choroby monogenowe AR:

- kompensacja defektu

- eliminacja zainfekowanych komórek

- hamowanie ekspresji genów wirusowych

Wektor = nośnik, do którego można wstawić DNA

Wektor ekspresyjny = wektor umożliwiający wydajną transkrypcję wbudowanego do niego transgenu

Wektory niewirusowe = kompleksy (liposomy kationowe lub związki polikationowe + palzmidowy DNA)

Transdukcja = do transferu użyto wektora wirusowego

Transfekcja = do transferu użyto wektora niewirusowego

Najczęściej używane wirusy:

- AAV (wirusy towarzyszące adenowirusom)